Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, ilgilenilen bir genin fonksiyonunu aktive etmek veya baskılamak için, uteroda gelişen fare embriyolarının hipotalamusuna plazmid DNA transfekte etmektir. Bu işlem, öncelikle gebe farenin anesteziye alınması ve laparotomi yoluyla uterusun açığa çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, DNA çözeltisinin embriyonik beynin üçüncü ventrikülüne enjekte edilmesidir.

Ardından, pozitif elektrot uterus içinde, plasenta ile embriyonik baş arasına yerleştirilir. Negatif elektrot dış uterus yüzeyine yerleştirilir ve elektrik darbeleri uygulanır. Son adım, altı gün sonra transfekte edilmiş embriyonik beyinlerin çıkarılmasıdır.

Sonuç olarak, transfekte edilen hücrelerin sayı, şekil, konum, marker ekspresyonu ve benzeri fenotipik değişimlerini analiz etmek için floresan mikroskobu kullanılır. Bu tekniğin viral transfeksiyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları; ilk olarak özel önlemler gerektirmemesi ve iki tesis gerektirmemesi, ikincisi spesifik bir bölgenin hedeflenmesinin mümkün olması ve üçüncüsü, Ute elektroporasyon ile aday genlerin taranmasının daha hızlı olmasıdır.

Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayacaklardır; çünkü DNA solüsyonunun üçüncü ventriküle enjekte edilmesi ve iğne elektrodun doğru şekilde konumlandırılması, gelişmiş bir manuel becerinin yanı sıra deneyim gerektirir. Bu yöntem, hipotalamik gelişim alanındaki soruların, özellikle hücre migrasyonu ile ilgili olanların yanı sıra, münferit bölgelerin ve çekirdeklerin genetik olarak nasıl belirlendiğinin yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Amniyotik sıvı kaybına bağlı olarak meydana gelen başlangıçtaki yüksek abort oranını azaltmak için kritik öneme sahip olan yüksek kaliteli cam mikropipetleri çekerek bu prosedüre başlayın.

DNA hazırlamak için, saflaştırılmış endotoksin içermeyen plazma DNA'sını, %0,1 fast green içeren PBS içinde mikrolitre başına bir ila iki mikrogram nihai konsantrasyona gelecek şekilde çözün. Fast green, enjekte edilen çözeltinin embriyonik beyin ventrikülünde görünür olmasını sağlayacaktır. Ardından, cam mikro pipete 10 µL DNA çözeltisi yükleyin.

Ardından cam mikro pipeti enjeksiyon sistemine veya bir ağız pipetine bağlayın. Bu adımda, cerrahi masayı bir ısıtma pedi ve cerrahi aletlerle hazırlayın. Embriyoların görselleştirilmesini kolaylaştırmak için soğuk ışık kaynaklarını açın. Daha sonra cerrahi aletleri bir cam boncuk sterilizatörü kullanarak dezenfekte edin.

Ardından, gebe bir fareyi izofloran ile anestezi edin. Fare anestezi edildikten sonra, kurumayı önlemek için gözlerine merhem uygulayın. Daha sonra, anestezinin sürekli devam etmesini sağlamak için yüzüne maskeyi yerleştirin.

Şimdi fareyi karnı yukarı bakacak şekilde bir ısıtma pedinin üzerine yerleştirin. Dört uzvunu bantla sabitleyerek gövdesini yerinde tutun. Kuyruğunu sıkarak refleks kontrolü yapın ve farenin tamamen anestezi altında olduğundan emin olun.

Ardından karın yüzeyini tıraş edin ve iyot çözeltisi ile dezenfekte edin. Karın derisine yaklaşık bir ila bir buçuk santimetre uzunluğunda boylamsal bir insizyon yapın. Sonrasında peritonu kesin.

Ardından insizyon çevresine pamuklu gazlı bez yerleştirin. Gazlı bezi PBS ile durulayın. Künt pensle dikkatlice dışarı çekerek uterus boynuzlarından birini açığa çıkarın.

Miyometriyumu veya uterusu sertçe çekmekten kaçının. Uterus içindeki yüksek basınç, enjeksiyon sırasında embriyo sıvısı kaybı olasılığını artırarak abortusa neden olacaktır. Ardından, uterus kornusunu PBS ile durulanmış bir gazlı bezin üzerine yerleştirin ve nemli kalmasını sağlamak için birkaç dakikada bir PBS ile durulayın.

Şimdi, mikroskop altında uterusu beyin ventrikülleri görüntülenebilecek şekilde tutun. Uygun olmayan konumda bulunan embriyoyu kapsamlı bir şekilde yeniden konumlandırmayın. Bu durum sadece abortus riskini artırır.

Sol ve sağ kortikal hemisferler arasındaki fissür boşluğunu belirlemek için embriyonun başına üstten bakın. Hemisferler kolayca ayırt edilebilir ve içlerindeki lateral ventriküller genellikle biraz daha koyu şekiller olarak algılanabilir. Bir embriyonun DNA enjeksiyonu için mükemmel şekilde yönlendiği tespit edilirse, uterus duvarının delinip doğrudan üçüncü ventriküle girilmesi mümkündür.

Daha önce hazırlanmış olan DNA'yı içeren cam mikro pipeti, uterus duvarına 45 derecelik açıda tutun ve interhemisferik fissürün rostral ucundan, yaklaşık bir milimetre derinliğe kadar penetre ederek puncture işlemini gerçekleştirin. Bu sayede, cam mikro pipetin ucu lateral ventriküle değil, beynin üçüncü ventrikülüne girecektir. Ardından, üçüncü ventriküle yaklaşık bir mikrolitre DNA çözeltisi enjekte edin; başarılı bir enjeksiyonda ventrikül yeşil sıvı ile dolacaktır. Aynı prosedürü aynı uterus kornusundaki tüm embriyolar için tekrarlayın.

Bu işlem, DNA solüsyonunun ventriküler sıvı ile eşit şekilde karışması ve tüm nöroepitele ulaşması için zaman tanıyacaktır. Şimdi elektroporatörü açın ve ayarları embriyonik yaşa göre düzenleyin. Paslanmaz çelik iğne elektrodu pozitif kutup, yuvarlak düz elektrodu ise negatif kutup olarak kullanın; elektroporasyon için sırt kısmı yukarı bakan embriyoları seçin.

Ardından, iğne elektrodun ucunu aşağıya doğru iterek, embriyonun başının yanındaki amniyotik kese ile plasenta arasındaki rahim duvarını delin. Sonra diğer elinizin işaret parmağını destek bloğu olarak kullanın. Elektrot ucunun yaklaşık beş milimetresi, orta beyin seviyesinde amniyotik kese ile rahim duvarı arasında olmalıdır.

Bu hedefleme elektrodu olduğu için, konumu hipotalamik nöroepitelin hangi kısmının transfekte olma olasılığının en yüksek olacağını belirleyecektir. Ardından, diğer elinizle yuvarlak düz elektrodu, embriyonun başının karşı tarafında, uterus duvarının dışına yerleştirin. Daha sonra embriyoyu elektrotlar arasında nazikçe sıkıştırın.

Voltaj uygulamak için pedal anahtarını kullanın. Ardından, diğer elin işaret parmağıyla rahmi geride tutarken, iğne elektrodu yavaşça rahimden çıkarın. Eğer delinen duvardan amniyotik sıvı kaybı olursa, genellikle embriyo düşükle sonuçlanır.

Tüm embriyolara enjeksiyon ve elektroporasyon yapıldıktan sonra, uterusu farenin karın boşluğuna çok dikkatli bir şekilde geri yerleştirin ve tam olarak önceki konumlarına getirin. Ardından, kapatmadan önce periton boşluğunu salin ile nemlendirin. Peritonu cerrahi katgut ile dikin, ardından cildi daha dayanıklı bir sütür ile dikin.

Karın yüzeyini iyot çözeltisi ile dezenfekte edin ve ağrı kesici olarak deri altına nonsteroid anti-inflamatuar enjekte edin. Ardından, anneyi anestezi cihazından çıkarın ve ısıtma pedi ile ısıtılan bir kafese yerleştirin. Fare, anesteziden tamamen çıkana kadar izleyin ve prosedürden sonra herhangi bir enfeksiyon veya ağrı belirtisi olmadan iyileştiğinden emin olmak için fareyi günlük olarak kontrol edin.

Bu adımda, analiz için belirlenen güne göre embriyoları veya postnatal dönemdeki örnekleri toplayın. DNA enjeksiyonu yapılmış ve elektroporasyona uğramış embriyoları seçin ve beyinleri bu stereo mikroskop altında disseke edin. Ardından, uygun bölgedeki yeşil floresan sinyalini kontrol edin.

Seçilen embriyonun beynini analiz etmek için, dokuyu kısa bir süre %4 paraldehit ile tespit edin. Ardından, dokuyu %4 agaroz veya jelatin albümin içine gömün. Daha sonra beyni vibratomda dilimleyin.

Bu şekiller, E 12.5 gününde floresan rapor genleri olan GFP veya CFP taşıyan plazma DNA'sının in utero transfeksiyonu sonrası hipotalamusu göstermektedir. Bu, rostralden kaudal bölgeye transfekte edilmiş bir hipotalamusu gösteren sagital bir kesittir ve burada, medya lateral ekseni boyunca farklı seviyelerdeki etiketli hücreleri içeren transvers kesit yer almaktadır. Bu sagital kesit, spesifik olarak transfekte edilmiş bir mammillary body'yi ve onun karakteristik aksonal ağının etiketlenmesini göstermektedir; bu transvers kesitin elektro parade tarafında ise E 12.5 gününde doğan nöronlara karşılık gelen etiketli bir bant görülmektedir.

Kesitleri daha yakından analiz etmek amacıyla, mammillary resessten çıkan radyal glial çıkıntılar düzlemine paralel yatay kesitler hazırlandı. E 12.5 gününde transfekte edilen nöroepitelden köken alan ambi O nöronları, E 18.5 gününde GFP karşıtı antikorlar kullanılarak tanımlandı.

Bu örnekte, antikor kısıtlı bir MBO hücresi grubunu etiketlemiştir. Bu grup, E 12.5 öncesi ve sonrası doğan MBO nöronlarına karşılık gelen, etiketlenmemiş iki lateral ve medial MBO alanı ile nestin karşıtı bir antikorla yapılan eş boyama arasında yer almıştır. Kırmızı renk, nöroepitelyumun radial glial çıkıntıları üzerindeki tek tek etiketlenmiş nöronların göç modunu göstermektedir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, prosedür uygun şekilde yürütülürse 30 dakika içinde tamamlanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, DNA'nın üçüncü ventriküle nasıl enjekte edileceği ve hipotalamusu verimli bir şekilde hedeflemek için iğnenin embriyo, baş ve plasenta arasında pozitif elektrot olarak nasıl konumlandırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürün ardından, transfekte nöronların fenotipi hakkında ek soruları yanıtlamak için immünohistokimya veya in situ hibridizasyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir.