Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar'da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik merkezi sinir sistemindeki nöronlarda gen ekspresyonunu değiştirmektir. Bu işlem, öncelikle zamanlanmış gebe dişilerin elde edilmesi ve cerrahi işleme hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, abdominal bir insizyon oluşturularak uterus kornuları açığa çıkarılır.

Embriyolar açığa çıkarıldıktan sonra, DNA lateral ventriküle, üçüncü ventriküle veya subretinal boşluğa enjekte edilir. Prosedürün son adımı, ped elektrotlar pozitif kutup tercih edilen transfeksiyon bölgesinin üzerine gelecek şekilde yönlendirilerek, rahim duvarı üzerinden embriyoya elektrik akımı uygulamaktır. Nihayetinde, immünofloresan mikroskopi yoluyla tline kelon dying kelon ve retinadaki nöroprogenitörlerin proliferasyonunu, migrasyonunu ve diferansiyasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin veya transgenik farelerin dejenerasyonu gibi mevcut yöntemlerin temel avantajı; hızlı olması, daha yüksek kapasiteli çalışmalara olanak tanıması ve maliyetinin daha düşük olmasıdır. Bu yöntem, hangi genlerin nöral progenitörleri, hücre proliferasyonunu, hücre kader belirlemesini, nöronal farklılaşmayı ve hücre migrasyonunu düzenlediği gibi nöral gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, birçoğu insanlarda bilişsel bozukluklarla ve davranışsal bozukluklarla sonuçlanan, merkezi sinir sistemi (CNS) gelişimindeki kusurların temelinde yatan genetik yolların daha iyi anlaşılmasına kadar uzanabilir ve merkezi sinir sistemi gelişimini anlamadaki faydasının ötesine geçebilir.

Bu teknik; gelişmekte olan periferik sinir sistemi, kalp ve plasenta gibi diğer organ sistemlerine de uygulanabilir. Ayrıca farelerdeki hastalık modellerinin yanı sıra civciv ve xip gibi diğer model organizmaların incelenmesinde de kullanılabilir. Genel olarak, bu tekniği ilk kez deneyen kişiler için başarının önündeki temel engel embriyo sağkalımıdır; embriyolar manipüle edilirken, enjeksiyon yapılırken ve dökülürken dikkatli olunmalıdır.

Bu yöntemle ilgili ilk fikri, embriyonik dönemde telensefalon ve retinada gen ekspresyonunu manipüle etmek için hızlı bir yönteme ihtiyaç duyduğumuzda edindik. Bu tekniği, 2001 yılında Developmental Biology dergisinde yayınlanan ve başlangıçta Sal tarafından tanımlanan tekniği modifiye ederek laboratuvarımızda geliştirdik. Ayrıca, bu protokolü gelişmekte olan dilonda da kurmak için bir crash lab ile birlikte çalıştık.

Enjeksiyon ve elektroporasyon aşamalarının öğrenilmesi, embriyoların çok dikkatli bir şekilde manipülasyonu gerektirmesi ve enjeksiyon bölgelerinin bazen çok küçük olabilmesi nedeniyle zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Örneğin, subretinal boşluk. Prosedürü bugün, Sherman Laboratuvarı'ndan doktora sonrası araştırmacı Rajivle göstereceğiz. Başlamak için tüm cerrahi aletleri temizleyin ve sterilize edin. Ardından, şırıngaları salin solüsyonu ve laktatlı ringer solüsyonu ile doldurup cerrahi alanda ısıtılmaları için bir ısıtma pedinin üzerine yerleştirin.

Bir ısıtma pedini %70 etanol ile sterilize edin ve ardından üzerine steril edilmiş, tüy bırakmayan ince bir gazlı bez yerleştirin. Isıtma pedini 37 °C'ye ayarlayın. Hayvanı küçük bir anestezi hücresine yerleştirin ve bir vaporizer aracılığıyla dakikada 1 L oksijen ile %5 isofluran vererek anestezi uygulayın.

İzofluran egzozunun bir geri kazanım sistemi kullanılarak toplandığından emin olun. Hayvanın solunumu derin ve düzenli hale geldiğinde, onu hazneden çıkarın. Ayak parmağı sıkıştırma ve göz kırpma reflekslerini kontrol edin.

Tam anesteziyi sağlamak için, anestezi altındaki hayvanı karnının üzerine yerleştirin ve cerrahi işlem sırasında %2,25 izofluran uygulamak için bir respiratör tüpü kullanın. Boyun arkasından, vücut ağırlığına kilogram başına 0,1 mg konsantrasyonda buprenorfinle deri altına enjeksiyon yapın.

Hayvanın solunumunu izlemeye devam edin ve gerekirse izofloran akışını ayarlayın. Ardından, anestezi altındaki hayvanın göğüs bölgesini bantlayın ve küt uçlu pens ile arka ayağı sıkarak retraksiyon yanıtını tekrar kontrol edin. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, alt tüylerin tamamen kaplandığından emin olacak şekilde karın bölgesine kalın bir krem tabakası yayın.

Kremi yaklaşık üç dakika boyunca bekletin ve kılların dökülüp dökülmediğini ara ara kontrol edin. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, steril bir gazlı bezi steril su ile ıslatın ve abdomen üzerindeki kılları silerek temizleyin. Ardından, insizyon bölgesini klorheksidin ve ek su ile sterilize edin.

Karın bölgesini temiz steril gazla kurulayın. Bu adımı, taze sterilize edilmiş pamuklu gaz kullanarak %70 ethanol ile tekrarlayın. Uterin kornuları açığa çıkarmak için cerrahi kıyafetler giyerek ameliyata hazırlanın.

Öncelikle, orta hattaki cilt altındaki soluk çizgi olan linea alba'yı bulun. Pens yardımıyla cildi abdominal duvardan uzaklaştırın ve kavisli pens ile makas kullanarak, cilt makasıyla karnın orta kısmından aşağıya doğru küçük, düz bir insizyon yapın. Aynı işlemi periton için de tekrarlayın. Peritonu pensle kavrayın.

Geri çekin ve ardından uterusu dışarı çıkarabilecek büyüklükte bir insizyon yapın. İnsizyonun üzerine, küçük dikey bir yarığı olan steril gazlı bezi yerleştirin ve sıcak steril salin ile nemlendirin. Daha sonra, forsepsi insizyonun içine sürün ve forsepsle insizyonu açık tutarak uterusu bulun.

Birinci ve ikinci görünür embriyolar arasından uterusu kavrayın ve uterus boynuzlarının her iki tarafını gazlı bezin üzerine çekin. Resorpisiyonu veya küçük vücut boyutuna sahip embriyoları not ederek embriyo sayısını sayın. Doğru sayıda DNA enjeksiyonu hazırlamak için uterus boynuzlarını salin ile ıslatın ve bir uterus boynuzunu dikkatlice karın içine geri yerleştirin.

Cerrahi iğneleri yüklemek için, ağızlığı takılı bir pipet kullanarak, metil yeşili boyası içeren 3 mg/mL endotoksin içermeyen DNA çözeltisinden 10 µL çekin ve DNA'yı cerrahi iğnenin içine boşaltın. Doldurulan ilk iğneyi mikromanipülatöre monte edin.

Ovaryuma en yakın olan embriyodan başlayarak enjektörü sabitleyin. Embriyoyu, enjeksiyonların ROS roll'dan kordal yöne doğru gerçekleşmesini sağlamak için decidua içinde nazikçe döndürerek yüzü karşıya bakacak şekilde konumlandırmak amacıyla dairesel pensler kullanın. Embriyonik beynin orta hattını belirlemek için bir fiber optik ışık kaynağı kullanın.

Rostral bölgelerdeki geniş yan ventriküllere dikkat edin. Embriyoyu kavisli pens ile sabit tutun ve doldurulmuş cerrahi iğneyi, beyne giriş açısı yaklaşık 45 derece olacak şekilde uterusun üzerine konumlandırın. Hızlı ve kararlı bir hareketle, iğne ucunu uterus duvarından geçirip embriyonik beynin yan ventrikülüne yerleştirmek için mikromanipülatör üzerindeki kadranı çevirin.

Ardından, mikro enjektörün ayak pedalına basın. DNA çözeltisini enjekte etmek için, metil yeşili boyasının embriyonik beyin ventriküllerine yayılmasıyla başarılı bir enjeksiyon kolayca gözlemlenebilir. DNA enjekte edildikten sonra, herhangi bir kırılmaya neden olmadan çıkarmak için iğneyi yavaşça geri çekin.

Enjekte edilmiş embriyoyu steril gazlı bezin üzerine yerleştirin ve sıcak salin ile iyice ıslatın. Uterusu, transfeksiyonun istenen bölgesinin üzerine yerleştirilmiş palet elektrodun pozitif kutbuyla kavrayın. Ardından, saniyede bir pals hızında, 40 ila 50 volt ve 50 milisaniye değerlerinde beş kare elektrik palsi uygulayın.

Enjeksiyonu yapılmış ve elektroporasyonu gerçekleştirilmiş embriyoyu koruyucu ıslak gazlı bezle örtün ve ardından bir sonraki embriyoya enjeksiyon yapmaya devam edin. Uterin korno içindeki istenen tüm embriyoların enjeksiyonu ve elektroporasyonu tamamlandığında, kornoyu dikkatlice vücut boşluğuna geri itin. Kalan embriyoların enjeksiyon ve elektroporasyon işlemine başlamak için ikinci uterin kornoyu çıkarın.

Tüm embriyolar uterus içerisine geri yerleştirildiğinde, abdominal kaviteye iki ila üç mililitre ılık salin ekleyin ve ardından peritonun yan kısımlarını açığa çıkarmak için karındaki gazlı bezi çıkarın. Siyah örgülü ipek hattı, hattı sternuma en yakın periton bölgesine sabitleyerek ve sabitleme noktasından uzaklaşacak şekilde dikiş atarak peritonu sütüre etmek için kullanın. Tüm sütürlerin sıkı olduğundan ve alttaki organların veya derinin peritona dikilmediğinden emin olun.

Kalan sütür hattını kesin ve atın. Cilt kapatma zımbaları kullanarak, forseps ile deri hattını sütür çizgisinin üzerinde kapatacak şekilde çekin. Alt taraftaki sütür hattını zımbalamaya veya cildi çok sıkı çekmemeye dikkat ederek cildi zımbalayın.

İşlem tamamlandığında, suture aracıyla buraya hafifçe bastırarak zımbaların sıkı olduğundan emin olun, GFP ekspresyonunu yönlendiren iki ekspresyon vektörü A-P-C-I-G, E 12 aşamasındaki gelişmekte olan neokortekse elektropore edilmiştir. Neokortikal gelişim ilerledikçe, apikal progenitörler ya sekonder bazal progenitörlere ya da post-mitotik nöronlara farklılaşır ve GFP ekspreslemesine devam ederler. Bu nöral hücreler daha sonra, kırmızı ile gösterilen nöral alt tipin tipik markerlarının ekspresyonu açısından analiz edilebilir.

E 12'de elektroporasyon uygulanan ve E 14'te diseke edilen bir embriyonun ön beyninin bu ventral görünümünde, elektroporasyon bölgesi E 14'teki yeşil epi floresansı ile belirtilmiştir. GFP ekspresyonu talamus, pre talamus ve hipotalamusta görülmektedir; bu durum, hedef bölgelerin başarıyla transfekte edildiğini göstermektedir. Kesikli kutu, bir ventriküler zon boyunca alınan kesitin konumunu işaretlemektedir.

Ventriküler bölgeye daha yakından bakıldığında, GFP hücrelerinin ventriküler bölgeden dışarı çıkarak manto bölgesine doğru göç ettiği görülmektedir. Hipotalamik çekirdeklerin oluşacağı bölgeler ile embriyonik retinanın da kolayca elektropore edilebildiği, E 15.5 tarihinde PCIC ile elektropore edilmiş E 16.5 embriyosundan alınan bu koronal kesitte gösterilmiştir. Burada, m cherry pozitif hücrelerin birikimi dış nöroblast tabakasına özgüdür ve gangliyon hücresi tabakasındaki Brn3b pozitif retinal gangliyon hücrelerinde görülmez. Uzmanlaşıldığında, beklenmedik bir komplikasyon ortaya çıkmadığı sürece bu teknik 30 dakika içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, uygun steril tekniklerin kullanılması, embriyolarla çalışırken elin sabit tutulması ve gebe dişinin anestezi altına alınmasından önce gerekli tüm malzemelerin hazır bulundurulması önemlidir. Bu prosedürün ardından, elektropore edilmiş embriyolar yetişkinliğe kadar yaşatılabilir ve bu aşamada, embriyodaki belirli genlerin manipülasyonunun yetişkinlerdeki nöronal fonksiyonu nasıl etkilediğine dair ek soruları yanıtlamak için davranışsal ve fonksiyonel analizler gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirildiği günden bu yana bu teknik, MSS gelişimi alanındaki araştırmacıların farelerde in vivo gen fonksiyonlarını incelemelerinin önünü açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, embriyonik nöral tüpe yabancı DNA'nın nasıl aktarılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Spesifik olarak, hamile bir dişinin cerrahiye nasıl hazırlanacağını gösteriyoruz. Uterusu açığa çıkarın, DNA enjekte edin ve embriyoya elektroporasyon uygulayın.

İzoflor ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken bir geri kazanım sistemi gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.