Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar'da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

Bu prosedürün genel amacı, nöron embriyonik merkezi sinir sistemindeki gen ekspresyonunu değiştirmektir. Bu, önce zamanlanmış hamile kadınların elde edilmesi ve ameliyata hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Rahim boynuzları daha sonra bir karın kesisi oluşturularak açığa çıkarılır.

Embriyolar açığa çıktıktan sonra, DNA lateral ventriküle, üçüncü ventriküle veya subretinal boşluğa enjekte edilir. Prosedürün son adımı, rahim duvarı boyunca embriyoya bir elektrik akımı uygulamak ve kürek elektrotlarını, pozitif kutup tercih edilen transfeksiyon bölgesine yerleştirilecek şekilde yönlendirmektir. Sonuç olarak, immünofloresan mikroskobu ile tline kelon ölen kelon ve retinadaki nöro progenitörlerin çoğalmasını, göçünü ve farklılaşmasını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin veya transgenik farelerin dejenerasyonu gibi mevcut yöntemlerin ana avantajı, hızlı olması, daha yüksek verimli çalışmalara izin vermesi ve daha düşük bir maliyete sahip olmasıdır. Bu yöntem, hangi genlerin nöral progenitörü, hücre proliferasyonunu, hücre kaderi spesifikasyonunu, nöronal farklılaşmayı ve hücre göçünü düzenlediği gibi nöral gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin sonuçları, birçoğu bilişsel bozulmaya neden olan ve insanlarda davranışsal bozukluklar olan CNS gelişimindeki kusurların altını çizen genetik yolların daha iyi anlaşılmasına doğru uzanabilir Merkezi sinir sistemi gelişimini anlamadaki kullanışlılığının ötesinde.

Bu teknik, gelişmekte olan periferik sinir sistemi, kalp ve plasenta gibi diğer organ sistemlerine de uygulanabilir. Farelerde hastalık modellerinin yanı sıra civciv ve xip gibi diğer model organizmalarda da uygulanabilir. Genel olarak, bu tekniğe yeni başlayan bireyler için başarının önündeki birincil engel embriyodur Embriyoları manipüle ederken, enjekte ederken ve gözeneklerken hayatta kalma bakımı alınmalıdır.

Bu yöntem için ilk olarak, embriyonik, telensefalon ve retinadaki gen ekspresyonunu manipüle etmek için hızlı bir araca ihtiyaç duyduğumuzda aklımıza geldi. Bu tekniği laboratuvarımızda, ilk olarak Sal tarafından tanımlanan ve 2001 yılında Developmental Biology dergisinde yayınlanan tekniği değiştirerek geliştirdik. Ayrıca, gelişmekte olan dilonda da bu protokolü oluşturmak için bir çarpışma laboratuvarı ile birlikte çalıştık.

Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü enjeksiyon ve elektroporasyon adımlarının öğrenilmesi zordur, çünkü embriyoların çok dikkatli bir şekilde manipüle edilmesini gerektirirler ve bazen enjeksiyon bölgeleri çok küçük olabilir. Örnek, subretinal boşluk Bugün prosedürü gösteren, Sherman'ın Laboratuvarı'ndan bir doktora sonrası olan Rajiv olacak Tüm cerrahi aletleri temizlemeye ve sterilize etmeye başlamak. Daha sonra, şırıngaları salin solüsyonu ve emzirilmiş zil solüsyonu ile doldurun ve cerrahi alanda ısınması için bir ısıtma yastığına yerleştirin.

Bir ısıtma yastığını% 70 etanol ile sterilize edin ve ardından sterilize edilmiş gevşek daha az gazlı bezle örtün. Isıtma yastığını 37 santigrat dereceye ayarlayın. Hayvanı küçük bir anestezik odaya yerleştirin ve bir buharlaştırıcı aracılığıyla dakikada bir litre oksijenle% 5 flor verilerek uyuşturun.

Bir süpürme sistemi kullanarak flor egzozunu topladığınızdan emin olun. Hayvanın nefesi derin ve düzenli olduğunda, onu odadan çıkarın. Ayak parmağınızı kıstırma ve göz kırpma reflekslerini kullanın.

Tam anestezi sağlamak için. Anestezi uygulanmış hayvanı karnına yerleştirin ve ameliyat sırasında %2.25 buz flor vermek için bir solunum tüpü kullanın. Vücut ağırlığının kilogramı başına 0.1 miligram konsantrasyonda buprenorfini ense kısmında deri altına enjekte edin.

Hayvanın solunumunu izlemeye devam edin ve gerekirse flor akışını ayarlayın. Daha sonra anestezi uygulanmış hayvanın göğsünü bantlayın ve arka ayağı künt forseps ile sıkıştırarak geri çekilme tepkisi olup olmadığını tekrar kontrol edin. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, alt kürkün tamamen kaplandığından emin olarak karın üzerine kalın bir krem tabakası sürün.

Kremi yaklaşık üç dakika bekletin ve epilasyon için aralıklı olarak kontrol edin. Steril bir bez kullanarak, steril bir gazlı bezi steril suyla ıslatın ve saçları karın bölgesinden silin. Ardından, insizyon bölgesini klorheksidin ve daha fazla su ile sterilize edin.

Karnı temiz steril gazlı bezle kurulayın. Taze sterilize edilmiş pamuklu gazlı bez kullanarak% 70 etanol ile bu adımı tekrarlayın. Rahim boynuzlarını ortaya çıkarmak için cerrahi kıyafet giyerek ameliyata hazırlanın.

İlk olarak, orta hatta cilt altındaki soluk çizgi olarak lineer alba'yı bulun Forseps kullanarak, cildi karın duvarından uzaklaştırın ve kavisli forseps ve makas kullanarak cilt makası ile orta karın bölgesinden aşağıya doğru küçük düz bir kesi kesin. İşlemi periton ile tekrarlayın. Peritonu forseps ile kavrayın.

Çekin ve ardından uterusu çekecek kadar büyük bir kesi kesin. Kesi üzerine küçük bir dikey yarık ile steril gazlı bez yerleştirin ve ılık steril tuzlu su ile nemlendirin. Daha sonra, forsepsleri insizyona kaydırın ve insizyonu forseps ile açık tutan uterusu bulun.

Birinci ve ikinci görünür embriyolar arasındaki uterusu kavrayın ve uterus boynuzlarının her iki tarafını gazlı bezin üzerine çekin. Herhangi bir rezorpsiyon veya küçük vücut büyüklüğüne sahip embriyoları not eden embriyo sayısını sayın. Doğru sayıda DNA enjeksiyonu hazırlamak için, rahim boynuzlarını tuzlu su ile ıslatın ve bir rahim boynuzunu dikkatlice karın içine geri koyun.

Cerrahi iğnelerden nefret etmek için, mililitre başına 10 mikrolitre üç miligram çekmek için takılı bir ağızlık ile yukarı çekilmiş bir pipet kullanın. Metil yeşil boya içeren endotoksin içermeyen DNA çözeltisi ve DNA'yı cerrahi bir iğneye atın. İlk doldurulmuş iğneyi mikro manipülatöre monte edin.

Yumurtalığa en yakın embriyodan başlayarak enjektöre bağlı durun. Desidua içindeki embriyoyu nazikçe döndürmek için dairesel forseps kullanın, böylece yüzü öne doğru konumlandırılır ve enjeksiyonların bir ROS rulosunda kordal yönde gerçekleşmesine izin verir. Embriyonik beynin orta hattını tanımlamak için bir fiber optik ışık kaynağı kullanmak.

Rostral bölgelerdeki yan büyük lateral ventriküllere dikkat edin. Embriyoyu kavisli forseps kullanarak yerinde tutun ve doldurulmuş cerrahi iğneyi beyne giriş açısı yaklaşık 45 derece olacak şekilde uterusun üzerine yerleştirin. Hızlı ve sabit bir hareketle, iğne ucunu rahim duvarından ve embriyonik beynin lateral ventrikülüne sokmak için mikro manipülatör üzerindeki kadranı çevirin.

Ardından, mikro enjektörün ayak tabanına basın. DNA çözeltisini enjekte etmek için, metil yeşil boyanın embriyonik beyin ventrikülleri boyunca yayılmasıyla başarılı bir enjeksiyon kolayca görselleştirilir. Artık DNA enjekte edildiğine göre, kırılmaya neden olmadan çıkarmak için iğneyi yavaşça geri çekin.

Enjekte edilen embriyoyu steril gazlı bez üzerine yerleştirin ve ılık tuzlu su ile iyice ıslatın. İstenilen transfeksiyon bölgesi üzerine yerleştirilen kürek elektrodunun pozitif kutbu ile uterusu kavrayın. Ardından, saniyede bir darbe hızında 40 ila 50 volt ve 50 milisaniye arasında beş kare elektrik darbesi verin.

Enjekte edilen ve elektro dereceli embriyoyu koruyucu ıslak gazlı bezle örtün ve ardından bir sonraki embriyoyu enjekte etmeye devam edin. Rahim boynuzunda istenen tüm embriyoların enjekte edilmesi ve elektro peringinin tamamlanmasının ardından, dikkatlice vücut boşluğuna geri itin. Kalan embriyoların enjeksiyonuna ve elektroporasyonuna başlamak için ikinci uterus boynuzunu çıkarın.

Tüm embriyolar uterusun içine geri döndüğünde, karın boşluğuna iki ila üç mililitre ılık salin ekleyin ve ardından peritonun kenarlarını ortaya çıkarmak için gazlı bezi karından çıkarın. Çizgiyi sternuma en yakın periton üzerine sabitleyerek ve ankrajdan dikmeye devam ederek peritonu dikmek için siyah örgülü ipek çizgi kullanın. Tüm dikişlerin sıkı olduğundan ve karın zarına altta yatan herhangi bir organ veya deri dikilmediğinden emin olun.

Kalan dikiş hattını klipsleyin ve atın. Cilt kapatma zımbaları kullanarak forseps ile kapatılan cildi dikiş hattı üzerinden çekin. Altındaki dikiş hattını zımbalamamaya veya cildi çok sıkı çekmemeye dikkat ederek cildi klipsleyin.

Bitirdikten sonra, buradaki dikiş aletiyle hafifçe bastırarak zımbaların sıkı olduğundan emin olun, GFP'nin ekspresyonunu yönlendiren A-P-C-I-G iki ekspresyon vektörü, E 12'de gelişmekte olan neokortekse elektropore edilmiştir. Neokortikal gelişim ilerledikçe, apikal progenitörler ya ikincil bazal progenitörlere ya da post mitotik nöronlara farklılaşır ve GFP'yi eksprese etmeye devam eder. Bu nöral hücreler daha sonra kırmızı ile gösterilen nöral alt tipin tipik belirteçlerinin ekspresyonu için analiz edilebilir.

E 12'de elektropore edilmiş ve E 14'te diseke edilmiş bir embriyonun ön beyninin bu venal görünümünde, elektroporasyonlu bölge E 14 tarafından yeşil epi floresan ile gösterilir. Talamus, pretalamus ve hipotalamusta GFP ekspresyonu görülür ve ölmekte olan likik bölgelerin başarılı bir şekilde transfekte edildiğini gösterir. Çizgi kutusu, bir ventriküler bölgeden geçen bölümün konumunu işaretler.

Ventriküler bölgeye daha yakından bir bakış, GFP hücrelerinin ventriküler bölgeden manto bölgesine göçünü gösterir. Hipotalamik çekirdeklerin oluşacağı yerde, embriyonik retina da bu koronal kesitte gösterildiği gibi, E 15.5'te PCIC ile elektroporasyonlu bir E 16.5 I yoluyla kolayca elektropore edilir. Burada, m kiraz pozitif hücrelerin birikimi dış nöroblast tabakasına özgüdür ve ganglion hücre tabakasındaki üç B pozitif retinal ganglion hücresinde B rrn görülmez Bir kez ustalaştıktan sonra, beklenmedik bir komplikasyon ortaya çıkarsa bu teknik 30 dakika içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, uygun steril teknikler kullanmak, embriyoları manipüle ederken sabit bir el kullanmak ve hamile kadını anestezi altına almadan önce gerekli tüm malzemeleri hazır bulundurmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, elektro örgülü embriyoların yetişkinliğe kadar yaşamasına izin verilebilir, bu noktada embriyodaki belirli genlerin manipülasyonunun nöronal fonksiyonu nasıl etkilediğine dair ek soruları yanıtlamak için davranışsal ve fonksiyonel tahliller gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden bu yana, bu teknik, CNS geliştirme alanındaki araştırmacıların farede in vivo gen fonksiyonunu keşfetmelerinin yolunu açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, yabancı DNA'nın embriyonik nöral tüpe nasıl sokulacağını iyi anlamış olmalısınız. Özellikle, hamile bir kadını ameliyata nasıl hazırlayacağınızı gösteriyoruz. Uterusu açığa çıkarın, DNA enjekte edin ve embriyoyu elektrolit haline getirin.

Flor ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken süpürme sistemi gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.