Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi Utero olarak Elektroporasyon

Bu prosedürün genel amacı, ilgilenilen bir genin işlevini aktive etmek veya bastırmak için uteroda gelişen fare embriyolarının hipotalamusuna plazma DNA'sını transfekte etmektir. Bu, önce hamile farenin uyuşturulması ve uterusun laparotomi yoluyla açığa çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, DNA çözeltisini embriyonik beynin üçüncü ventrikülüne enjekte etmektir.

Daha sonra, pozitif elektrot uterusun içine plasenta ve embriyonik kafa arasına yerleştirilir. Negatif elektrot dış rahim yüzeyine yerleştirilir ve elektrik darbeleri uygulanır. Son adım, transfekte edilmiş embriyonik beyinleri altı gün sonra çıkarmaktır.

Sonuç olarak, floresan mikroskobu, transfekte edilmiş hücrelerin fenotipik değişikliklerini, sayısını, şeklini, pozisyonunu, işaretleyici ifadesini vb. analiz etmek için kullanılır. Bu tekniğin viral transfeksiyon gibi mevcut yöntemlere göre en önemli avantajları, birincisi, özel önlemler gerektirmemesi ve iki tesis olarak belirli bir bölgenin ikinci olarak hedeflenmesinin mümkün olmasıdır. Üçüncüsü, Ute elektroporasyonu ile aday genlerin taranması daha hızlıdır.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir, çünkü DNA solüsyonunu üçüncü ventriküle enjekte etmek ve iğne elektrodunu düzgün bir şekilde yerleştirmek, biraz deneyimle birlikte gelişmiş manuel çarpıklık gerektirir. Bu yöntem, hipotalamik gelişim alanındaki, özellikle hücre göçü ile ilgili olanların yanı sıra bireysel bölgelerin ve çekirdeğin genetik olarak nasıl belirlendiği ile ilgili soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedüre, amniyotik sıvı kaybı nedeniyle başlangıçtaki yüksek düşük oranını azaltmak için gerekli olan bazı kaliteli cam mikro pipetleri çekerek başlayın.

DNA'yı hazırlamak için, saflaştırılmış endotoksin içermeyen plazma DNA'sını% 0.1 hızlı yeşil içeren PBS'de mikrolitre başına bir ila iki mikrogramlık bir nihai konsantrasyona çözün. Hızlı yeşil, enjekte edilen çözeltiyi embriyonik beyin ventrikülünde görünür hale getirecektir. Ardından, 10 mikrolitre DNA solüsyonunu cam mikro pipete yükleyin.

Daha sonra cam mikro pipeti enjeksiyon sistemine veya bir ağız pipetine bağlayın. Bu adımda, ameliyat masasını bir ısıtma yastığı ile hazırlayın ve cerrahi aletler Embriyoların görselleştirilmesini kolaylaştırmak için soğuk ışık kaynaklarını açın. Daha sonra cerrahi aletleri bir cam boncuk sterilizatörü kullanarak dezenfekte edin.

Daha sonra, hamile bir fareyi flor ile uyuşturun. Fare uyuşturulduktan sonra, kurumasını önlemek için gözlerine merhem sürün. Daha sonra anesteziyi sürekli olarak sürdürmek için maskeyi yüzüne yerleştirin.

Şimdi fareyi göbeği yukarı bakacak şekilde bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin. Dört uzvunu bantla sabitleyerek vücudunu yerine sabitleyin. Reflü için kuyruğunu sıkıştırarak farenin tamamen uyuşturulduğundan emin olun.

Daha sonra karın yüzeyini tıraş edin ve iyot çözeltisi ile dezenfekte edin. Karın derisi üzerinde yaklaşık bir ila bir buçuk santimetre uzunluğunda uzunlamasına bir kesi yapın. Daha sonra zarı kesin.

Daha sonra kesiğin etrafına pamuklu gazlı bez yerleştirin. Gazlı bezi PBS ile durulayın. Bir rahim boynuzunu künt forseps ile dikkatlice çekerek ortaya çıkarın.

Myometriumu veya uterusu sıkıca çekmekten kaçının. Rahim içindeki yüksek basınç, enjeksiyon üzerine embriyo sıvı kaybı olasılığını artıracağından kürtajla sonuçlanacaktır. Daha sonra uterus boynuzunu PBS ile durulanmış bir gazlı bez üzerine yerleştirin ve nemli tutmak için birkaç dakikada bir PBS ile durulayın.

Şimdi, mikroskop altında, rahmi beyin ventrikülleri görüntülenebilecek şekilde tutun. Olumsuz bir pozisyonda yatan embriyoyu kapsamlı bir şekilde yeniden konumlandırmayın. Bu sadece kürtaj şansını artırır.

Sol ve sağ kortikal hemisferler arasındaki çatlağın bulunduğu boşluğu bulmak için embriyonun kafasına yukarıdan bakın. Yarım kürelerin ayırt edilmesi kolaydır ve içlerindeki yan ventriküller genellikle biraz daha koyu şekiller olarak algılanabilir. Bir embriyonun DNA enjeksiyonu için mükemmel bir şekilde yönlendirildiği tespit edilirse, rahim duvarını delmek ve aynı anda üçüncü ventriküle girmek mümkündür.

Daha önce hazırlanan DNA'nın bulunduğu cam mikro pipeti 45 derecede uterus duvarına tutun ve interhemisferik fissürün rostral ucundan yaklaşık bir milimetre derinliğe kadar nüfuz ederek delin. Bu şekilde, cam mikro pipetin ucu yan ventriküle değil, beynin üçüncü ventrikülüne girecektir. Üçüncü ventriküle yaklaşık bir mikrolitre DNA çözeltisi enjekte ettikten sonra, yeşil sıvı ventrikülü iyi bir enjeksiyonla dolduracak, aynı uterus boynuzunun tüm embriyoları ile aynı işlemi tekrarlayacaktır.

Bu, DNA çözeltisinin ventriküler sıvı ile eşit şekilde karışması ve tüm nöro epitele ulaşması için biraz zaman tanıyacaktır. Şimdi elektro perteri açın ve ayarları embriyonik yaşa göre ayarlayın. Pozitif kutup olarak paslanmaz çelik iğne elektrodu ve negatif kutup olarak yuvarlak düz elektrodu kullanın, elektroporasyon için embriyoları sırt tarafı yukarı bakacak şekilde seçin.

Daha sonra embriyonun başının yanındaki rahim duvarını, amniyotik kese ile plasenta arasında, iğne elektrodunun ucunu içinden aşağı doğru iterek delin. Ardından diğer elinizin işaret parmağını itme bloğu olarak kullanın. Elektrot ucunun yaklaşık beş milimetresi amniyotik kese ile rahim duvarı arasında, yaklaşık olarak orta beyin seviyesinde olmalıdır.

Bu hedefleme elektrodu olduğundan, konumu hipotalamik nöro epitelin hangi kısmının Transfekte edilme olasılığının en yüksek olduğunu belirleyecektir. Daha sonra, yuvarlak düz elektrodu diğer elinizle embriyonun başının karşı tarafındaki rahim duvarının dışına yerleştirin. Daha sonra embriyoyu elektrotlar arasında yavaşça sıkın.

Voltaj uygulamak için pedal anahtarını kullanın. Bundan sonra, diğer elinizin işaret parmağı ile rahmi geri tutarken iğne elektrodunu yavaşça uterustan dışarı çekin. Delinmiş duvardan amniyotik sıvı kaybolursa, genellikle embriyo kürtaj yapar.

Tüm embriyoların enjeksiyonu ve elektroporasyonundan sonra, uterusu farenin karnına çok dikkatli bir şekilde yerleştirin ve tam olarak daha önce olduğu gibi konumlandırın. Daha sonra periton boşluğunu kapatmadan önce tuzlu su ile nemlendirin. Peritonu cerrahi kedi bağırsağı ile dikin, ardından cildi daha dirençli bir dikişle dikin.

Karın yüzeyini iyot çözeltisi ile dezenfekte edin ve ağrıyı gidermek için deri altına steroid olmayan bir antienflamatuar enjekte edin. Daha sonra, anneyi anestezik makinesinden çıkarın ve bir ısıtma yastığı ile ısıtılan bir kafese yerleştirin. Fareyi anesteziden tamamen iyileşene kadar izleyin ve herhangi bir enfeksiyon veya ağrı belirtisi olmadan prosedürden kurtulduğundan emin olmak için günlük olarak kontrol edin.

Bu adımda, embriyoları veya doğum sonralarını istenen analiz gününe göre hasat edin. DNA enjekte edilen ve elektropore edilen embriyoları seçin ve bu stereo mikroskop altında beyinleri inceleyin. Ardından uygun bölgede yeşil floresan sinyali olup olmadığını kontrol edin.

Seçilen embriyonun beynini analiz etmek için, dokuyu kısa bir süreliğine% 4 paraldehitte sabitleyin. Daha sonra, aros % 4 veya jelatin albümin içine gömün. Sonra beyni vibrato üzerinde bölümlere ayırın.

Bu rakamlar, E 12.5'te floresan raportör genleri, GFP veya CFP'yi taşıyan plazma DNA'sının utero transfeksiyonundan sonra hipotalamusu göstermektedir. Bu, rostraldan coddle'a transfekte edilmiş bir hipotalamusu gösteren sagital bir bölümdür ve burada, medya lateral ekseni boyunca farklı seviyelerde etiketlenmiş hücrelerin bulunduğu enine kesit yer almaktadır. Bu sagital kesit, spesifik olarak transfekte edilmiş bir memeli gövdesini ve karakteristik aksonal ağacının etiketlenmesini gösterir ve bu enine kesitin elektro geçit tarafında, E 12.5'te doğan nöronlara karşılık gelen etiketli bir bant gösterir.

Bölümleri daha yakından analiz etmek için. Memeli girintisinden çıkan radyal glial süreçlerin düzlemine paralel yatay kesitler hazırlandı. E 12.5 gününde transfekte edilen nöro epitelden doğan ambi O nöronları, GFP'ye karşı antikorlar vasıtasıyla E 18.5 gününde tanımlandı.

Bu örnekte, antikor sınırlı bir MBO hücresi grubunu etiketledi. Bu grup, E 12.5'ten önce ve sonra doğan MBO nöronlarına karşılık gelen iki etiketlenmemiş lateral ve medial MBO alanı ve nestona karşı bir antikorla ko-boyama arasında yer aldı. Kırmızı, nöro epitelin radyal glial süreçleri üzerinde ayrı ayrı etiketlenmiş nöronların göç modunu gösterir Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 30 dakika içinde yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, DNA'nın üçüncü ventriküle nasıl enjekte edileceğini ve hipotalamusu etkili bir şekilde hedeflemek için iğneyi embriyo, baş ve plasenta arasında pozitif elektrot olarak nasıl konumlandıracağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü takiben. Transfekte edilen nöronların fenotipi hakkında ek soruları yanıtlamak için immünohistokimya veya inid hibridizasyon gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.