Cilt Mekanizmaları belirleme Sipariş Değişken konsantrasyon İzotermal Titrasyon Kalorimetre Veri Kümeleri toplanıyor

Bu prosedürün genel amacı, bir makromolekülün ligandına bağlanmasını tanımlayan doğru fiziksel modeli tanımlamak ve ilişkili termodinamik parametreleri belirlemektir. Bu, önce kapsamlı diyaliz yoluyla makromolekülün bir stok çözeltisinin hazırlanmasıyla elde edilir. İlgilenilen ligand daha sonra son diyaliz tamponunda çözülür ve tüm bileşenlerin konsantrasyonları ikinci adımda belirlenir.

Makromolekül ve ligand numuneleri, bir dizi farklı konsantrasyona dikkatlice seyreltilir. Daha sonra, prosedürün son adımında bir dizi ITC İzotermi üretmek için hem ligand hem de proteinin çeşitli konsantrasyonlarında bir dizi izotermal titrasyon kalorimetrisi veya ITC deneyi gerçekleştirilir. Deney serilerinin küresel analizi, farklı fiziksel modeller kullanılarak gerçekleştirilir ve en iyi genel anlaşmayı veren model doğru olarak belirlenir.

Bugün size, protein moleküllerinin ligandlarını nasıl bağladığı gibi biyofiziksel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilecek ve bu protokolün başlamasından önce entropi, entropi ve birleşme sabitleri gibi bağlanma parametrelerinin doğru ölçümlerini sağlayabilecek bir yöntem göstereceğim. İlgilenilen proteini saflaştırın, bu gösteride kullanılan makromolekül bir immüno-GLYCOSIDE N altı asal, ince bir transferaz bir I veya bir C altı prime bir I.To, dört litre diyaliz tamponu hazırlayın ve dört santigrat dereceye kadar soğutun. Daha sonra, küçük bir hacimde bir makromolekül çözeltisinin diyalize edilmesi.

Bu durumda, beş mililitre 400 mikromolar AAC C altı asal, bir göz 1.3 litre diyaliz tamponunda dört santigrat derecede. Bu, soğuk bir odada veya buzdolabında yapılabilir, her sekiz saatte bir taze tamponla değiştirilebilir ve toplam üç kez diyalize edilebilir. Son diyaliz solüsyonunu saklayın.

Son diyaliz çözeltisinin 750 mililitresini 0.45 mikronluk bir selüloz filtreden süzün ve dört santigrat derecede saklayın. Şimdi çalışan tampon olarak adlandırılan bu tampon, durulamalar için ve bir seyreltici olarak kullanılacaktır. Numuneler için, 0,2 mikronluk bir şırınga filtresini çalışan tamponla iyice durulayın.

Protein örneğini ve filtreyi uygulayın. Protein çözeltisini saklamadan önce numuneyi nazikçe konik bir tüpte toplayın, standart bir protein tahlili ile protein konsantrasyonunu belirleyin. Bu durumda, protein konsantrasyonu 280 nanometrede EMURENCE ile ölçülür ve enzim konsantrasyonu hesaplanır.

EXI proteomik sunucusundan üretilen bir sönme katsayısı kullanarak, proteini uzun vadeli stabiliteyi en üst düzeye çıkaracak şekilde saklayın. AAC C altı asal bir göz, donma ve çözülmeden sonra aktiviteyi korumadığı için dört santigrat derecede saklanmalıdır, daha sonra ligandı çözer ve tamponu çalıştırır. Bu gösteri için, dört miligram asetil koenzim A, 25 milimolar bir stok çözeltisi yapmak için 200 mikrolitre çalışma tamponunda çözüldü.

Bu ligand, ITC numunelerini hazırlamak için kullanıma hazır olana kadar eksi 78 santigrat derecede saklanabilir, ilk olarak, AAC altı asal bir I için yazılı protokolde açıklandığı gibi 64'lük bir C değeri elde etmek için enzim konsantrasyonunu hesaplayın. Bu konsantrasyonda iki mililitrelik bir makromolekül çözeltisi hazırlayın, stok çözeltisini filtrelenmiş çalışma tamponu FIA çökeltme ko-enzimi bir çözülme, asetal koenzim bir buzlu su banyosunda bir çözelti ile seyreltin. Asetal ko-enzim bir çözelti çözüldükten sonra, karıştırın, makromolekül konsantrasyonunu bağlanma bölgelerinin sayısı ile çarparak 10 ile çarparak ligand çözeltisinin konsantrasyonunu nazikçe hesaplayın.

Asetil ko-enzimini, 80 mikrolitre 25 milimolar ACE ko-enzimi, 420 mikrolitre çalışan tampona bir stok çözeltisi ekleyerek ve karıştırarak bir çözelti hazırlayın. Seyreltilmiş asetil ko-enzim ACE çözeltisini bir pipet doldurma tüpüne aktarın ve kalan 25 Milimolar stok çözeltisini saklama için eksi 78 santigrat dereceye geri getirin. C altı prime bir gözün ve ince bir ko-enzim olan A çözeltilerinin gazını 19 santigrat derecede beş dakika boyunca vakum altında boşaltın, bu da istenen deneysel çalışma sıcaklığının bir santigrat derece altındadır.

Enjeksiyon şırıngasını kurmak için, prem monteli şırınga kelepçesi tutucu ile aynı yükseklikte olana kadar şırıngayı bir şırınga tutucusundan geçirin. İkinci şırınga kelepçesini, şırınga tutucusunun altına sıkıca bastırılana kadar enjeksiyon şırıngasının üzerine besleyin. cl'yi yavaşça sıkınamp sağlanan 0.05 inç tükenmez altıgen sürücü ile.

Ardından, şırınga tutucuyu pipet tutucusuna yerleştirin. Pipet enjektörünü yavaşça enjeksiyon şırıngasının içine kaydırın ve piston ucunun doğrudan şırınganın deliğine beslendiğinden emin olun. Tam olarak yerleştirildikten sonra, şırınga tutucunun kilitleme bileziğini pipet enjektörüne vidalayın.

A a C altı prime tek gözlü protein numune çözeltisini yüklemeden önce, numune hücresini en az 50 mililitre çalışan tamponla yıkamak için cihazla birlikte verilen hücre yıkama sistemini kullanın. Uzun iğneli 2,5 mililitrelik cam şırınga ile aspirasyon yaparak kalan tamponu numune hücresinden çıkarın. İkinci bir temiz, kuru uzun iğne kullanarak çözeltileri gaz giderme vakumundan çıkarın.

2.5 mililitre şırınga. Şırıngaya en az 1.8 mililitre A a C altı prime tek göz protein örneğini dikkatlice çekin. Hava kabarcıklarını önlemek için dikkatli olun.

Şırınga protein numunesi ile yüklendikten sonra, iğneyi numune hücresine yerleştirin ve hücrenin altına hafifçe dokunun. İğneyi yaklaşık bir milimetre kaldırın ve numune hücresinin üst kısmında fazla sıvı görünene kadar numuneyi hücreye nazikçe enjekte edin. Sıkışan hava kabarcıklarının hücresini temizlemek için, çözeltinin taşmada kalmasını sağlarken iğneyi yaklaşık bir santimetre kaldırın ve yaklaşık 0,25 mililitre çözeltiyi hızla geri çekin ve enjekte edin.

Şimdi iğneyi taşma kenarı boyunca yavaşça yukarı doğru kaydırın. Numune kuyusunda, iğne bir çıkıntıya çarpacaktır. Çıkıntı, çalışan çözelti için istenen yüksekliği gösterdiğinden, bu çıkıntının üzerindeki tüm sıvıyı geri çekin.

Enjeksiyon şırıngasını yüklemek için, plastik tüp şişirme şırıngasını doldurma portuna takın ve piston ucunu doldurma portunun üstüne indirin. Şimdi DGAs ligand çözeltisinin pipet doldurma tüpünü pipet tutucunun altına yerleştirin. Şırınga ucunun doldurma tüpünün dibine temas etmediğini kontrol edin ve yükleme şırıngasının tüpüne küçük bir miktar girene kadar çözeltiyi yavaşça şırınganın içine çekin.

Ardından, piston ucunu indirerek doldurma portunu kapatın. Bu, doldurma portunu kapat düğmesine tıklanarak yapılır. Ardından, yükleme sırasında sıkışmış olabilecek hava kabarcıklarını çıkarmak için.

Boşalt yeniden doldurma düğmesine tıklayarak boşaltın ve yeniden doldurun. Toplam üç kez boşaltın ve yeniden doldurun. Boşaltma doldurma işlemi tamamlandıktan sonra, doldurma tüpünü pipet tutucusundan çıkarın ve şırınga ucunu laboratuvar kağıt mendiliyle nazikçe silin.

Şimdi pipet düzeneğinin şırıngasını numuneye indirin. Dikkatli olun ve iğne kolayca bükülebileceğinden yavaş ilerleyin. Kilitleme bileziğinin tabanına bastırarak şırınganın tam olarak yerleştirildiğinden emin olun.

Şırınga sabitlendikten sonra, istenen çalışma sıcaklığını ayarlayın ve beklenen maksimum enjeksiyon ısı akışından biraz daha büyük bir referans gücü seçin. Bu örnekte, çalışma sıcaklığı ve referans gücü olarak sırasıyla saniyede 20 santigrat derece ve 20 mikro kalori kullanılmıştır. Ardından istenen enjeksiyon hacimlerini ve gecikmelerini programlayın.

Burada, ilki iki mikrolitre hacme ve 62. gecikmeye sahip 28 enjeksiyon ve 332. gecikmeli 10 mikrolitre hacme sahip sonraki enjeksiyonlar kullanılır. Burada gösterilen deney, gerekli ek eğrileri oluşturmak için tek bir konsantrasyonda bir veri kümesi oluşturmak için temel sağlar. Bu işlemi azalan makromolekül ve ligand konsantrasyonları ile tekrarlayın.

Konsantrasyonlardaki hatayı en aza indirmek için tüm makromolekül ve ligand numunelerinin aynı stok çözeltisinden geldiğinden emin olun. Burada, 3.86 milimolar ligand asetil koenzim A'nın mikro molekülün 192 mikromolar arasına titrasyonundan üretilen ham izotermal titrasyon kalorimetri izi gösterilmektedir. A, A, C, altı, asal bir.

Bağlanma parametrelerini belirlemek için iki bölgeli ardışık uyum ile göz bütünleşik değerleri kullanıldı. Bu grafik, ACE Koenzim A ve AAC C altı Prime One Eye'ın çeşitli konsantrasyonlarında ITC tarafından üretilen izotermleri göstermektedir. Açık dairelerle temsil edilen deneysel veriler, hem iki site bağımsız modeline hem de iki site sıralı modele uygundu.

İki site sıralı modelinde daha iyi bir uyum görülür. Kullanılan protein konsantrasyonları ekteki metinde tanımlanmıştır. Bu prosedürü gerçekleştirirken, konsantrasyonlardaki değişiklik sonuçlarınız üzerinde ciddi bir etkiye sahip olabileceğinden, seyreltme konusunda çok hassas olmanız önemlidir.