Name: Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi Utero olarak Elektroporasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Öğrenin fare embriyolarının hipotalamusuna in utero elektroporasyon yöntemiyle DNA transferi yaparak gen fonksiyonlarını nasıl manipüle edeceğinizi. Bu teknik, hipotalamik gelişim ve nöroloji araştırmaları için değerli bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (Deutsche Forschungsgemeinschaft) tarafından finanse edildi.

1. Enjeksiyon için DNA ve Cam mikropipetler hazırlanması <ol><li> İyi kaliteli cam mikropipetler amniyotik sıvı kaybı nedeniyle ilk yüksek kürtaj oranını azaltmak için gereklidir. Cam mikropipetler çekmek için prosedür de 13,18,25 belgelenmiştir. Isı = 300,, 1.2 mm çapında kılcal kullanın ayarları p = 500 ile geleneksel bir Sutter P-97 cihazı çekti = 40 çekin; Hız = 50; Zaman = 50. 3 mm &quot;çukur&quot; filamentler (Sutter Instrument FT330B) ile çektirme takın. 2 mm boyutu filamentler bize daha az tatmin edici sonuçlar için vermiştir. Öte yandan, mikropipet ipuçları beveling bizim için sonuçlarını geliştirmek için görünmüyor. </li><li> 1-2 mg / ml bir son konsantrasyona kadar hızlı şekilde yeşil% 0.1 içeren PBS içinde saflaştınldı, endotoksin içermeyen DNA (Hücre Kültürü Sınıf) içinde çözülür. Hızlı Yeşil embriyonik beyin ventrikül görünür enjekte çözüm yapacaktır. </li><li> Cam mikropipet içine DNA çözüm 10 ul yükleyin. </li&gt; <li> Enjeksiyon sistemi (Pico Pompa) veya ağız pipet cam mikropipet bağlayın. </li></ol> 2. Anestezi Bir ısıtma yastığı ve cerrahi aletler ile cerrahi tablo hazırlayın. Embriyoların görselleştirme kolaylaştırmak için soğuk ışık kaynakları açın. Örneğin bir cam boncuk sterilizatör için kullanarak cerrahi aletler dezenfekte edin. Üç farklı anestezi prosedürleri (Tartışma) bu protokol için mümkündür. Burada biz (debisi 0,5 L / dk) anestezi indüksiyonunda izofluran inhalasyon kullanarak, iyi düşünün bir de bakım (akış hızı 1 L / dk) anlatacağız. <ol><li> Boru kısa bir uzunluğu Komesaroff Mark 5 Anestezi Cihazı bağlı bir (yani fare görünür kalır) şeffaf küçük bir kapta hamile fare tanıtmak. </li><li> Izofluran ile buharlaştırıcı doldurun, daha sonra cihaza bağlı oksijen şişe açın. Isofl bir ya da iki darbe Darbeurane / narkoz set in için fare ve saat tutan kaba oksijen (0.5 L / dk) </li><li> Onları kurumasını önlemek ve hemen kendi kafasına akış anestezi maskesi uygun merhem ile göz kapağı, fareyi çıkarın. </li></ol> 3. Laparotomi <ol><li> Isıtma yastığı (aksi takdirde vücut ısısı kurtarma şansı azalan, çok hızlı aşağı gidecek) kadar göbek fare yerleştirin ve bant ile yanlarına dört ayakları sabitleme tarafından yerine gövdesi sabitleyin. Refleks stimülasyon (firma basınç ile örneğin parmak veya kuyruk tutam) yanıt kaybı denetleyerek anestezi derinliği değerlendirin. </li><li> Karın yüzeyi Tıraş ve iodophorpovidone-iyot (Braunoderm) ile dezenfekte edin. </li><li> Karın derisi üzerinde bir uzunlamasına kesik (1-1,5 cm uzunluğunda) olun. Daha sonra periton kesti. Kesi etrafında pamuk gazlı bez yerleştirin. Bir uterin boynuz görünür yapın ve PBS-durulanır gauz üzerine künt forseps ile dikkatli bir şekilde çekine. Çok sık, her zaman (Şekil 2A ve 2B) nemlendirilmiş tutmak için PBS ile rahim durulayın. Tüm işlem sırasında rahim içinde yüksek basınç kürtaj ile sonuçlanan enjeksiyon üzerine sıvı kaybı şansı artan embriyo ilettiğiniz çünkü, sıkı mesometrium veya rahim çekerek kaçının. </li></ol> 4. Beyin Ventrikül içine DNA Enjeksiyon <ol><li> Beyin ventriküller görülebilmesi şekilde rahim tutun. Yaygın olumsuz bir pozisyonda yatıyor bir embriyo yeniden konumlandırmak etmeyin - bu sadece kürtaj şansını artırır. </li><li> Üstten embriyonun kafası bakıldığında, sol ve sağ kortikal hemisfer arasındaki görsel boşluğu veya fissür lokalize. Hemisfer ayırt etmek kolaydır ve içlerinde lateral ventriküller (hedef olmamak), genellikle biraz daha koyu şekiller olarak algılanabilir. Bir embriyo (Figür DNA enjeksiyonu için mükemmel odaklı olduğu bulunursaes 2C ve 2D), bu delmek için rahim duvarı mevcuttur ve aynı anda üçüncü ventrikül girin. Yaklaşık 1 mm delici, rahim duvarı ve kortikal hemisfer arasındaki farkın rostral sonunda delinme buna 45 ° cam mikropipet tutun. Bu şekilde, cam mikropipet ucu beyin (değil yanal ventrikül) (Şekil 2C ve 2D) üçüncü ventrikül girecektir. Bu embriyonik baş çevresinde ilk delmek rahim duvarına (her zaman 45 °) için yararlıdır az olumlu odaklı embriyolarda, kortikal hemisfer arasında doğru pozisyonda mikropipet ucu yerleştirin ve ancak o zaman beyin perfore. Üçüncü ventrikül (iyi bir enjeksiyon yeşil sıvı ile ventrikül doldurur) içine DNA çözüm 1 ul hakkında enjekte edilir. Bir rahim boynuzu tüm embriyolar ile aynı işlemi tekrarlayın. Bu DNA çözümü için bir süre ventriküler sıvı ile eşit karıştırın ve entir ulaşmasını sağlare neuroepithelium. </li></ol> 5. Elektroporasyon için Hipotalamus Hedefleme <ol><li> Üzerinde Elektroporatör açın ve embriyonik yaş (E12.5 için biz 5 kare-dalga darbeleri kullanın, 50 V, 50 msn ON/950 msn OFF) göre ayarlayın. Pozitif kutbu paslanmaz çelik iğne elektrot (CUY550-10) olarak ve negatif kutup yuvarlak düz elektrot (CUY700P4L) olarak kullanın. (Bu, aksi takdirde mevcut değil, sadece bu kadar embriyo çevresinde akar yana elektrotlar, embriyo daha küçük olması önemlidir.) </li><li> Elektroporasyon için olan sırt tarafında (yani deneyci dönük) kadar (bunlardan çoğu gibi) bu embriyoların seçin, ve olan yönelim elverişli değildir bu atın. Bu etanol-dezenfekte parmakları ile veya eldiven ile rahim dokunmak artık güvenlidir. Forseps ile rahim Holding Ancak, elektroporasyon sırasında elektrik akımını bozabilir. </li><li> Pierce amn arasındaki embriyonun başkanı tarafından rahim duvarıiğne elektrot ucu ile aşağı doğru sokmak tarafından iotic kese ve plasenta. Itme blok gibi diğer elin işaret parmağınızı kullanın. Elektrot ucu yaklaşık 5 mm orta beyin (Şekil 2E ve 2F) yaklaşık düzeyinde, amniyon kesesi ve uterus duvar arasında şimdi olmalıdır. Bu &quot;hedef elektrot&quot;, bu nedenle konumunu hipotalamik neuroepithelium parçası transfekte almak için büyük olasılıkla belirlemek unutmayın. Embriyo çok yavaşça elektrotlar arasında &quot;sıkıştırılmış&quot; olmak zorundadır. </li><li> Öte yandan, pozisyon ile embriyo kafası (Şekil 2E ve 2G) ters tarafında rahim dış duvarın yuvarlak yassı elektrod. </li><li> (, 950 msn kapalı, 5 kare dalga darbeleri ON 50 V, 50 msn) gerilim uygulamak için pedal anahtarı kullanın. </li><li> Diğer elin işaret parmağı ile rahim geri tutarak yavaşça rahim iğne elektrot çekin - eğer Amniotik sıvı Patlak duvarından kaybolur, genellikle embriyo kürtaj geçirecek. Tüm embriyolar ile aynı işlemi tekrarlayın. </li><li> Karın içine rahim boynuz dönün ve kalan boynuz içinde enjeksiyon ve elektroporasyon tekrarlayın. </li></ol> 6. Cerrahi Bitirme <ol><li> Tüm embriyoların enjeksiyon ve elektroporasyon sonra, kapatmadan önce serum fizyolojik ile periton boşluğuna önce ve nemli tam olarak konumlandırılmış, çok dikkatli bir şekilde karın geri rahim yerleştirin. </li><li> Cerrahi katgüt (Vicryl poliglaktin 910, 5-0, Ethicon V4914) ile periton dikin. Cilt kullanım kapatılması için methodwith daha dayanıklı sütür (Supramid Naylon, 6-0, Serag Wiessner 07171L TO) &quot;dikiş kesildi&quot;. </li><li> Povidon-iyot (Braunoderm) ile karın yüzeyi dezenfekte edin ve bir non-steroid subkutan anti-inflamatuar (örneğin% 0.9 NaCl içinde Rimadyl içinde 1:10 çözüm 100 ul) veya, daha iyi, met gibi bir opioid enjekteprenorphine (Temgesic,% 0.9 NaCl 0.05 ile 0,1 mg / kg vücut ağırlığı) ağrı gidermek için. </li><li> Anestezi makineden anne çıkarın ve bir ısıtma yastığı ile ısıtılan bir kafes yerleştirin. Tamamen anestezi kurtarıldı kadar sürekli fare izleyin. Daha sonra, onlar enfeksiyon veya ağrı belirtisi olmadan prosedürü gelen kurtarma sağlamak için her gün hayvanları kontrol edin. </li></ol> 7. Sonuçları analiz <ol><li> Analiz istenilen güne göre embriyolar (veya postnatals) hasat. Doğum Sonrası fareler (1 ile 2 günlük) dekapitasyon tarafından öldürüldü. </li><li> Bir önceki elektroporasyon açıklama göre her embriyo ayırın. Bir stereo mikroskop altında beyin incelemek ve uygun bölgede yeşil floresan sinyal (GFP muhabiri itibaren) için mikroskop altında kontrol edin. </li><li> Seçilen beyin &quot;taze&quot; analiz edilebilir:% 4 paraformaldehid kısa bir süre için doku düzeltmek ve agaroz% 4 veya jelatin-bir gömmeklbumin, o zaman bir vibratome tipi cihaz bölümü (Şekil 3). Daha detaylı immünohistokimyasal analizi için (Şekil 4), OKT montaj orta (Doku Tek) gömmek% 30 sakaroz çözüm, beyinde kriyo-koruma sonra kriyostat 20 mikron bölümleri kesti. </li></ol>

<ol><li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shocking%27+developments+in+chick+embryology%3A+electroporation+and+in+ovo+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).</li>
<li>Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreign+gene+expression+in+an+organotypic+culture+of+cortical+anlage+after+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation.</a> Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294, 1071-1074 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+tend+to+stop+migration+and+differentiate+along+the+cortical+internal+plexiform+zones+in+the+Reelin+signal-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice.</a> J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).</li>
<li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emx2+patterns+the+neocortex+by+regulating+FGF+positional+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling.</a> Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).</li>
<li>Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+signaling+centers+expressing+BMP%2C+WNT+and+FGF+proteins+interact+to+pattern+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex.</a> Development. 131, 5639-5647 (2004).</li>
<li>Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+8+regulates+neocortical+guidance+of+area-specific+thalamic+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation.</a> J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li>
<li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Gene+Delivery+into+Multiple+CNS+Territories+Using+In+Utero+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2957(2011).</li>
<li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+Electroporation+followed+by+Primary+Neuronal+Culture+for+Studying+Gene+Function+in+Subset+of+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), e2103(2010).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E15+Mouse+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239(2007).</li>
<li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E16+Rat+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e236(2007).</li>
<li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).</li>
<li>Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+thalamic+differentiation%3A+gli-dependent+pattern+and+gli-independent+prepattern%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern.</a> Front Neurosci. 6, 27(2012).</li>
<li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+Utero+Electroporation%3A+Controlled+Spatiotemporal+Gene+Transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), e3024(2011).</li>
<li>Vue, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+signaling+controls+thalamic+progenitor+identity+and+nuclei+specification+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice.</a> J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+the+hypocretin%2Forexin+gene+by+NR6A1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).</li>
<li>Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+axonal+projections+from+mammillary+bodies+in+Pax6+mutant+mice%3A+possible+roles+of+Netrin-1+and+Slit+2+in+mammillary+projections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections.</a> J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).</li>
<li>Canteras, N. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCanteras%2C+NS+%22The+Mouse+Nervous+System%22">The Mouse Nervous System</a>. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. , Academic Press. 539-562 (2011).</li>
<li>Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+for+trouble%3A+a+search+for+developmental+defects+of+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Res%22%5BJournal%5D)">Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus.</a> Horm. Res. 64, 222-230 (2005).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+Electroporation+for+Gene+Expression+in+Mouse+Retinal+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells.</a> J. Vis. Exp. (31), e1333(2009).</li>
<li>Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+of+in+Utero+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model of in Utero Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (47), e2303(2011).</li>
<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+of+the+Rat+Hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Anat.+Embryol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Development of the Rat Hypothalamus.</a> Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).</li>
<li>Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+developmental+time+across+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Translating developmental time across mammalian species.</a> Neuroscience. 105, 7-17 (2001).</li>
<li>Clancy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+method+for+translating+neurodevelopment+from+laboratory+species+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans.</a> Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).</li>
<li>Ishii, Y., Bouret, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+birthdate+of+hypothalamic+leptin-activated+neurons+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice.</a> Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).</li>
<li>Karim, M. A., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histogenesis+of+the+supraoptic+and+paraventricular+neurosecretory+cells+of+the+mouse+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus.</a> J. Anat. 130, 341-347 (1980).</li>
<li>Shimada, M., Nakamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+of+neuron+origin+in+mouse+hypothalamic+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei.</a> Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).</li>
<li>Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+lineage+in+the+mouse+hypothalamus%3A+from+progenitor+domains+to+hypothalamic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions.</a> Neural. Dev. 7, 4(2012).</li>
<li>Vann, S. D., Aggleton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammillary+bodies%3A+two+memory+systems+in+one%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mammillary bodies: two memory systems in one.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).</li>
<li>Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+inhibition+of+BMP-4+gene+expression+in+postimplantation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos.</a> Genesis. 37, 12-17 (2003).</li>
<li>Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+silencing+of+Sry+gene+with+RNA+interference+in+developing+mouse+embryos+resulted+in+feminization+of+XY+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891(2012).</li>
<li>Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+mechanism+of+gene+transfer+into+early+to+mid-gestational+mouse+fetuses+by+tail+vein+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection.</a> Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).</li>
<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).</li>
<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+targeting+mechanism+of+Angiopep-conjugated+poly%28ethylene+glycol%29-co-poly%28epsilon-caprolactone%29+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles.</a> Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+for+stable+expression+of+foreign+genes+in+mammalian+cells+by+use+of+the+untranslated+leader+sequence+from+EMC+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus.</a> Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+promoters+for+driving+efficient+transgene+expression+in+neonatal+porcine+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets.</a> Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Anestezi hakkında: Hipotalamus içine utero elektroporasyon teknik olarak zorlu olması ve daha uzun narkoz kez gerektirebilir yana, oksijen ve izofluran karışımı verilmesi ile anestezi neden ve korumak için tercih. Bizim tecrübelerimize göre, hayvanlar en az, annenin iyileşme çok hızlı, ve embriyo hayatta kalma geliştirilmiş bir saat kadar süre bu şekilde uygun anestezi kalabilir. Anestezi için diğer yaklaşımlar da mevcuttur. En basit bir prosedür intraperitoneal enjeksiyon ile narkoz neden olan ve muha...

Embriyonik fare beyin genetik manipülasyon gelişimsel düzenleme hakkında bilgi almak için tercih edilen bir yaklaşımdır. Mutant fare hatları üretimi ne kadar yavaş ve pahalıdır. Memeli beyin nöronların geliştirilmesinde belirli genetik değişiklikler tanıtmak için bir güçlü bir yöntem utero elektroporasyon olduğunu. Esasen, teknik daha sonra embriyo, belirli bir zaman süresi boyunca hayatta beyin toplamak ve olası yeni, bilgilendirici, fenotip için bunları incelemeye izin veren elektrik darbeleri vasıtasıyla embriyonik beyin epitele DNA transfekte oluşur. Bu şekilde, fare deneyi mutantlarının üretimi için gerekli olan uzun bekleme süreleri olmaksızın hemen hipotezleri test edebilir. Gelişmekte olan embriyo içine DNA Transfeksiyon civciv embriyoları 1 ovo elektroporasyon ile başladı. Fare için proof-of-concept temel kültüründe yapıldı <s2&gt; kadar. Bu yakında utero 3,4 fare üzerindeki tekniğin ilk açıklamaları izledi. Asıl sorun onları ya da anne öldürmeden rahimde gelişmekte olan embriyo beyin transfect etmektir. (Laparotomi, enjeksiyon, elektroporasyon) gerekli ameliyat öğrenmek uzun bir eğitim süresi gerektirir. Ameliyat embriyo hayatta kalma oranı kabul edilebilir noktaya hakim sonra, bir sonraki önemli bir soru: beyin yapıları erişilebilir olan? Beklendiği gibi, utero elektroporasyon ile elde edilen sonuçlar gösteren ilk yayınlanan bildiri kortikal gelişim 5-9 odaklanmıştır. Cerrahi işlemler için en kolay gelişmekte olan fare beyin bölgesi korteks (Şekil 1), bu durum, bu yöntem kullanılarak yayın çoğu için de geçerlidir. Korteks içine utero elektroporasyon prosedürü tarif edilmiştirbaskı 10 ve video 11-14. Tekniğin bir değişiklik telencephalon bir karın kısmı, bazal ganglion 15 hedeflemek için kullanılabilir. Telencephalon ötesinde, diensefalon (klasik talamus ve hipotalamus ayrılmıştır) ulaşmak için daha zor ön beyin bir bölgedir. Onun dorsal ve en kolay kısmı, talamus 16-19 hedef kağıtları raporların az sayıda. Hipotalamus, ön beyin en karın kısmı bu nedenle bir dorsal yüzeyi (korteks), (Şekil 1) &#39;den en derin lokalize. Bu bölge genetik rahimde fare beyin işlemek için taahhüt araştırmacılar için zor bir sorun olmaya devam etmektedir. Bildiğimiz kadarıyla, sadece çok az sayıda makale fare hipotalamus 20,21 içine utero transfeksiyon içinde sonuçları rapor. Ancak, hipotalamus bulaşmıyor işlevsel önemibu, çiftleşme, üreme ve ebeveynlik 22 yeme ve içme gibi davranışları düzenleyen beri t, abartılmış. Ayrıca, hipotalamik gelişiminde değişiklikler daha sonra obezite, hipertansiyon, diyabet ve erken ergenlik 23 gibi yaşam koşulları kaynaklı katkıda bulunur. Gelişimi sırasında genetik hipotalamus değiştirmek için güçlü olmak bunu anlamak için çok güçlü bir araç sağlayacaktır. Burada kullandığımız gebe farelerin laparotomi için temel cerrahi protokolü diğer protokoller 11,13,14,24 kullanılan benzemektedir. Biz bütünlüğü için kısaca bunları anlatacağız. Bizim prosedüre anahtar, diğer taraftan, anestezi tipi, enjeksiyon yeri, elektrotların türü ve ekleme ve embriyonun kafası ile ilgili olarak pozitif elektrot pozisyonu vardır. Eski sağlar beri, basit intraperitoneal anestezi üzerinden gaz solunması anestezi teşvik ve korumak için tercihnarkozu biraz daha uzun süre zor bir ameliyat için gerekli. Anestezi daha hızlı kurtarma izofluran inhalasyon sonuçları, genellikle anne zaten ameliyattan sonra dakika normal bir davranışı gösterir beri. Cam mikropipet ile DNA çözüm enjeksiyon en kolay nokta ancak hipotalamus elektroporasyon için tamamen uygun değildir lateral ventrikül vardır. Doğrudan üçüncü ventrikül enjeksiyon gerçekten derin diensefalik yapıları hedef için çok önemlidir. Bu standart, off-the-raf elektrotlar ile E12.0 veya E12.5 gelen hipotalamus transfect mümkündür. Biz özellikle bu amaç için uygun Nepa, Gene (Chiba, Japonya) tarafından üretilen bazı elektrodların bulduk. Bizim işlem ile, tüm hipotalamik neuroepithelium veya elektrot yönüne bağlı olarak kısmi, bölgesel aktarılmasının transfeksiyon edinin. Burada muhtemelen, göğüs vücut transfecting tarafından tekniği göstermekderin ve bütün hipotalamik çekirdek en gömme. Buna ek olarak, çözünürlük, hücresel seviyede için transfekte edilmiş hücrelerin ayrıntılı histolojik analizi aşağı göstermektedir. Utero fare gelişen beyin transfecting diğer yaklaşımlarla utero elektroporasyon karşılaştırılması Tartışma bölümünde bulunabilir.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><güçlü >REAKTİFler< / güçlü ></td></tr> <tr><td>Acepromazine</td><td>Sanofi GmbH</td><td></td><td>anestezik</td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Baxter</td><td>HDG9623</td><td>anestezik</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Pharma GmbH</td><td></td><td>anestezik</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Fluka</td><td>44715</td> <td>& nbsp;</td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer</td><td></td><td>non-steroidal anti-inflamatuar</td></tr><tr><td>Braunoderm Braun</td><td></td><td>3887138</td><td>povidon-iyot</td></tr><tr><td>Fosfat Tampon Salin PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Temgesic (buprenorfin)</td><td>Essex Pharma</td><td></td><td>opioid analjezik</td></tr><tr><td>Göz Merhemi</td><td>Pan-Oftal</td><td>7136926</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>Bayer</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><güçlü > EKİPMANLAR< / güçlü ></td></tr> <tr><td>Anestezik Cihaz Komesaroff Mark-5</td><td>Tıbbi Gelişmeler Avustralya</td><td>ACN 004 903 682</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kılcal çektirme P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sıkıştırma</td><td>Hassas Talimatı</td><td>VF-300</td><td>Vibratom tipi cihaz</td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Elektroporatör</td><td>Nepa Gene Co., Ltd.</td><td>CUY21EDIT</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Elektrot 1</td><td>Nepa Gene Co., Ltd.</td><td>CUY550-10</td><td>Paslanmaz Çelik İğne Elektrodu, 10 mm Uç, 0,5 mm çap</td></tr><tr><td>Elektrot 2</td><td>Nepa Gene Co., Ltd.</td><td>CUY700P4L</td><td>Kapaklı Yuvarlak Platin Plaka 4 mm çap</td></tr><tr><td>Fiberoptik soğuk ışık kaynağı</td><td>Leica</td><td>KL2500 LCD</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cam kılcal damarlar</td><td>Harvard Aparatı</td><td>GC120T-15</td><td>1. 2 mm Dış Çap x 0.94 mm İç Çap</td></tr><tr><td>Cam boncuk sterilizatörü</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>FST250</td> <td>ve nbsp;</td></tr><tr><td>Isıtma yastığı</td><td>Harvard Aparatı</td><td>py872-5272</td> <td>& nbsp;</td></tr><tr><td>Enjeksiyon cihazı</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>Pnömatik Pico Pompa PV820</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sütür İplik Kaplı Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>V4914</td><td>Peritoneal</td></tr><tr><td>Sütür Thr. Supramid</td><td>Serag Wiessner</td><td>TO07171L</td><td>Cilt Sütürü</td></tr></tbody></table>

fare genetik manipülasyon yoluyla hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; utero olarak</em&gt; elektroporasyon

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Gelişmekte olan memeli beynin belirli bölgelerde genetik modifikasyonu çok güçlü bir deneysel bir yaklaşımdır. Ancak, yeni fare mutantlar üreten genellikle sinir bozucu yavaş. Makul post-operatif sağkalım rahimde gelişmekte olan fare beyin erişimi mümkün olduğu gösterilmiştir. Yine de, bu prosedüre sonuçlar gelişmekte olan beynin en yüzeysel ve kolay erişilebilir kısmı için neredeyse sadece bildirilmiştir, korteks yani. Talamus, daha dar ve daha orta bölgesinden bir hedef, daha zor olduğu kanıtlanmıştır. Özellikle derin çekirdek, hipotalamus bu içine Transfeksiyon, en zorlu ve bu nedenle çok az sonuç bildirilmiştir belki de. Burada tüm hipotalamik epitele veya elektroporasyon ile transfeksiyon için bunun bir parçası (hipotalamik bölgeler) hedef için bir prosedürü göstermektedir. Bizim yaklaşım anahtarları t uzun narkoz kez, enjeksiyon olarakHird ventrikül ve uygun tür ve elektrot konumlandırma. Ayrıca, hedef ve en girintili hipotalamik çekirdek, göğüs vücudun sonraki histolojik analiz sonuçları göstermektedir.

En hipotalamus nöronlar biraz daha kısa fare geliştirme 27,28 tercüme sıçan 26 doğum kalma analizine göre, E11.5 arasında E15.2 için doğarlar. Hipotalamik nöron zirve E12.5 29-31 ulaşılır. Buna göre, bu çalışmada (E12.5) için seçilen transfeksiyon yaşta, hipotalamus nöronları büyük bir kısmı, herhangi bir rostro-kaudal seviyesinde etiketlenebilir. Kalın vibratome tip bölümlerde E18.5 de analizi (Şekil 3A ve 3B), hipotalamik n...

Hipotalamusun fonksiyonel ve tıbbi önemine rağmen,<em&gt; Utero</emGelişimi&gt; genetik manipülasyon nadiren çalışılmıştır. Biz için ayrıntılı bir prosedür göstermek<em&gt; Utero</emFare hipotalamus ve total ve parsiyel (bölgesel) hipotalamik aktarılmasının gösterisi temsilcisi sonuçlara&gt; elektroporasyon.

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Bu prosedürün genel amacı, ilgilenilen bir genin fonksiyonunu aktive etmek veya baskılamak için, uteroda gelişen fare embriyolarının hipotalamusuna plazmid DNA transfekte etmektir. Bu işlem, öncelikle gebe farenin anesteziye alınması ve laparotomi yoluyla uterusun açığa çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, DNA çözeltisinin embriyonik beynin üçüncü ventrikülüne enjekte edilmesidir.Ardından, pozitif elektrot uterus içinde, plasenta ile embriyonik baş arasına yerleştirilir. Negatif elektrot dış uterus yüzeyine yerleştirilir ve elektrik darbeleri uygulanır. Son adım, altı gün sonra transfekte edilmiş embriyonik beyinlerin çıkarılmasıdır.Sonuç olarak, transfekte edilen hücrelerin sayı, şekil, konum, marker ekspresyonu ve benzeri fenotipik değişimlerini analiz etmek için floresan mikroskobu kullanılır. Bu tekniğin viral transfeksiyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları; ilk olarak özel önlemler gerektirmemesi ve iki tesis gerektirmemesi, ikincisi spesifik bir bölgenin hedeflenmesinin mümkün olması ve üçüncüsü, Ute elektroporasyon ile aday genlerin taranmasının daha hızlı olmasıdır.Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayacaklardır; çünkü DNA solüsyonunun üçüncü ventriküle enjekte edilmesi ve iğne elektrodun doğru şekilde konumlandırılması, gelişmiş bir manuel becerinin yanı sıra deneyim gerektirir. Bu yöntem, hipotalamik gelişim alanındaki soruların, özellikle hücre migrasyonu ile ilgili olanların yanı sıra, münferit bölgelerin ve çekirdeklerin genetik olarak nasıl belirlendiğinin yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Amniyotik sıvı kaybına bağlı olarak meydana gelen başlangıçtaki yüksek abort oranını azaltmak için kritik öneme sahip olan yüksek kaliteli cam mikropipetleri çekerek bu prosedüre başlayın.DNA hazırlamak için, saflaştırılmış endotoksin içermeyen plazma DNA'sını, %0,1 fast green içeren PBS içinde mikrolitre başına bir ila iki mikrogram nihai konsantrasyona gelecek şekilde çözün. Fast green, enjekte edilen çözeltinin embriyonik beyin ventrikülünde görünür olmasını sağlayacaktır. Ardından, cam mikro pipete 10 µL DNA çözeltisi yükleyin.Ardından cam mikro pipeti enjeksiyon sistemine veya bir ağız pipetine bağlayın. Bu adımda, cerrahi masayı bir ısıtma pedi ve cerrahi aletlerle hazırlayın. Embriyoların görselleştirilmesini kolaylaştırmak için soğuk ışık kaynaklarını açın. Daha sonra cerrahi aletleri bir cam boncuk sterilizatörü kullanarak dezenfekte edin.Ardından, gebe bir fareyi izofloran ile anestezi edin. Fare anestezi edildikten sonra, kurumayı önlemek için gözlerine merhem uygulayın. Daha sonra, anestezinin sürekli devam etmesini sağlamak için yüzüne maskeyi yerleştirin.Şimdi fareyi karnı yukarı bakacak şekilde bir ısıtma pedinin üzerine yerleştirin. Dört uzvunu bantla sabitleyerek gövdesini yerinde tutun. Kuyruğunu sıkarak refleks kontrolü yapın ve farenin tamamen anestezi altında olduğundan emin olun.Ardından karın yüzeyini tıraş edin ve iyot çözeltisi ile dezenfekte edin. Karın derisine yaklaşık bir ila bir buçuk santimetre uzunluğunda boylamsal bir insizyon yapın. Sonrasında peritonu kesin.Ardından insizyon çevresine pamuklu gazlı bez yerleştirin. Gazlı bezi PBS ile durulayın. Künt pensle dikkatlice dışarı çekerek uterus boynuzlarından birini açığa çıkarın.Miyometriyumu veya uterusu sertçe çekmekten kaçının. Uterus içindeki yüksek basınç, enjeksiyon sırasında embriyo sıvısı kaybı olasılığını artırarak abortusa neden olacaktır. Ardından, uterus kornusunu PBS ile durulanmış bir gazlı bezin üzerine yerleştirin ve nemli kalmasını sağlamak için birkaç dakikada bir PBS ile durulayın.Şimdi, mikroskop altında uterusu beyin ventrikülleri görüntülenebilecek şekilde tutun. Uygun olmayan konumda bulunan embriyoyu kapsamlı bir şekilde yeniden konumlandırmayın. Bu durum sadece abortus riskini artırır.Sol ve sağ kortikal hemisferler arasındaki fissür boşluğunu belirlemek için embriyonun başına üstten bakın. Hemisferler kolayca ayırt edilebilir ve içlerindeki lateral ventriküller genellikle biraz daha koyu şekiller olarak algılanabilir. Bir embriyonun DNA enjeksiyonu için mükemmel şekilde yönlendiği tespit edilirse, uterus duvarının delinip doğrudan üçüncü ventriküle girilmesi mümkündür.Daha önce hazırlanmış olan DNA'yı içeren cam mikro pipeti, uterus duvarına 45 derecelik açıda tutun ve interhemisferik fissürün rostral ucundan, yaklaşık bir milimetre derinliğe kadar penetre ederek puncture işlemini gerçekleştirin. Bu sayede, cam mikro pipetin ucu lateral ventriküle değil, beynin üçüncü ventrikülüne girecektir. Ardından, üçüncü ventriküle yaklaşık bir mikrolitre DNA çözeltisi enjekte edin; başarılı bir enjeksiyonda ventrikül yeşil sıvı ile dolacaktır. Aynı prosedürü aynı uterus kornusundaki tüm embriyolar için tekrarlayın.Bu işlem, DNA solüsyonunun ventriküler sıvı ile eşit şekilde karışması ve tüm nöroepitele ulaşması için zaman tanıyacaktır. Şimdi elektroporatörü açın ve ayarları embriyonik yaşa göre düzenleyin. Paslanmaz çelik iğne elektrodu pozitif kutup, yuvarlak düz elektrodu ise negatif kutup olarak kullanın; elektroporasyon için sırt kısmı yukarı bakan embriyoları seçin.Ardından, iğne elektrodun ucunu aşağıya doğru iterek, embriyonun başının yanındaki amniyotik kese ile plasenta arasındaki rahim duvarını delin. Sonra diğer elinizin işaret parmağını destek bloğu olarak kullanın. Elektrot ucunun yaklaşık beş milimetresi, orta beyin seviyesinde amniyotik kese ile rahim duvarı arasında olmalıdır.Bu hedefleme elektrodu olduğu için, konumu hipotalamik nöroepitelin hangi kısmının transfekte olma olasılığının en yüksek olacağını belirleyecektir. Ardından, diğer elinizle yuvarlak düz elektrodu, embriyonun başının karşı tarafında, uterus duvarının dışına yerleştirin. Daha sonra embriyoyu elektrotlar arasında nazikçe sıkıştırın.Voltaj uygulamak için pedal anahtarını kullanın. Ardından, diğer elin işaret parmağıyla rahmi geride tutarken, iğne elektrodu yavaşça rahimden çıkarın. Eğer delinen duvardan amniyotik sıvı kaybı olursa, genellikle embriyo düşükle sonuçlanır.Tüm embriyolara enjeksiyon ve elektroporasyon yapıldıktan sonra, uterusu farenin karın boşluğuna çok dikkatli bir şekilde geri yerleştirin ve tam olarak önceki konumlarına getirin. Ardından, kapatmadan önce periton boşluğunu salin ile nemlendirin. Peritonu cerrahi katgut ile dikin, ardından cildi daha dayanıklı bir sütür ile dikin.Karın yüzeyini iyot çözeltisi ile dezenfekte edin ve ağrı kesici olarak deri altına nonsteroid anti-inflamatuar enjekte edin. Ardından, anneyi anestezi cihazından çıkarın ve ısıtma pedi ile ısıtılan bir kafese yerleştirin. Fare, anesteziden tamamen çıkana kadar izleyin ve prosedürden sonra herhangi bir enfeksiyon veya ağrı belirtisi olmadan iyileştiğinden emin olmak için fareyi günlük olarak kontrol edin.Bu adımda, analiz için belirlenen güne göre embriyoları veya postnatal dönemdeki örnekleri toplayın. DNA enjeksiyonu yapılmış ve elektroporasyona uğramış embriyoları seçin ve beyinleri bu stereo mikroskop altında disseke edin. Ardından, uygun bölgedeki yeşil floresan sinyalini kontrol edin.Seçilen embriyonun beynini analiz etmek için, dokuyu kısa bir süre %4 paraldehit ile tespit edin. Ardından, dokuyu %4 agaroz veya jelatin albümin içine gömün. Daha sonra beyni vibratomda dilimleyin.Bu şekiller, E 12.5 gününde floresan rapor genleri olan GFP veya CFP taşıyan plazma DNA'sının in utero transfeksiyonu sonrası hipotalamusu göstermektedir. Bu, rostralden kaudal bölgeye transfekte edilmiş bir hipotalamusu gösteren sagital bir kesittir ve burada, medya lateral ekseni boyunca farklı seviyelerdeki etiketli hücreleri içeren transvers kesit yer almaktadır. Bu sagital kesit, spesifik olarak transfekte edilmiş bir mammillary body'yi ve onun karakteristik aksonal ağının etiketlenmesini göstermektedir; bu transvers kesitin elektro parade tarafında ise E 12.5 gününde doğan nöronlara karşılık gelen etiketli bir bant görülmektedir.Kesitleri daha yakından analiz etmek amacıyla, mammillary resessten çıkan radyal glial çıkıntılar düzlemine paralel yatay kesitler hazırlandı. E 12.5 gününde transfekte edilen nöroepitelden köken alan ambi O nöronları, E 18.5 gününde GFP karşıtı antikorlar kullanılarak tanımlandı.Bu örnekte, antikor kısıtlı bir MBO hücresi grubunu etiketlemiştir. Bu grup, E 12.5 öncesi ve sonrası doğan MBO nöronlarına karşılık gelen, etiketlenmemiş iki lateral ve medial MBO alanı ile nestin karşıtı bir antikorla yapılan eş boyama arasında yer almıştır. Kırmızı renk, nöroepitelyumun radial glial çıkıntıları üzerindeki tek tek etiketlenmiş nöronların göç modunu göstermektedir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, prosedür uygun şekilde yürütülürse 30 dakika içinde tamamlanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, DNA'nın üçüncü ventriküle nasıl enjekte edileceği ve hipotalamusu verimli bir şekilde hedeflemek için iğnenin embriyo, baş ve plasenta arasında pozitif elektrot olarak nasıl konumlandırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürün ardından, transfekte nöronların fenotipi hakkında ek soruları yanıtlamak için immünohistokimya veya in situ hibridizasyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

genetic-manipulation-mouse-developing-hypothalamus-through-utero

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

E15 Fare Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

Burada fare retina ganglion hücrelerinin (RGCs) gen ekspresyonu işlemek için iki teknik...

Fare Retina Ganglion Hücreleri Gen İfadesi utero ve ex vivo Elektroporasyon

Utero elektroporasyon gelişmekte olan merkezi sinir sistemi (MSS) bir mekansal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde hızlı bir gen teslimat için izin verir. Burada son derece uyarlanabilir tarif telencephalon diensefalon ve retina da dahil olmak üzere birden fazla embriyonik MSS etki alanı ifade yapıları sunmak için kullanılabilir utero elektroporasyon protokol.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

Midgestation Fare Embryolarının Alt Rombik Dudak in vitro Elektroporasyon yılında

Bu makalede ayrıntılı olarak utero serebral korteks ve farelerde E14.5 de hipokampus electroporate bir protokol tanımlamaktadır. Biz de bu bu iki beyin bölgelerinde dendrit ve dikenler incelemek için değerli bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Burada, hipokampal gelişim sırasında belirli genlerin düzenleyici mekanizmalarını incelemek için bir araç sağlayan bir protokol sunuyoruz. Ex utero elektroporasyon ve organotipik dilim kültürünün kullanılması, tek hücrelerde ilgilenilen genlerin ekspresyonunun yukarı ve aşağı regülasyonuna izin verir ve gelişim sırasında kaderlerini takip eder.

Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Bu protokol, in utero elektroporasyon yoluyla C57BL/6 merkezi sinir sistemindeki farklı bölgelerin spesifik olarak nasıl transfekte edileceğini ayrıntılı olarak açıklar. Bu protokolde korteks, hipokampus, talamus, hipotalamus, lateral septal çekirdek ve striatuma dönüşen bölgelerin transfeksiyonları için ayrıntılı talimatlar bulunmaktadır.

Korteks, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- ve Striatum özgü<em&gt; In Utero</em&gt; C57BL / 6 Fare Elektroporasyon

Nöropsikiyatrik bozuklukların patogenezinde yakın zamanda keşfedilen hastalıkla ilişkili genlerin rolü belirsizliğini korumaktadır. Modifiye edilmiş bir in utero elektroporasyon tekniği, büyük nöron popülasyonlarında gen transferine ve gen ekspresyon değişikliklerinin sosyal davranış üzerindeki nedensel etkilerinin incelenmesine izin verir.

Kemirgen Davranışı Üzerindeki Genetik Etkileri Sorgulamak için İkili İn Utero Elektroporasyonunu Kullanan Bir Boru Hattı

Bu protokolde, E7.5'teki fare amniyotik boşluğunun lentivirüs ile nasıl enjekte edileceğini açıklıyoruz, bu da tüm sinir plakasının düzgün bir şekilde transdüksiyonuna yol açarak, hayatta kalma veya embriyonik gelişim üzerinde minimum zararlı etkiye sahiptir.

Embriyonik Gün 7.5'te In Utero Nano-Enjeksiyon (NEPTÜN) ile Murin Nöral Plaka Hedefleme

Öğrenin fare embriyolarının hipotalamusuna in utero elektroporasyon yöntemiyle DNA transferi yaparak gen fonksiyonlarını nasıl manipüle edeceğinizi. Bu teknik, hipotalamik gelişim ve nöroloji araştırmaları için değerli bir yaklaşım sunar.

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi

Daha fazla video keşfet