Name: Cilt Mekanizmaları belirleme Sipariş Değişken konsantrasyon İzotermal Titrasyon Kalorimetre Veri Kümeleri toplanıyor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-07T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Öğrenin, izotermal titrasyon kalorimetrisi kullanarak makromolekül-ligand bağlanma modellerini belirlemeyi ve termodinamik parametreleri çıkarmayı. Bu yöntem biyofiziksel ve biyokimyasal araştırmalarda bağlanma mekanizmalarını anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (CIHR), Ulusal Bilim ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve bir CIHR eğitim bursu bursu (LF) tarafından desteklenmiştir. Biz AAC için Prof. Gerard D. Wright (McMaster Üniversitesi, Kanada) (6)-Ii ifade plazmid teşekkür ederiz.

1. Stok çözelti hazırlanması <ol><li> Ilgi makromolekül arındırın. (Bu durumda, başka rapor gibi aminoglikozid N-6'-asetiltransferaz-Ii (AAC6' Ii), izole edilmiştir. 13) </li><li> 4 litre diyaliz tampon hazırlayın. (Bu durumda 25 mM 4 - (2-hidroksi)-1-piperazineethanesulfonic asit (Hepes MW 238,3 g / mol), 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA, 292,2 MW) içeren, pH 7.5.) </li><li> Protein AAC (6 ')-Ii örneği (400 mcM az 5 ml) kullanılan diyaliz tampon (3 x 1.3 L) diyalize olmalıdır Dialyze. Son diyaliz solüsyonu makine durulama ve örnekler sulandırmak için tutulur. </li><li> 0.45 mikron selüloz filtre ile son diyaliz solüsyonu Filtresi ve 4 ° C'de saklanan 'Çalışan tampon' olarak sevk edilecektir </li><li> Akan tamponu ile iyice durulanması, 0.2 mikron şırınga filtre süzülür protein çözüm. Standart bir test (Bradford, Lowry, vb) veya UV absorbans kullanarak protein nihai konsantrasyonu ölçün. Uzun vadeli istikrar en üst düzeye çıkarmak için protein saklayın. (AAC (6 durumda)-Ii dondurma ve çözme sonra faaliyet korumak değildir ')-Ii, bu depolama 4 ° C AAC (6 anlamına gelir'). </li><li> Tampon çalışan 4,0 mg eriterek asetil koenzim A 25 mM stok solüsyonu (AcCoA, ligand, 809,57 MW) 200μL hazırlayın. , -78 Anda Freeze ° C Kullanıma hazır olana kadar. </li><li> Tüm protein ve ligand örnekleri, konsantrasyon rastgele örnek-örnek dalgalanmaları en aza indirmek için, aynı stok çözümleri geliyor olmalıdır. Tüm değişken-c veri kümesi üzerinde protein konsantrasyonu için tek bir düzeltme faktörü analiz ayarlanır. 10 </li></ol> 2. ITC numunelerin hazırlanması <ol><li> 2 mL nihai hacmi ile 64 arasında bir c değeri enzim çözeltisi seyreltilir. (AAC (6 ')-Ii olması durumunda, bu 192 mcM karşılık gelir.) </li><li> Buz su ligand (AcCoA) stok solüsyonu hızla çözünme. </li><li> Bir AcCoA çözüm 0.5 ml 10 kat daha fazla konsantre sonra bu durumda protein bağlayıcı sitelerinin sayısı, tampon çalışan 420 mcL AcCoA stok solüsyonu 80 mcL seyreltilmesi ile 4 mM. Hazırlayın Bir pipetle dolum tüpü içine aktarın. Hızla -78 ° C AcCoA stok solüsyonu geri </li><li> Degas bir sıcaklık 1 ile 5 dakika boyunca protein ve vakum altında çözümler ° C istenilen çalışan sıcaklık altında (19 ° C). </li></ol> 3. Şırınga ayarlama 14 <ol><li> Önceden monte edilmiş şırınga kelepçe sahibi olarak aynı yüksekliğe kadar şırınga tutucu ile enjeksiyon şırınga takın. </li><li> Şırınga sahibinin alt sıkıca bastırılır kadar enjeksiyon şırınga üzerinden ikinci şırınga kelepçe besleyin. Sağlanan 0.050 "Tükenmez Hex Sürücü ile kelepçe yavaşça sıkın. </li><li> Şırınga tutucu pipet tutucu içine yerleştirin. </li><li> Pipet enjektör enjeksiyon enjektör içine yavaşça kaydırın. Piston ucu şırınganın deliğe doğrudan beslenen emin olun. Bir kez tam yerleştiğinden, pipet enjektör içine şırınga sahibinin kilitleme yaka vida. </li></ol> 4. 14 örnek hücre yükleme <ol><li> Tampon çalışan en az 50 ml örnek hücre yıkayın ve uzun Needled 2.5 ml cam şırınga kullanarak kalan herhangi bir sıvı kaldırmak. </li><li> Yavaş yavaş, temiz ve kuru uzun Needled 2.5 ml şırınga içine protein örnek solüsyon en az 1.8 ml çizin. Kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olun. </li><li> Iğne örnek hücre dikkatlice yerleştirin ve hafifçe hücrenin altındaki dokunun. Ucu hafifçe kaldırın (~ 1 mm) ve hücre içine aşırı sıvı örnek hücrenin üst üstünde görünür oluncaya kadar yavaşça AAC (6 ')-Ii çözüm enjekte. </li><li> Taşma sıvı kalıntıları sağlarken 1 cm iğne yavaşça kaldırın. Hızla geri çekilmesi ve Örnek hücresi içinde sıkışan kabarcıkları kaldırmak için çözüm küçük bir miktar (~ 0.25 ml) enjekte edilir. </li><li> Tüm çözüm taşması çıkarın. Bu örnek hücre içine hafifçe taşması kenarı boyunca iğne sürgülü elde edilir. Şırınga ucu bir çıkıntıya vuracaktır, bu, çalışan bir çözüm için arzu yüksekliği. Bu çizginin üstünde oturan tüm sıvı çıkarın. </li></ol> 5. Yükleme ve enjeksiyon şırınga vadede 14 başlatılması <ol><li> Plastik tüp yükleme şırınga dolgu portuna takın. </li><li> Alt-üst dolgu liman piston ucu. </li><li> Pipet tutucu altındaki tüp dolum pipet AcCoA çözüm yerleştirin. Şırınga ucu dolum tüpü alt temas etmemelidir. </li><li> Küçük bir miktar yükleme şırınga tüp girene kadar yavaşça enjektöre çözüm çizin. </li><li> Piston ucu tıklatın ve Kapat Dolgu Port düğmesine düşürerek doldurma portu kapatın. Temizle ve dolum, herhangi bir hava kabarcığı kaldırmak için Temizle-&gt; Yedek düğmesine 3 kez tıklayarak yükleme sırasında tuzak haline olabilir. </li><li> Pipet tutucu dolum tüpü çıkarın ve şırınga ucu hafifçe silin. </li><li> Örnek hücre içine pipet montaj ve hafifçe daha düşük şırıngaya çekin. Şırınga kolayca viraj gibi yavaş yavaş devam edin, büyük bir titizlikle ihtiyaç vardır. Şırınga tamamen yaka kilitleme baz bastırarak takılı olduğundan emin olun. </li><li> İstenen çalışan sıcaklığı (20 ° C Bu durumda) ayarlayın ve (bu durumda 20μcal/sec) beklenen maksimum enjeksiyon ısı akışı biraz daha fazla bir referans güç seçin. </li><li> İstenen enjeksiyon hacimleri ve gecikmeler Programı. (Bu durumda, 28 enjeksiyonları istihdam edilmiştir. Ilk enjeksiyonu 60 sn gecikme ile 2 mcL hacmi vardı. Sonraki tüm enjeksiyonları ile 10 330 ler gecikmeler mcL hacimleri vardı.) </li></ol> 6. Müteakip çalışır <ol><li> Sonraki tüm çalışır 2,4,8,16 bir faktör AAC (6 ')-Ii ve AcCoA konsantrasyonları azaltırken, 2-5 arasındaki adımları tekrarlayın ve 32. </li></ol> 7. Veri Analizi <ol><li> Küresel bağlayıcı parametreleri tek bir set tüm izotermleri uyan uyan yordamı kullanın, daha önce 10 tarif . </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar Temsilcisi veriler Şekil 1'de gösterilmiştir. Izotermleri şekiller konsantrasyon farklı olmalıdır. Üstü için keskin geçişleri bekleniyor c-değerleri (yani yüksek protein ve ligand konsantrasyonları) (Şekil 2). AAC (6 ')-Ii durumda, iki site sıralı modeli açıklayan iki takım, ayarlanabilir stoichiometries ile aynı, bağımsız sitelerin birden daha iyi bir uyum sağlar. <img src="/files/ftp_upload/2529/2529fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1, AAC (6 ')-Ii (192 mcM) AcCoA titrasyonu (3.86 mM) tarafından üretilen İzotermleri . A) Ham ITC iz. B) 2-sitesi sıralı uyum (bağlama parametreleri (kareler) belirlemek için kullanılan Entegre değerleri -). <img src="/files/ftp_upload/2529/2529fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> AcCoA Şekil 2 ITC izotermleri değişik konsantrasyonlarda AAC (6 ')-Ii içine titre. Deneysel veriler (açık çevrelerin), 2-setleri-siteleri bağımsız model (kesikli kırmızı) ve 2-site sıralı modeli (düz mavi) için uygun. 2-site sequentional modeli açıkça daha iyi bir genel anlaşma verir. Istihdam konsantrasyonları), 6 mcM, 0,25 mM, B) 12 mcM, 0.25 mM, C) 24 mcM, 0.5 mM D) 48 mcM, 1.0 mM, E) 96 mcM, 1.9 mM ve F) 196 mcM sırasıyla AAC (6 ')-Ii ve AcCoA için 3.86 mM.

<ol><li>Cliff, M. J., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2002+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2002 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 16, 383-391 (2003).</li>
<li>Cliff, M. J., Gutierrez, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2003+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2003 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 17, 513-523 (2004).</li>
<li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2004%3A+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2004: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 19, 79-89 (2006).</li>
<li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2005%3A+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 20, 4-14 (2007).</li>
<li>Okhrimenko, O. ksana, J, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2006+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 21, 1-19 (2008).</li>
<li>Bjelic, S., Jelesarov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2007+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2007 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 21, 289-312 (2008).</li>
<li>Leavitt, S., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+protein+binding+energetics+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Structural Biology. 11, 560-566 (2001).</li>
<li>Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. -N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+binding+constants+and+heats+of+binding+using+a+new+titration+calorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter.</a> Analytical Biochemistry. 179, 131-137 (1989).</li>
<li>Capaldi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+X-Ray+Structure+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+Ileal+Bile+Acid-Binding+Protein+Reveals+the+Presence+of+Binding+Sites+on+the+Surface+of+the+Protein+Molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The X-Ray Structure of Zebrafish (Danio rerio) Ileal Bile Acid-Binding Protein Reveals the Presence of Binding Sites on the Surface of the Protein Molecule.</a> Journal of Molecular Biology. 385, 99-116 (2009).</li>
<li>Freiburger, L. A., Auclair, K., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+Protein+Binding+Mechanisms+by+Variable-c+ITC%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Elucidating Protein Binding Mechanisms by Variable-c ITC.</a> ChemBioChem. 10, 2871-2873 (2009).</li>
<li>Wybenga-Groot, L. E., Draker, K. -a, Wright, G. D., Berghuis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+an+aminoglycoside+6%27-N-acetyltransferase%3A+defining+the+GCN5-related+N-acetyltransferase+superfamily+fold%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of an aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase: defining the GCN5-related N-acetyltransferase superfamily fold.</a> Structure. 7, 497-507 (1999).</li>
<li>Draker, K., Northrop, D. B., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Mechanism+of+the+GCN5-Related+Chromosomal+Aminoglycoside+Acetyltransferase+AAC%286%27%29-Ii+from+Enterococcus+faecium%3A+Evidence+of+Dimer+Subunit+Cooperativity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic Mechanism of the GCN5-Related Chromosomal Aminoglycoside Acetyltransferase AAC(6')-Ii from Enterococcus faecium: Evidence of Dimer Subunit Cooperativity.</a> Biochemistry. 42, 6565-6574 (2003).</li>
<li>Wright, G. D., Ladak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+and+characterization+of+the+chromosomal+aminoglycoside+6%27-N-acetyltransferase+from+Enterococcus+faecium%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase from Enterococcus faecium.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 41, 956-960 (1997).</li>
<li>MicroCal. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ITC+Data+Analysis+in+Origin%22">ITC Data Analysis in Origin</a>. , 7 edn, MicroCal. (2004).</li>
</ol>

Bu değişken c uydurma analitik bir kısmı daha önce ayrıntılı 10 tarif edilmiştir . İşte biz, bu yaklaşım için uygun değişken-c veri setleri toplama pratik yönlerini rapor. Bu protein ve ligand örnekleri aynı stok çözümleri çizilmiş olması esastır. Bu nedenle yeterli stok solüsyonu deneylerin tüm seriyi tamamlamak için başlangıçta hazır olduğunu önemlidir. Bu oranı AAC (6 &#39;)-Ii sağlar ve AcCoA tüm deneyler arasında sürekli ve rastgele bir örnek-örnek bazında konsantrasyon dalgalanmaları azaltır. <p cla...

<table><tbody><tr><td>Asetil ko&amp;#8211;nzim A (AcCoA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2056</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 2 Diyaliz Tüpü</td><td>Spectrum Labs</td><td>132678</td><td></td></tr><tr><td>Steril Şırınga Filtresi (0.2 &amp;mu;m)</td><td>VWR international</td><td>281445-477</td><td></td></tr><tr><td>Selüloz Nitrat Membran Filtreler (0.45 &amp;mu;m)</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>7184-004</td><td></td></tr><tr><td>VP-ITC</td><td>MicroCal</td><td>VP-ITC</td><td>Ölçümler için kullanılan mikrokalorimetre</td></tr><tr><td>ThermoVac</td><td>MicroCal</td><td>USB Thermo Vac</td><td>Sıcaklık Kontrollü Gaz Giderme İstasyonu</td></tr></tbody></table>

cilt mekanizmaları belirleme sipariş değişken konsantrasyon İzotermal titrasyon kalorimetre veri kümeleri toplanıyor

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Izotermal titrasyon kalorimetri (ITC) yaygın bir ana makromolekül bir ligand bağlama ile ilgili termodinamik parametreleri belirlemek için kullanılır. ITC konak / ligand etkileşimleri çalışmak için ortak spektroskopik yaklaşımlar üzerinde bazı avantajları vardır. Örneğin, serbest ya da iki bileşenden etkileşime girdiğinde emilir ısı doğrudan ölçülür ve herhangi bir eksojen gazetecilere gerektirmez. Bu nedenle bağlayıcı entalpi ve dernek sabiti (Ka), ITC verileri doğrudan elde edilen ve entropik katkısını hesaplamak için kullanılabilir. Ayrıca, izoterm şekli c-değeri ve katılan mekanistik model bağlıdır. C-değeri olarak tanımlanır c = n [P] TKA, [P] t protein konsantrasyonu ve n ev sahibi içinde ligand bağlayıcı sitelerinin sayısı. Pek çok durumda, belirli bir ligand için birden fazla bağlayıcı siteleri denk olmayan ve ITC, her bir bağlanma yeri için termodinamik bağlayıcı parametrelerinin karakterizasyonu sağlar. Ancak bu doğru bağlayıcı model gerektirir. Bu seçim, farklı modeller aynı deneysel verilere uygun eğer sorunlu olabilir. Biz daha önce bu sorunu c-değerleri çeşitli deneyler yaparak atlatılabilmişlerdir olabileceğini göstermiştir. C-değerleri farklı elde birden fazla izotermleri ayrı model aynı anda bir uyum vardır. Doğru model sonraki tüm değişken c veri kümesi arasında uyum iyiliği göre tespit edilir. Bu süreç, aminoglikozid direnci neden olan enzimi aminoglikozid N-6&#39;-asetiltransferaz-Ii (AAC (6 &#39;)-Ii) burada uygulanır. Bizim metodoloji herhangi bir sistem için geçerli olmakla birlikte, bu stratejinin gerekliliği daha iyi allostery veya cooperativity gösteren bir makromolekül-ligand sistemi ile gösterdi ve farklı bağlama modelleri aynı veri aslında aynı uyan. Bildiğimiz kadarıyla, piyasada bulunan böyle bir sistem vardır. AAC (6 &#39;)-Ii, iki alt arasındaki cooperativity gösteren iki aktif siteleri içeren bir homo-dimer. Ancak tek bir c-değeri elde ITC verileri eşit derecede iyi iki-setleri-siteleri bağımsız model ve sıralı bir iki yerinde (kooperatif) modeli en az iki farklı modelleri uygun olabilir. Yukarıda açıklandığı gibi c-değeri değişen sayesinde, doğru bağlama modelini AAC (6 &#39;)-Ii iki site sıralı bağlama modelini olduğunu kurulmuştur. Burada, biz ITC deneyler yaparken değişken c analizler için uygun veri setleri elde etmek için atılması gereken adımları açıklar.

ITC, ev sahibi bir ligand bağlama eğitimi için güçlü bir araçtır. Ancak karmaşık sistemler, çeşitli modeller eşit derecede iyi veriler uygun olabilir. Burada anlatılan yöntem kompleks sistemler için uygun bir bağlama modelini aydınlatmak ve ilgili termodinamik parametreleri ayıklamak için bir araç sağlar.

Cilt Mekanizmaları belirleme Sipariş Değişken konsantrasyon İzotermal Titrasyon Kalorimetre Veri Kümeleri toplanıyor

İzotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC), bir ligandın bir konakçıya bağlanmasıyla ilişkili termodinamik parametreleri belirlemek için yaygın olarak kullanılır...

Bu prosedürün genel amacı, bir makromolekülün ligandına bağlanmasını tanımlayan doğru fiziksel modeli belirlemek ve ilişkili termodinamik parametreleri saptamaktır. Bu işlem, öncelikle kapsamlı bir diyaliz yoluyla makromolekülün bir stok çözeltisinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, ilgili ligand son diyaliz tamponunda çözülür ve tüm bileşenlerin konsantrasyonları ikinci adımda belirlenir.Makromolekül ve ligand örnekleri, dikkatle bir dizi farklı konsantrasyona seyreltilir. Ardından, prosedürün son adımında bir dizi ITC izotermleri oluşturmak için hem ligand hem de proteinin çeşitli konsantrasyonlarında bir dizi izotermal titrasyon kalorimetrisi veya ITC deneyi gerçekleştirilir. Deney serisinin küresel analizi farklı fiziksel modeller kullanılarak yapılır ve genel olarak en iyi uyumu sağlayan model doğru model olarak belirlenir.Bugün size, protein moleküllerinin ligandlarına nasıl bağlandığı gibi biyofiziksel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilecek ve entropi, entalpi ve asosiyasyon sabitleri gibi bağlanma parametrelerinin doğru ölçümlerini sağlayabilecek bir yöntemi göstereceğim. Bu protokole başlamadan önce, ilgilenilen proteini saflaştırın; bu demonstrasyonda kul

collecting-variable-concentration-isothermal-titration-calorimetry

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Izotermal titrasyon kalorimetri orta bağlanma afiniteleri ile biyolojik sistemler için bağlayıcı termodinamik izlemek için kullanmak için genel bir protokol sunulmuştur.

Makromolekül-ligand Affinity Ölçüm İzotermal Titrasyon Kalorimetre

Bu video, bir biyomolekül ve bir ligand arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılan bir teknik olan diferansiyel taramalı kalorimetriyi göstermektedir. Bir DNA aptamer ve bir termolabil ligandın bağlanması, numuneye tekrarlanan ısıtma ve soğutma döngüleri uygulanarak ve termodinamik analiz için taramalar elde edilerek incelenir.

DNA Aptamer-Terponabil Ligand Etkileşimini İncelemek için Diferansiyel Taramalı Kalorimetri

Mikro Termoforosis (MST) yaygın olarak hücre lizatlarından hedef proteinin arıtılmadan bağlanma afinitesinin belirlenmesinde kullanılabilir. Protokol, GFP-kaynaşık proteini, denatüre edici olmayan koşullar hücre parçalama ve ligand arasında değişen konsantrasyonlarda varlığında MST sinyalinin tespiti arasında aşırı içerir.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Izotermal titrasyon kalorimetre önlemler ısı akışı serbest veya kimyasal reaksiyonlarda absorbe. Bu yöntem, enzim katalizi ölçmek için kullanılabilir. Bu yazıda, enstrümantal kurulumu için protokol, deneme çalışan ve veri analizi genel olarak anlatılmıştır, ve jack fasulye üreazla enzimatik üre hidroliz karakterizasyonu uygulanır.

Sıcak Biyolojik kataliz: İzotermal Titrasyon Kalorimetre enzimatik reaksiyonların Characterize

MicroScale Thermophoresis (MST), aptamer-hedef etkileşimlerini karakterize etmek için hassas bir teknolojidir. Bu el yazması, aptamer-küçük molekül etkileşimlerini karakterize etmek için bir MST protokolünü açıklamaktadır.

Mikro Termoforesis kullanarak ATP bir aptamer Bağlama Sitesi Haritalama

Titrasyon ELISA gerçekleştirmek için detaylı bir protokol açıklanmıştır. Ayrıca, yeni bir algoritma titrasyon ELISAs değerlendirmek için ve plaka immobilize microtiter reseptör için çözünür bir ligand bağlayıcı bir ayrışma sabiti edinmek için sunulmaktadır.

Titrasyon ELISA reseptör Ligand etkileşim ayrışma sabiti belirlemek için bir yöntem olarak

Mikro ölçekli termoforez, düşük malzeme maliyetiyle bağlanma sabitlerini hızlı bir şekilde elde eder. Etiketli veya etiketsiz mikro ölçekli termoforez ticari olarak temin edilebilir; Bununla birlikte, etiketsiz termoforez, floresan etiketler kullanılarak gerçekleştirilebilecek etkileşim ölçümlerinin çeşitliliğini sağlayamaz. Etiketli termoforez ölçümleri için bir protokol sağlıyoruz.

Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

Bu makale, peptitlere ve proteinlere bağlanan Cu(II)'nin termodinamiğini araştırmak ve ölçmek için elektronik absorpsiyon spektroskopisi ve izotermal titrasyon kalorimetrisinin kullanımına odaklanmaktadır.

Kromoforların Varlığında ve Yokluğunda Cu(II) ve Peptit Kalıntıları Arasındaki Bağlanma Etkileşimlerinin Ölçülmesi

Bu protokol, numune hazırlama, çalışma standartları ve numuneler dahil olmak üzere bir DNA aptamer ve tetrasiklin arasındaki bağlanmanın ilişkisini ve ayrışma kinetiğini analiz etmek için İzotermal Titrasyon Kalorimetrisinin (ITC) kullanımını açıklamaktadır.

İzotermal Titrasyon Kalorimetrisi Kullanılarak DNA Aptamer ve Tetrasiklinin Termodinamik ve Kinetik İlişkisinin Belirlenmesi

Belirli zaman noktalarında cerrahi yara biyokimyasal mediyatörler toplamak ve ölçmek için bir tekniktir.

Cerrahi Yaralar Nosiseptif ve İnflamatuar Arabulucular Toplama ve Ölçüm

Öğrenin, izotermal titrasyon kalorimetrisi kullanarak makromolekül-ligand bağlanma modellerini belirlemeyi ve termodinamik parametreleri çıkarmayı. Bu yöntem biyofiziksel ve biyokimyasal araştırmalarda bağlanma mekanizmalarını anlamak için değerlidir.

Cilt Mekanizmaları belirleme Sipariş Değişken konsantrasyon İzotermal Titrasyon Kalorimetre Veri Kümeleri toplanıyor

Daha fazla video keşfet