Name: Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Keşfedin mezenkimal kök hücrelerin kardiyomiyojenik farklılaşmasını çevresel sinyallerle. Bu yöntem farmakolojik ajanlar yerine agregat oluşumu kullanarak fonksiyonel kardiyomiyosit benzeri hücreler üretir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar aşağıdaki personel üye teşekkür ve araştırma katkılarından dolayı personel: Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg ve Andrée Gauthier-Fisher. Bu eser Ontario araştırma fonu tarafından - araştırmada mükemmellik (ORF-RE, yuvarlak #7) ve Program A.ş. oluşturmak destek verdi

Hayvanları içeren tüm çalışmalar ARRIVE guidelines48'e göre yürütülmüş ve raporlanmıştır. Tüm çalışmalar kurumsal araştırma etik kurul onayı (REB number 454-2011, Sunnybrook Research Institute; REB 29889, Toronto Üniversitesi, Toronto, Kanada). Tüm hayvan prosedürleri, Üniversite Sağlık Ağı (Toronto, Kanada) Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı ve tüm hayvanlara, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu, 8. baskıya (Ulusal Sağlık Enstitüleri 2011) uygun olarak insancıl bakım verildi.
1. Doku Kültürü
<ol>
	<li>Kültür FTM HUCPVC'ler, terim HUCPVC'ler (önceden kurulmuş, her biri için n ≥ 3 bağımsız satır)42 ve %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin (P/S) kokteyli ile desteklenmiş alfa-minimum esansiyel ortamda (MEM) ticari olarak temin edilebilen BMSC'ler. Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unda sıçan primer kardiyomiyositleri ve MSC-kardiyomiyosit ko-kültürlerini kültürleyin:% 10 FBS ve% 1 P / S. içeren Besin Karışımı F-12 (DMEM-F1)
	NOT: Ortamı 0.2 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edin. Hazırlanan orta solüsyonları 4 °C'de 3 haftaya kadar saklayın.</li>
	<li>Hücre kültürlerini nemlendirilmiş inkübatörlerde (%95 bağıl nem, 37 °C ve %5 CO2) ve faz kontrast mikroskobu ile belirlenen %70-80 birleşmede geçişi koruyun. Kullanılan doku kültürü kabının boyutu için uygun hacimlerde ortam kullanın (ör., 10 cm'lik bir tabakta 10 mL ve 6 oyuklu doku kültürü plakasında oyuk başına 2 mL). Protokol süresince bu kültür koşullarını kullanın.</li>
	<li>Bir ayrışma enzimi çözeltisi (6 oyuklu bir plakada 2 mL / oyuk) kullanarak geçiş veya MSC-kardiyomiyosit ko-kültür oluşumu için MSC tek katmanlarını ayırın ve 37 ° C'de 4 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Ayrışmış hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Hücre peletini bozmadan süpernatanı aspire edin ve hücreleri, otomatik bir hücre sayacı kullanarak sayım için uygun bir kültür ortamının 1 mL'sinde yeniden süspanse edin. Hücreleri aşağıdaki protokol bölümlerinde açıklandığı gibi tohumlayın.</li>
</ol>
2. Primer Sıçan Kardiyomiyosit-MSC Ko-kültürlerinin Hazırlanması
<ol>
	<li>Primer kardiyomiyosit izolasyonu için kalp dokusu elde edin.
	<ol>
		<li>CO2 boğulması kullanarak sıçan yavrularını (doğumdan 5-6 gün sonra) ötenazi yapın. CO2 odalarını% 20 gaz değişimine ayarlayın (akış hızı = dakikada 0.2 x oda hacmi). Sıkışma refleksinin yokluğuyla exitus'u onaylayın.</li>
		<li>Sterilize edilmiş aletler (yani forseps ve kavisli makas) kullanarak ana kan damarlarını bağlayarak kulakçıkları çıkarın41. Kalpleri buz üzerinde %1 P/S (PBS-P/S) ile steril PBS içeren 50 mL'lik tüplere aktarın.</li>
		<li>Ventrikülleri ikiye bölün ve kanın buz üzerinde 10 mL PBS-P/S ile 10 cm'lik bir tabakta yıkanmasına izin verin. Kavisli makas kullanarak ventriküler duvarları küçük parçalar halinde (çap = 2-3 mm) kesin.</li>
		<li>10-12 hayvanın kalp parçalarını serolojik bir pipet kullanarak 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve yerleşmelerine izin verin.</li>
		<li>Herhangi bir kalp parçasını çıkarmadan mümkün olduğunca çok PBS-P/S'yi çıkarın. 10 mL yeni PBS-P/S ekleyin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kardiyomiyositleri izole etmek için kalp dokusunu sindirin.
	<ol>
		<li>Kalp parçalarının oturmasına izin verin. PBS-P/S'yi PBS'de 10 mL %0.15 tripsin ile değiştirin ve 37 ° C'de 10 dakika çalkalayın.</li>
		<li>Süpernatanı atın. Adım 2.2.1'de açıklanan sindirimi üç kez daha tekrarlayın, ancak süpernatanları 10 mL %100 FBS içeren 50 mL toplama tüplerine boşaltın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hücreleri santrifüjleyin (400 x g, 5 dakika) ve süpernatanı aspire edin. %10 FBS ve %1 P/S içeren DMEM-F12'deki hücreleri yeniden süspanse edin ve 6 oyuklu bir plakaya tohumlayın (1 x 105 hücre/cm2, kuyucuk başına 2 mL ortam).</li>
	<li>1 saat sonra, bağlı olmayan hücreleri içeren ortamı 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve bağlı hücreleri atın. Süspansiyondaki hücreleri sayın ve bunları yeni 6 oyuklu plakalara (1 x 105 hücre /cm2, oyuk başına% 10 FBS ve% 1 P / S içeren 2 mL DMEM-F12) yeniden kaplayın.</li>
	<li>Bromodeoksiüridin (BrdU) ile hücre proliferasyonunu inhibe edin. 
	Dikkat: BrdU güçlü bir teratojendir ve şüpheli mutajendir. Lütfen uygun eğitimin verildiğinden emin olun ve kullanmadan önce güvenlik bilgi formuna bakın.
	<ol>
		<li>Hücreler bağlandıktan sonra, 6 oyuklu plakadaki ortamı% 10 FBS,% 1 P / S (oyuk başına 2 mL ortam) ve 5 μM BrdU içeren DMEM-F12 ile değiştirin. 16 saat inkübe edin (37 °C,% 5 CO2).</li>
		<li>BrdU içeren ortamı çıkarın ve% 10 FBS ve% 1 P / S (oyuk başına 2 mL ortam) içeren DMEM-F12 ile değiştirin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Önceden boyanmış MSC'leri hazırlayın.
	<ol>
		<li>MSC kültürleri 10 cm'lik tabaklarda% 70-80 birleştiğinde, kültür ortamını çıkarın ve 3 mL hücre ayrışma çözeltisi ekleyin. Çanağı 37 °C ve %5 CO2'de 5 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Ayrışmış hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.</li>
		<li>Hücre peletini bozmadan süpernatanı aspire edin ve hücreleri, otomatik bir hücre sayacı kullanarak sayım için %10 FBS ve %1 P/S içeren 1 mL DMEM-F12'de yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Hücreleri% 10 FBS ve% 1 P / S içeren 1 x10 6 MSC / mL DMEM-F12 konsantrasyonuna seyreltin.</li>
		<li>MSC'leri canlı, aktarılamayan floresan boya (5 μM, 30 dk, 37 °C, %5 CO2) ile 1,5 mL'lik santrifüj tüplerinde 1 saat inkübe edin.</li>
		<li>Tüpleri 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peleti 1 x 10 6 MSC / mL'lik bir hücre konsantrasyonu için% 10 FBS ve% 1 P / S içeren DMEM-F12'de yeniden süspanse edin. Bunu toplam 3 kez tekrarlayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MSC'leri, 6 oyuklu plakanın oyuğu başına 10 x 104 hücre konsantrasyonunda kardiyomiyositlere (adım 2.5.2) aktarın.</li>
</ol>
3. Agrega Ko-kültürlerinin Hazırlanması
<ol>
	<li>% 10 FBS ve% 1 P / S ile desteklenmiş alfa-MEM'de tek hücreli bir MSC süspansiyonu (2 x 104 hücre / mL ortam, geçiş # ≤ 6) hazırlayın (bkz. adım 2.6). 
	NOT: Hücrelerin geçişi için protokolün 1. bölümüne bakın. Alternatif olarak, MSC'leri adım 2.6'ya göre önceden boyayın.</li>
	<li>10 cm'lik doku kültürü kaplarının kapaklarının iç yüzeyine (kapak başına 50 damlaya kadar) 25 μL damla hücre süspansiyonu (500 hücre) yerleştirerek agrega oluşumunu başlatın. Kapakları PBS-P/S içeren alt muadillerine yerleştirin. 37 °C ve %5 CO2. 'da inkübe edin
	NOT: Damla buharlaşmasını önlemek için 5-7 mL PBS-P/S'yi asılı damlaların altındaki kültür kabına yerleştirin.</li>
	<li>Stereomikroskop kullanarak 3 gün sonra damlalarda agrega oluşumunu gözlemleyin. 50 damlanın 40'ından fazlası oluşmuş agregalar içeriyorsa, damlaları 1 mL'lik bir mikropipet kullanarak kapaklardan toplayın ve agregaları doğrudan birincil sıçan kardiyomiyosit tek katmanlarına aktarın (adım 2.1-2.7; 10 damla / kuyucuk). Agrega bütünlüğünü korumak için sert pipetlemeden kaçının.</li>
	<li>Agrega ko-kültürlerini inkübatörlerde 2 haftaya kadar tutun, her 72 saatte bir ortamın tam hacmini (oyuk başına% 10 FBS ve% 1 P / S içeren 2 mL DMEM-F12) değiştirin.
	<ol>
		<li>Parlak alan mikroskobu kullanarak besleyici hücre katmanlarına yapışan agregaları günlük olarak gözlemleyin. Gözlemlendiğinde sözleşme toplamlarını kaydedin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Toplamları analiz için hazırlayın.
	<ol>
		<li>Ortamı çıkarın ve 6 oyuklu bir doku kültürü kabının oyuğu başına 2 mL PBS ekleyin. PBS'yi çıkarın ve kuyucuk başına 2 mL ayrışma çözeltisi ekleyin. 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 3 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Bir hücre peleti elde etmek için 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Sonraki adımlarda açıklanan uygulamalar için belirtildiği gibi (bkz. adım 4.1, 5.1 ve 6.1) ortamda yeniden süspanse edin ve 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Akış Sitometrisi (FC) ve Floresanla Aktive Edilen Hücre Sıralama (FACS)
<ol>
	<li>Florofor konjuge (FITC veya APC) primer antikorlar (yani, CD49f, Cx43, TRA-1-85, HLA-A, HLA-G ve FC için SIRPA; 1:40) ile hücre süspansiyonlarını (% 3 FBS içeren 200 μL PBS'de 1 x 105 hücre) inkübe edin veya FCS için TRA-1-85; 1:40) 4 ° C'de 30 dakika boyunca, ışıktan korunarak.</li>
	<li>Santrifüjleyin (400 x g, 5 dk) ve hücreleri FC için% 3 FBS ile 1 mL PBS'de veya FACS için% 0.5 FBS ile PBS'de yeniden süspanse edin. 
	NOT: MSC'lerin FC'si Hong ve diğerleri tarafından optimize edilmiştir.41.</li>
	<li>Hücreleri, FC (en az 1 x 104 olay) veya FACS tarafından analiz edilmeye hazır olana kadar karanlıkta 4 ° C'de tutun. Hücreleri aşağıdaki gibi sıralayın41. TRA-1-85 yüksek pozitif sıralanmış hücreleri 6 oyuklu plakalarda (1 x 104 hücre / oyuk, %10 FBS ve %1 P/S içeren 2 mL DMEM-F12) 1 h. içinde yeniden plakalayın
	NOT: TRA-1-85 insan hücre yüzeyi antijeninin geçit stratejisi için Ek Şekle bakınız.</li>
</ol>
5. İmmünositokimya (ICC) ve Mikroskopi
<ol>
	<li>Ko-kültürlerden (adım 3.5.2) veya FACS'den (bölüm 4) elde edilen hücre süspansiyonlarını oda slaytları (1 x 104 hücre / oyuk, oyuk başına% 10 FBS ve% 1 P / S içeren 2 mL DMEM-F12) üzerine yeniden plakalayın. Hücrelerin bir doku kültürü inkübatöründe gece boyunca tutunmasına izin verin (koşullar için bölüm 1'e bakınız).</li>
	<li>Hücreleri PBS'de 3 mL %4 paraformaldehit (PFA) kullanarak oda sıcaklığında 15 dakika sabitleyin. % 1 sığır serum albümini (BSA; PBS-BSA) yıkama başına 5 dakika 
	Dikkat: PFA'yı kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.</li>
	<li>Hücreleri% 0.1 Triton X-100 ile 3 mL PBS-BSA'da geçirgenleştirin. Hücre içi antijenler (yani, alfa sarkomerik aktinin (aSarc) ve Cx43) için 10 dakika veya intra-nükleer antijenler (yani, Mef2c ve insan nükleer antijeni (HuNu)) için 25 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Yıkama başına 5 dakika boyunca 3 mL PBS-BSA ile 3 kez yıkayın.</li>
	Oda <li>sıcaklığında 15 dakika boyunca% 5 normal keçi serumu (NGS) ve% 1 BSA içeren 3 mL PBS ile spesifik olmayan antikor reaksiyonlarına karşı numuneleri bloke edin. Yıkama başına 5 dakika boyunca 3 mL PBS-BSA ile 3 kez yıkayın.</li>
	<li>Birincil antikorlardaki hücreleri inkübe edin (ör., Mef2c, aSarc, Cx43 ve HuNu) gece boyunca 4 ° C'de 3 mL PBS-BSA'da 1:200 oranında seyreltilir.</li>
	<li>Yıkama başına 5 dakika boyunca 3 mL PBS-BSA ile 3 kez yıkayın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ikincil antikorlarla inkübe edin. Yıkama başına 5 dakika boyunca 3 mL PBS-BSA ile 3 kez yıkayın.</li>
	<li>Lekeli numuneleri 3 mL montaj ortamında saklayın.</li>
	<li>Floresan mikroskobu kullanarak görüntü elde edin. Daha düşük büyütmeli görüntüleme için 10X objektif (NA = 0,3) ve 20X objektif (NA = 0,45) kullanın. Kullanılan ikincil antikorlar için GFP (ex = 470/22 nm, em = 525/50 nm) ve RFP (ex = 531/40 nm, em = 593/40 nm) için floresan filtre küpleri ve dalga boyları kullanın (bkz. Malzeme ve Ekipman Tablosu).</li>
	<li>Görüntüleme yazılımı kullanarak görüntülerin miktarını belirleyin (önerilen yazılım için Malzeme ve Ekipman Tablosuna bakın). Floresan yoğunluğu okumalarını ikincil kontrol alımlarına normalleştirin.</li>
</ol>
6. RNA İzolasyonu ve Kantitatif RT-PCR
<ol>
	<li>Üreticinin talimatlarına göre, farklılaşmamış MSC kültürlerinden veya sütun tabanlı RNA izolasyonu kullanarak ortak kültürlerden sıralanan MSC'lerden RNA örnekleri hazırlayın. Numune başına 0,7 mL hücre lizis tamponunda (RNA izolasyon kiti ile sağlanır) 1 x 104 ila 1 x 106 hücre hazırlayın.</li>
	<li>100 μL RT reaksiyonu başına 2 μg'a kadar RNA'dan cDNA hazırlayın.</li>
	<li>Reaksiyon başına 10 ng cDNA kullanarak qPCR gerçekleştirin (40 döngü, 60 °C tavlama/uzatma sıcaklığı).
	<ol>
		<li>İnsan MY6H ve cTnT için 500 nM konsantrasyonda ve reaksiyon başına 1-100 ng cDNA'da primerler kullanın (Malzeme ve Ekipman Tablosuna bakın). Dahili temizlik normalleştiricileri olarak GAPDH, ACTB ve HPRT kullanın. Ticari olarak temin edilebilen insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositleri pozitif kontrol olarak kullanın. 
		NOT: Farklılaşmamış MSC'den türetilmiş cDNA örneklerine kıyasla ifadenin kat değişimini ifade edin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Dr. Clifford L. Librach olduğunu ortak patent sahibinin: Kanada ve Avustralya'verilen yöntemleri yalıtım ve ilk üç aylık göbek kordonu dokusundan elde edilen hücre kullanımı,.

Kök hücre kardiyak farklılaşma geliştirme için 2 yılda altında MSC kaynaklardan cardiomyocyte benzeri hücreleri oluşturmak için kullanılan birkaç farklı stratejileri ile olmuştur. Bu stratejiler, birçoğu ancak, verimsiz, ve kullanılan koşulları genellikle çevre nakledilen hücreler karşılaşma içinde vivotemsilcisi değildir.
Mevcut yöntemler aksine burada sunulan Protokolü birincil kardiyak besleyici katmanlar ve MSC toplama oluşumu bir arada kullanır. Birincil kardiyak besleyici Katman...

Konjestif kalp yetmezliği (CHF) morbidite ve mortalite dünya çapında önde gelen bir nedeni olarak devam ederse. En düşük CHF kez cardiomyocytes büyük kaybı ve akut miyokard infarktüsü (mı)1patolojik sonucu olarak skar dokusu boş hücre gelişimi takip oluşur. Kalp kısmen kendi kendini yenileyerek bir organ olmakla birlikte, bereket ve fonksiyon kez yaralanma sonra en iyi kurtarma için yetersiz hale yaşlı hastalarda ikamet kök ve progenitör hücre havuz önemli ölçüde doku rejenerasyonu yürütmek için sorumlu azalır. Böylece, sağlıklı donör hücre nakli hasarlı Miyokardiyum içine dahil deneysel tedaviler geliştirmede büyük bir ilgi vardır. Donör hücreleri doku yapısı geri kalmayıp aynı zamanda etkilenen Miyokardiyum fonksiyonel iyileşme elde etmek olduğunu zorunludur.
Yerel kalp kalp doku yerleşik istihdam ve endojen kemik iliği kökenli kök hücre sonrası yaralanma için2,3,4onarmak. Rejeneratif hücreleri-host ve donör-kaynaklı hem-must uygun fenotip ve yetenek verimli ve güvenli bir şekilde kayıp hücreleri değiştirmek için birlikte remodeling Miyokardiyum microenvironment işlevinde elde etmek için kapasite var. Vitro farklılaştırma yöntemleri yaygın yüksek verimli, kök hücre tabanlı cardiomyocyte üretim5,6elde etmek için kullanılmaktadır. Kardiyak lineage işaretleri ifade profili kardiyak lineage7karşı kök hücre farklılaşma süreci tanımlamak için kullanılır. Erken ayırt etme belirteçleri, NKX2.5, myocyte enhancer factor 2 C gibi (Mef2c) ve GATA48,9, cardiomyogenic sürecinin başlangıç belirtisi olabilir. Olgun cardiomyocyte işaretleri farklılaşma etkinliğini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan sinyal düzenleyici protein α (SIRPA)10, kardiyak troponin T (cTnT)11, ağır zincir kardiyak myosin (MYH6)8,12,13ve connexin 43 (Cx43)14,15,16' dır. Embriyonik kök hücreler (ESCs) ve pluripotent kök hücreler (PSC) kullanarak yöntemler iyice en iyi duruma getirilmiş ve endüktif faktörler, oksijen ve besin gradyan ayrıntılarını ve eylem5,6,7,17,18tam zamanlaması ile ilgili ele. Yine de, ESC ve PSC temel teknolojileri hala birden çok etik ve güvenlik endişeleri, suboptimal Elektrofizyolojik ve immünolojik özellikleri19,20birlikte mevcut. Bu hücreler ile sık sık nakledilen ev sahipliği yapan immunorejection deneyim ve kalıcı immünosupresyon gerektirir. Bu esas olarak MHC kompleksi (MHC) molekülleri ana bilgisayar ve donör ve elde edilen T hücreli yanıt21eşleşmeyebilir nedeniyle. Bireysel MHC sınıf ı eşleştirme olası bir çözüm, daha erişilebilir bir klinik pratikte immunoprivileged ret endişe üstesinden gelmek için evrensel bir hücre kaynağı gerektirir.
Klinik uygulamalar, MSCs ve özellikle, BMSCs, kullanmak için bir alternatif hücre kaynağı olarak kullanılmak üzere doku rejenerasyonu 199522onların ilk açıklama beri araştırdı. MSCs hemen hemen her bozukluklarına doku23' bulunabilir yerleşik rejeneratif hücreleri olduğuna inanılmaktadır. Yalıtım istenilen kaynaktan üzerine MSCs kültüründe kolayca genişletilebilir, geniş parakrin kapasitesine sahip ve genellikle immunoprivileged ya da immunomodulatory özellikleri24,25sahip. Onların güvenliği ve etkinliği zaten birkaç önceden klinik çalışmalarda, özellikle kalp yenilenme3,26için gösterilmiştir.
Birçok MSC farklılaşma stratejileri farmakolojik ajanlar, 5-azacytidine22 ve DMSO27ve büyüme veya BMP5,7,28,29 veya Anjiyotensin-II gibi30, morphogenic faktörler gibi değişken verimlilik ile kullanmaktadır. Bu stratejiler, saf rejeneratif hücre posta veya yaralanma siteye teslim sonra karşılaşmak muhtemeldir engelleri Ancak, temel alan değil içinde vivo. Daha fizyolojik ilgili stratejileri, süre daha zor için tanımlamak ve işlemek, MSC farklılaşma doku microenvironment gelen sinyalleri aracılığıyla bağlı olmak öncül dayalı. Önceki çalışmalarda bu maruz kalma kardiyak hücre lysates31 veya Ventriküler Miyokardiyum32,33göstermiştir veya doğrudan birincil cardiomyocytes vitro15,34, kişiyle MSCs kardiyak işaretlerinin ifade artırabilir. Kısmen, BMSCs ve cardiomyocytes39,40 füzyon doğmakta olan Miyokardiyum oluşturulan, ancak diğerleri ile MSCs35,36,37,38, kardiyak yaralanmaları tedavi sonra spontan cardiomyogenesis göstermiştir. Bilgimizi, fonksiyonel, kendiliğinden sözleşme cardiomyocytes insan MSCs (hMSCs) herhangi bir doku kaynağı üzerinden henüz bildirilmiştir değil.
Geçerli fikir birliği tüm MSCs Perivasküler hücreleri23ortaya olduğunu. Genç MSCs pericyte özelliklere sahip insan göbek kordonu doku41,42,43Perivasküler bölgesinden ayrılmış olabilir. BMSCs ile karşılaştırıldığında, HUCPVCs sahip artan farklılaşma potansiyeli ve birçok Rejeneratif avantajı, her iki vitro41,44 ve in vivo45,46,47. Özellikle, maternal-fetal arabirim olan kaynak, önemli ölçüde daha düşük immünojenisite MSCs yetişkin kaynaklarına göre HUCPVCs var. Bizim araştırma karakterizasyonu ve FTM HUCPVCs, araştırdık, MSCs en genç kaynak önceden klinik uygulamaları hangi biz daha önce proliferatif ve daha yüksek multilineage arttı göstermiştir odaklanır ayırt etme kapasiteleri, cardiomyogenic soy41yılında da dahil olmak üzere.
Burada, endüktif Kuvvetleri MSCs. toplamları tam cardiomyogenic farklılaşma ulaşmak için daha iyi koşullar içinde vivo 2D yapisan kültürlere göre modeller 3D bir çevre sağlamak olarak toplama oluşumu ve birincil kalp hücresi besleyici katmanlar birleştirir bir iletişim kuralı mevcut. Kardiyak besleyici katmanlar kullanarak son nakli site için MSCs temsilcisidir bir ortam sağlar. Biz öncesi ya da doğum sonrası göbek bağları izole MSCs genç kaynakları formu toplamları ve yetişkin BMSCs için hala onların bağışıklık ayrıcalık koruyarak karşılaştırıldığında kalp fenotip ulaşmak için daha yüksek bir kapasiteye sahip göstermek. Kardiyak lineage marker genler ve hücre içi indüklenen ifade dik yükselmesine dışında (Yani, cTnT ve MYH6) ve hücre yüzey proteinleri (Yani, SIRPA ve Cx43) belirli cardiomyocytes için biz göstermek FTM HUCPVCs farklılaşma potansiyeli bu yöntemle harnessed olabilir ve onlar kendiliğinden cardiomyocyte benzeri hücreler sözleşme için artış verebilir.

<table><tbody><tr><td>% 0.25 Tripsin / EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Hücre ayrışması için</td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Gibco</td><td>12571071</td><td>HUCPVC ve BMSC kültür ortamı için.</td></tr><tr><td>PE konjuge anti-insan / fare CD49f antikoru</td><td>Biolegend</td><td>313612</td> FC APC konjuge insan Cx43 / GJA1 antikoru <td>için Integrin belirteci</td></tr><tr><td></td><td>R& D Systems</td><td>FAB7737A</td> FC FITC konjuge HLA-A2 <td>antikoru Genway Biotech Inc. için Connexin 43 markörü</td></tr><tr><td></td><td></td><td>GWB-66FBD2</td><td>FC</td></tr><tr><td>FITC konjuge anti-HLA-G [MEM-G / 9] antikoru</td> için <td>immünojenisite belirteci</td><td>Abcam</td><td>ab7904</td> FC</tr><tr><td>FITC konjuge fare anti-insan SIRPA / CD172a antikoru</td><td>AbD Serotec / Bio-Rad</td><td>MCA2518F</td> için immünojenisite belirteci FC APC konjuge insan TRA-1-85 / CD147 antikoru için <td>kardiyak belirteç</td></tr><tr><td></td><td>R& D Systems</td><td>FAB3195A</td><td>FC ve FACS için insan hücresi markörü</td></tr><tr><td>FITC konjuge insan TRA-1-85/CD147 antikoru</td><td>R& D Systems</td><td>FAB3195F</td><td>FC ve FACS</td></tr><tr><td>Anti-connexin 43 / GJA1 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab11370</td><td>Cx43 için insan hücresi belirteci. ICC</td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG (H + L) çapraz emilen ikincil antikoru için, Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A-21428</td><td>ICC</td></tr><tr><td>Anti-sarkomerik alfa aktinin [EA-53] antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td>aSARC için. ICC</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgM ağır zincir çapraz emilen ikincil antikor için, Alexa Fluor 555</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A-21426</td><td>ICC</td></tr><tr><td>Mef2C (D80C1) XP tavşan antikoru</td><td>New England BioLabs Ltd.</td> için<td>5030S</td><td>ICC</td></tr><tr><td>Eşek anti-tavşan IgG (H + L) ikincil antikoru için, Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-21206</td><td>ICC</td></tr><tr><td>Anti-nükleus (HuNu) (klon 235-1) antikoru</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1281</td><td>ICC</td></tr><tr><td>MZ9.5 için Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>Agregaları görüntülemek için.</td></tr><tr><td>1.5 ml santrifüj mikrotüpleri</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>MSC'leri floresan boya ile boyamak için.</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Açık kaynaklı görüntü işleme yazılımı.</td></tr><tr><td>Aria II&nbsp;</td><td></td><td></td> BD <td>UHN SickKids FC Tesisi. Hücre sıralama için.</td></tr><tr><td>Kemik iliği, mesektimal stromal hücreler</td>, <td>Lonza</td><td>PT-2501</td>, <td>BMSC'ler,</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini,</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G</td><td>BSA. ICC</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>EMD Millipore</td><td>için</td> çözümler hazırlamak MAB3424 <td>Dikkat: BrdU güçlü bir teratojendir ve şüpheli mutajendir. Lütfen uygun eğitimi sağlayın ve kullanmadan önce SDS'ye bakın.</td></tr><tr><td>Canto II</td><td>BD</td><td></td><td>UHN SickKids FC Tesisi. Akış sitometrisi için.</td></tr><tr><td>cDNA EcoDry Premix</td><td>Clontech/Takara</td><td>639570</td><td>qPCR için cDNA'nın hazırlanması için</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td>Hücre sitoplazmasının floresan görüntülemesi</td></tr><tr><td>Countess otomatik hücre sayacı</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>C10227</td><td>Hücre sayımı için</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421</td><td>Sıçan primer kardiyomiyosit kültür ortamı için.</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Gibco'su</td><td>10010023</td><td>D-PBS, Ca2+ olmadan, Mg2+</sup</td></tr><tr><td>>EVOS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Kurum içi floresan mikroskobu</td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD</td><td></td><td>Kurum içi. Akış sitometrisi için.</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (Hyclone)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH3039603</td><td>FBS. Hücre kültürü ortamının bileşeni.</td></tr><tr><td>IDT Prime Time qPCR probları</td><td>Entegre Veri Teknolojileri</td><td>FAM florofor</td><td>http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers</td></tr><tr><td>Lab Vision PermaFluor Sulu Montaj Ortamı ThermoScientific</td><td></td><td>TA-030-FM</td><td>Hücrelerin ICC</td></tr><tr><td>LSR II&nbsp;</td><td></td><td></td> BD <td>UHN SickKids FC Tesisi. Akış sitometrisi için.</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>UHN SickKids FC Tesisi. Hücre sıralama için.</td></tr><tr><td>Normal keçi serumu</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>5425S</td><td>NGS. ICC</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Hazne Kapak Camı</td> için engelleme çözümünde kullanılır, 8 kuyulu <td>Thermo Scientific Nunc</td><td>155409</td> ICC <td></td></tr><tr><td>OmniPur Triton X-100 Yüzey Aktif Madde</td><td>EMD Millipore</td><td>9410-OP</td> için numune hazırlamak için ICC Paraformaldehit <td>için hücreler hazırlanırken geçirgenleştirici çözeltinin bir bileşeni olarak</td></tr><tr><td>,% 16 Çözelti, EM Dereceli Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td>ICC için hücreleri sabitlemek için.</td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Hücre kültürü ortamının bileşeni.</td></tr><tr><td>Primerler</td><td>Sigma</td><td>Özel Standart DNA Oligoları, Tuzdan Arındırılmış, 0.2 & mu; mol</td> <td>< güçlü>CTnT_F: < / güçlü> GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; <güçlü>CTnT_R: < / güçlü> GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; <güçlü >MYH6 F: < / güçlü> GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; <güçlü >MYH6 R: < / güçlü> GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G</td></tr><tr><td>Çekirdek İplik Diski Konfokal</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SickKids Görüntüleme Tesisi</td></tr><tr><td>ReproCardio hiPS hücre türevli kardiyomiyositler</td><td>ReproCell</td><td>RCD001N</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>RNeasy mini kiti</td> için pozitif kontrol <td>Qiagen</td><td>74106</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Rotor-Gene SYBR Green PCR Kiti</td><td>Qiagen</td><td>204074</td><td>Ana karışımlı qPCR için</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>A1049101</td><td>MSC için, monosit kokültür ortamı.</td></tr><tr><td>TaqMan qPCR primer testleri</td><td>qPCR</td>için <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444556</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td>Canlılık ve sayım için hücrelerin boyanması</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Gibco</td><td>272500108</td><td>Hücre ayrışması için</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>Perkin-Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Görüntüleme yazılımı</td></tr><tr><td>0.2 & mu; m gözenek filtresi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>566-0020</td><td>Doku kültürü ortamını sterilize etmek için</td></tr><tr><td>HERAcell 150i CO2 İnkübatör</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026410</td><td>Hücreleri inkübe etmek için</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>PBS. 1X, Kalsiyum klorür ve magnezyum klorür olmadan</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Almedic</td><td>7727- A10-704</td><td>Sıçan kalbi vermek için. Benzer forseps kullanabilir.</td></tr><tr><td>Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14059-11</td><td>Sıçan kalbini kıymak için. Kavisli makas önerilir.</td></tr><tr><td>50 mL tüp</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Kardiyomiyosit toplama ve genel doku kültürü prosedürleri sırasında toplama için</td></tr><tr><td>15 mL tüp</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Genel doku kültürü prosedürleri için</td></tr><tr><td>6 oyuklu plakalar</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>CA73520-906</td><td>Doku kültürü için</td></tr><tr><td>10 cm doku kültürü kapları</td><td>Corning</td><td>25382-428</td><td>Agrega oluşumu için</td></tr><tr><td>Axiovert 40C Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Doku kültürü ve protokolün geri kalanı boyunca parlak alan görüntüleme için</td></tr><tr><td>70 &mu; m hücreli süzgeç</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td>Akış sitometrisi veya sıralamadan önce tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Millipore</td><td>9410-1L</td> ICC Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H1399 için <td>geçirgenleştirme çözümünde kullanılır</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Cx43 lokalizasyonunun görselleştirilmesi sırasında kullanılan leke</td></tr></tbody></table>

vitro İnsan mezenkimal kök hücre farklılaşma fonksiyonel cardiomyocyte benzeri hücre içine

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Miyokard İnfarktüsü ve sonraki iskemik art arda sıralı cardiomyocytes, konjestif kalp yetmezliği, ölüm dünya çapında önde gelen nedenidir önde gelen geniş kaybına neden. Mezenkimal Kök hücre (MSCs) geçerli, invaziv teknikler değiştirmek hücre tabanlı terapiler için umut verici bir seçenek vardır. MSCs kardiyak hücre tipleri, dahil olmak üzere Mezenkimal soy ayırabilirsiniz ama fonksiyonel hücrelere tam farklılaşma değil henüz elde. Önceki yöntemler farklılaşma farmakolojik ajanlar veya büyüme faktörleri dayalı. Ancak, daha fizyolojik ilgili stratejileri cardiomyogenic dönüşüme MSCs etkinleştirmesini de isteyebilirsiniz. Burada, cardiomyocyte gibi sözleşme hücreleri üretmek için cardiomyocyte besleyici katmanlar üzerinde MSC toplamları kullanarak bir farklılaşma yöntem mevcut.
İnsan göbek kordonu Perivasküler hücreleri (HUCPVCs) daha ayrıştırması daha potansiyel için gösterilmiştir kemik iliği MSCs (BMSCs) gibi MSC türleri yaygın olarak araştırıldı. Ontogenetically genç bir kaynağı olarak, biz büyük kaynaklarına göre birinci üç aylık dönem (FTM) HUCPVCs cardiomyogenic potansiyelini araştırdık. FTM HUCPVCs çoğu zaman kültürlü rahim içinde immunoprivileged özellikleri korumak MSCs roman, zengin bir kaynağıdır vitro. Bu farklılaşma protokolü, FTM ve terim kullanarak HUCPVCs BMSCs için karşılaştırıldığında önemli ölçüde artış cardiomyogenic farklılaşma cardiomyocyte işaretleri (Yani, myocyte artırıcı bir faktör 2 C, kardiyak troponin T, ağır zincir kardiyak myosin, sinyal düzenleyici protein α ve connexin 43) artan ifade tarafından belirtildiği şekilde elde. Onlar da kendi alt HLA-A ifade ve daha yüksek HLA-G ifade tarafından gösterdiği olarak anlamlı derecede düşük immünojenisite muhafaza. Farklılaşma toplamak tabanlı uygulama, FTM HUCPVCs potansiyel ve oluşturulan ortak kültür kardiyak besleyici katmanlar üzerinde 1 hafta içinde hücre kümeleri müteahhitlik, bunu yapmak için ilk MSC türü haline artan toplama oluşumu gösterdi.
Bu farklılaşma stratejisi etkili FTM HUCPVCs gibi genç MSCs cardiomyogenic potansiyelini koşum ve o vitro öncesi farklılaşma onların rejeneratif etkinliği içinde vivoartırmak için potansiyel bir strateji olabilir öneriyor bizim sonuçlar gösterilmektedir.

HUCPVC'ler, BMSC'lere Kıyasla Daha Yüksek Agrega Oluşturma Potansiyeli ve CD49f Ekspresyon Seviyeleri Gösterir:
hMSC'lerin (yani FTM HUCPVC'lerin, term HUCPVC'lerin ve BMSC'lerin) farklılaşmasını indüklemek için, diferansiye olmamış MSC tek hücre süspansiyonları veya MSC içeren asılı damlalar (Tablo 1), sırasıyla doğrudan ko-kültürler veya agregat ko-kültürler oluşturmak amacıyla sıçan ...

Burada, fonksiyonel, sözleşme, cardiomyocyte benzeri hücreler üretmek için kardiyak farklılaşma potansiyeli insan Mezenkimal kök hücrelerin genç kaynaklarının verimli koşum için bir yöntem mevcut tüp bebek.

Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Bu deneysel prosedürün genel amacı, mezenkimal kök hücrelerin kardiyomyojenik indüksiyonunu gerçekleştirmek ve gözlemlemektir. Bu yöntem, fonksiyonel kardiyomyositler üretmek için çevresel sinyallerle hangi çözümlerin tetiklenebileceği gibi mezenkimal kök hücre alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, farmakolojik ajanlar veya genetik materyaller yerine agregat oluşumu ve fetal kardiyak tabakaları uygulamasıdır.Bu tekniğin doğurduğu sonuçlar, mezenkimal kök hücrelerin kardiyomiyojenik potansiyelini detaylandırması nedeniyle kardiyovasküler hastalıkların tedavisine yöneliktir. Bu prosedürü ben, laboratuvarımızın doktora öğrencisi Bayan Farwah Iqbal ile laboratuvarımızın stajyerleri olan Max Librach ve Nadav Gasner ile birlikte uygulamalı olarak göstereceğiz. Metin protokolüne uygun olarak sıçan yavru parçalarını izole ettikten sonra, ventrikülleri ikiye bölün ve kanın yıkanmasını sağlamak için buz üzerinde 10 mL PBS içeren 10 santimetrelik bir kaba aktarın.Ardından, kavisli makas kullanarak ventrikül duvarlarını iki ila üç milimetre çapında küçük parçalara ayırın. Bir serolojik pipet kullanarak, 10 ila 12 hayvandan alınan kalp parçalarını 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve çökelmelerini bekleyin. Herhangi bir kalp parçasına zarar vermeden, mümkün olduğunca fazla PBS P/S'yi uzaklaştırın.Ardından 10 ml taze PBS P/S ekleyin. Kardiyomiyositleri izole etmek için, kalp parçaları çöktükten sonra PBS P/S yerine %0,15 trypsin içeren PBS kullanın ve dokuyu 37 °C'de, çalkalayarak 10 dakika boyunca inkübe edin. Süpernatantı atın.Ardından, süpernatanları 10 mL %100 FBS içeren 50 mililitrelik toplama tüplerine aktarmak dışında, tripsin sindirimini üç kez daha tekrarlayın. Sonrasında, hücre tüplerini santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Daha sonra, hücreleri yeniden süspande etmek için %10 FBS ve %1 P/S içeren DMEM-F12 kullanın ve hücreleri altı kuyucuklu bir plakaya ekimleyin.Hücreler yapıştığında, ortamı iki mililitre taze ortam ile değiştirin. Önceden boyanmış MSC'leri hazırlamak için, 10 santimetrelik kaplarda %70 ila %80 konfluense ulaşmış MSC kültürlerinden ortamı uzaklaştırın ve üç mililitre hücre disosyasyon çözeltisi ekleyin. Kapları 37 °C ve %5 karbondioksit altında beş dakika boyunca inkübe edin.Ayrıştırılmış hücreleri 15 mililitrelik tüpe aktarın ve 400 x G'de beş dakika santrifüjleyin. Hücre peletini bozmadan süpernatantı aspire edin ve hücreleri yeniden süspande edin. Ardından, hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayıcı kullanın.Hücreleri %10 FBS ve %1 P/S içeren DMEM-F12 içerisinde 1 x 10⁶ MSC/ml konsantrasyona seyreltin. Ardından, 1,5 ml'lik santrifüj tüplerindeki hücrelere canlı, transfer edilemeyen floresan boya ekleyin ve MSC'leri yarım saat boyunca inkübe edin. Tüpleri 400 x G'de beş dakika santrifüj ettikten sonra, süpernatantı aspire edin ve peleti 1 x 10⁶ MSC/ml konsantrasyonda yeniden süspanse edin.Ardından, MSC'leri altı kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 10 x 10⁴ hücre/kuyucuk konsantrasyonunda olacak şekilde kardiyomiyositlerin üzerine transfer edin. Agregat ko-kültürleri oluşturmak için, %10 FBS ve %1 P/S ile desteklenmiş alfa MEM içerisinde MSC'lerin tek hücre süspansiyonunu hazırlayın. 10 santimetrelik doku kültürü kaplarının kapaklarının iç yüzeyine 25 µL hücre süspansiyonu damlaları yerleştirerek agregat oluşumunu başlatın.Kapakları, PBS P/S içeren alt kısımların üzerine kapatın. Kapları 37 °C ve %5 CO2 ortamında inkübe edin. Üç gün sonra, bir stereo mikroskop altında damlalardaki agregat oluşumunu gözlemleyin.Damlaların %80'inden fazlası oluşmuş agregatlar içeriyorsa, kapaklardaki damlaları toplamak için bir mililitrelik bir mikropipet kullanın ve agregatları doğrudan primer sıçan kardiyomiyosit monotabakaları üzerine aktarın. Agregat ko-kültürlerini iki haftaya kadar inkübe edin. Besiyerinin tüm hacmini her 72 saatte bir değiştirin.Günlük olarak, fetal hücre katmanlarına tutunan agregatları gözlemlemek için aydınlık alan mikroskobu kullanın. Gözlemlendiğinde, kasılan agregatları kaydedin. Aktif agregatlar senkronize bir şekilde kasılmaktadır; bu durum, herhangi bir fiziksel aktivite göstermeyen fetal katman boyunca aralarında bir iletim olduğunu düşündürmektedir.Besiyerini aspire edin ve altı kuyucuklu plakadaki her kuyucuğa iki mililitre PBS ekleyin. Ardından PBS'yi uzaklaştırın ve her kuyucuğa iki mililitre disosyasyon çözeltisi ekleyin. Plakaları 37 °C ve %5 CO₂ ortamında üç dakika boyunca inkübe edin.Burada gösterildiği gibi, üç farklı tipteki HMSC'ler doğrudan ko-kültürlerde benzer bolluk ve görünüm sergilemiştir. Asılı damlaların agregat ko-kültürlerdeki kardiyak hücrelerin üzerine aktarılmasından iki ila üç gün sonra, FTM'ler ve terim huck PBC'ler, BMSC'lerde görülene kıyasla daha büyük agregatlarda ortaya çıkmıştır. Bu deneyde, diferansiye olmamış MSC'lerdeki CD49F ekspresyonunun akış sitometrik analizi, FTM huck PBC'lerin %96'sının, terim huck PBC'lerin %89'unun ve BMSC'lerin %53'ünün hücre yüzeyi CD49F için pozitif olduğunu göstermiştir.TRA won 85 hücreleri üzerinde yapılan akış sitometrisi, doğrudan kardiyomiyosit ko-kültürlerinden elde edilen BMSC'lerin aksine, FTM huck PBC'lerde ve term huck PBC'lerde kardiyomiyositle ilişkili marker olan SIRPA'nın yukarı regüle olduğunu göstermiştir. Burada görüldüğü üzere, cx43 yukarı regülasyonu, FTM huck PBC'lerde, term huck PBC'lere veya doğrudan ko-kültürlerdeki BMSC'lere kıyasla anlamlı derecede daha yüksekti. Floresan mikroskopi analizi, farklılaşan FTM ve term huck PBC'lerin her ikisinin de cx43'ü yukarı regüle ettiğini ortaya koymuştur.Term huck PBC'lerin oranı FTM'lere göre daha yüksekti. Bununla birlikte, floresan mikroskobu cx43 pozitif punktaların FTM huck PBC'lerin hücre membranında gözlemlendiğini ve term hücrelerde ise ağırlıklı olarak sitoplazmik olduklarını ortaya koydu. Son olarak, burada görüldüğü gibi, ko-kültür sonrası ayrıştırılmış insan hücreleri üzerinde yüksek büyütmeli floresan mikroskobu uygulanmış ve plazma membranındaki yüksek cx43 bolluğu doğrulanmıştır.Bu prosedürün temel adımları, uygun şekilde uygulandığında ve uzmanlaşıldığında, her biri bir saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür gerçekleştirilirken aseptik önlemlerin sürdürülmesi önemlidir. Doğru şekilde işlenmediği takdirde kontaminasyona yol açabilecek primer hayvan dokuları kullanılmaktadır.Bu prosedürün ardından, bu yapıların ömrü gibi ek soruları yanıtlamak için büzülen agregatların daha ileri kültürü gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, MSC alanındaki araştırmacıların, ekstra embriyonik dokular gibi daha genç mezenkimal kök hücre kaynaklarının farklılaşma potansiyelini keşfetmelerine olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, MSC agregatlarının nasıl hazırlanacağı ve kardiyomyojenik farklılaşma için uygun bir indüksiyon sağlayacak şekilde bunların doğrudan primer doku fetal tabakalarıyla nasıl birleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.BRDU ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken sitotoksik atıkların uygun şekilde yönetimi gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

in-vitro-differentiation-human-mesenchymal-stem-cells-into-functional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video asılı bırak yöntemini kullanarak embriyoid organları fare embriyonik kök hücreleri in vitro farklılaşması nasıl yürütüleceğini gösteriyor.

Asma Bırak Yöntemiyle Fare Embriyonik Kök (MES) Hücreler in vitro Farklılaşma

Biz büyük bir tedarik kardiyovasküler onarım için insan kalp atalarıdır ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde türetilmesi sağlayan küçük moleküller ile tanımlanmış koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan cardioblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

Pluripotent kök hücreler, embriyonik veya uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri ya, kardiyomiyositler dahil olmak üzere insan farklılaşmış hücrelerin, değerli bir kaynak oluşturmaktadır. Burada, bir embriyoid organları tabanlı protokol ile fonksiyonel insan kardiyomiyositlerin elde etmek için bunları nasıl kullanacağınızı gösteren, iPS hücrelerin kalp indüksiyon üzerinde durulacak.

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

Makale verimli seçici referans belirteçlerinin analizi nüfusun homojenliği ve kimliğini değerlendirmek için flow sitometri ile takip Wnt yolu, modüle göre kardiyomiyositlere insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek için ayrıntılı yöntem anlatılmaktadır.

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

Bu protokolde, hem fare hem de insan embriyonik kök hücrelerinden kardiyak progenitör hücrelerin türetilmesi gösterilecektir. Bu protokoldeki ana strateji, embriyonik kök hücre hatlarına tasarlanmış floresan raportörler kullanarak kardiyak progenitör hücreleri akış sitometrisi ile zenginleştirmektir.

Embriyonik Kök Hücreleri Kardiyak Progenitör Hücrelerinin türetilmesi

Burada, kardiyovasküler hastalık modellemesi ve ilaç taraması amacıyla saflaştırılmış kardiyomiyositlerin üretimini sağlayan, küçük molekül modülasyonlu kardiyak farklılaşma ve glikoz yoksunluğu aracılı kardiyomiyosit saflaştırmasını birleştiren insan kardiyomiyosit türevi için sağlam bir protokol açıklıyoruz.

Küçük Molekül-modüle Farklılaşma ve sonraki Glikoz şiddetli açlık kullanma İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin yüksek oranda saf kardiyomiyositlerde türetilmesi

Bu el yazması, yüzey işaretleyici ekspresyonu ve hücre sıralaması kullanılarak tanımlanmış tasarlanmış kardiyak dokuların oluşturulmasını açıklar. Tanımlanan dokular daha sonra insan kalbinin işlevsel, ancak kontrollü bir model sistemini sağlamak için kardiyak hücre tedavisi mekanizmalarını araştırmak için çok dokulu bir biyoreaktörde kullanılabilir.

Tanımlı İnsan Engineered Kalp Dokuların inşaatı Kardiyak Hücre Tedavisinin Mekanizmaları Eğitim için

Pluripotent kök hücrelerden in vitro kardiyomiyositlerin üretilmesi, temel bilim ve klinik uygulamalar için in vitro olarak büyük miktarlarda kalp dokusuna erişim sağlar.  Bu protokol, hem elde edilen kardiyomiyositlerin sayısını artırmak hem de atriyal fenotipli kardiyomiyositler oluşturmak için atriyalize edici faktör Grem2'yi kullanır.

BMP rakip GREM2 kullanma Pluripotent Kök Hücreleri Atriyal kardiyomiyositlerde Farklılaşma

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden (hPSC-CM) türeyen kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik karakterizasyonu, kardiyak hastalık modellemesi ve ilaç yanıtlarının belirlenmesi için çok önemlidir. Bu protokol, hPSC-CM'lerin çok elektrotlu diziler üzerinde ayrılması ve plakalanması, alan potansiyelinin ölçülmesi ve QT ve RR aralıklarının analiz edilmesi için gerekli olan bilgileri sağlar.

Çok Elektrodlu Diziler (ÇÇA&#39;lar) Kullanan İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilmiş Kardiyomiyositlerin (hPSC-CM&#39;ler) Elektrofizyolojik Analizi

Burada sürekli olarak sağlam insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler üretmek ve işlevlerini karakterize etmek için bir yöntem tanımlamak ve doğrulamak. Bu teknikler sinyal yolları içine mekanistik anlayış geliştirilmesinde yardımcı olabilir, büyük ölçekli ilaç tarama için bir platform sağlamak, ve güvenilir model kalp hastalıkları.

Ventriküler Benzeri HiPSC Türevi Kardiyomiyositlerin Ve Kalsiyum Kullanımı Karakterizasyonu için Yüksek Kaliteli Hücre Preparatlarının Üretimi

Burada, hasta periferik kan mononükleer hücrelerinden insan kardiyomiyositlerini sağlam bir şekilde üretmek ve genişletmek için bir protokol sunuyoruz.

Hasta Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden İnsan Kardiyomiyositlerinin Üretimi ve Genişlemesi

Keşfedin mezenkimal kök hücrelerin kardiyomiyojenik farklılaşmasını çevresel sinyallerle. Bu yöntem farmakolojik ajanlar yerine agregat oluşumu kullanarak fonksiyonel kardiyomiyosit benzeri hücreler üretir.

Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

Daha fazla video keşfet