Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

Bu deneysel prosedürün genel amacı, mezenkimal kök hücrelerin kardiyomiyojenik indüksiyonunu indüklemek ve gözlemlemektir. Bu yöntem, mezenkimal kök hücre alanında, fonksiyonel kardiyomiyositler oluşturmak için çevresel sinyaller tarafından hangi ilaçların indüklenebileceği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en önemli avantajı, farmakolojik ajanlar veya genetik materyal yerine agrega oluşumu ve kardiyak fetal tabakaları uygulamasıdır.

Bu tekniğin etkileri, mezenkimal kök hücrelerin kardiyomiyojenik potansiyelini detaylandırdığı için kardiyovasküler hastalıkların tedavisine kadar uzanır. Bu prosedürü benimle birlikte gösterenler, laboratuvarımızın doktora öğrencisi Bayan Farwah Iqbal, her ikisi de laboratuvarımızın kursiyerleri olan Max Librach ve Nadav Gasner olacak. Sıçan yavrusu parçalarını metin protokolüne göre izole ettikten sonra, ventrikülleri ikiye bölün ve kanın akması için 10 mililitre PBS ve buz üzerinde ince çizgili 10 santimetrelik bir tabağa aktarın.

Daha sonra kavisli makas kullanarak ventriküler duvarları iki ila üç milimetre çapında küçük parçalar halinde kesin. Serolojik bir pipet kullanarak, kalp parçalarını 10 ila 12 hayvandan 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve yerleşmelerine izin verin. Herhangi bir kalp parçasını çıkarmadan mümkün olduğunca çok PBS P/S'yi çıkarın.

Ardından 10 milimetre taze PBS P/S ekleyin. Kardiyomiyositleri izole etmek için, kalp parçaları yerleştikten sonra, PBS P / S'yi değiştirmek için PBS'de% 0.15 tripsin kullanın ve dokuyu 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca çalkalayarak inkübe edin. Süpernatanı atın.

Ardından, tripsin sindirimini üç kez daha tekrarlayın, ancak süpernatanları 10 mililitre% 100 FBS içeren 50 mililitrelik toplama tüplerine dekantör edin. Daha sonra, hücre tüplerini santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Daha sonra% 10 FBS ve% 1 P / S ile DMEM-F12'yi hücreleri yeniden süspanse etmek ve altı oyuklu bir plakaya tohumlamak için kullanın.

Hücreler bağlandıktan sonra, ortamı iki mililitre taze ortamla değiştirin. Önceden boyanmış MSC'leri hazırlamak için, ortamı 10 santimetrelik tabaklarda% 70 ila% 80 birleşmeye ulaşan MSC kültürlerinden çıkarın ve üç mililitre hücre ayrışma çözeltisi ekleyin. Bulaşıkları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte beş dakika inkübe edin.

Ayrışan hücreleri 15 mililitrelik tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 400 x G'de santrifüjleyin. Hücre peletini bozmadan süpernatanı aspire edin ve hücreleri yeniden askıya alın. Ardından, hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı kullanın.

Hücreleri, %10 FBS ve %1 P/S içeren DMEM-F12'de mililitre başına 1 x 10 ila altıncı MSC konsantrasyonuna seyreltin. Daha sonra, 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerindeki hücrelere, canlı, aktarılamayan floresan boya ekleyin ve MSC'leri yarım saat inkübe edin. Tüpleri beş dakika boyunca 400 x G'de santrifüjledikten sonra, süpernatanı aspire edin ve peleti mililitre başına 1 x 10 ila altıncı MSC'ye kadar bir konsantrasyonda yeniden askıya alın.

Daha sonra MSC'leri, altı oyuklu plakanın oyuğu başına dördüncü hücrelere 10 x 10 konsantrasyonda kardiyomiyositlere aktarın. Agrega ko-kültürleri yapmak için,% 10 FBS ve% 1 P / S ile desteklenmiş alfa MEM'de tek hücreli bir MSC süspansiyonu hazırlayın. 10 santimetrelik doku kültürü kaplarının kapaklarının iç yüzeyine 25 mikrolitrelik damla hücre süspansiyonu yerleştirerek agrega oluşumunu başlatın.

Kapakları PBS P/S içeren alt muadillerine yerleştirin. Bulaşıkları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Stereo mikroskop altında, üç gün sonra damlalarda agrega oluşumunu gözlemleyin.

Damlaların %80'inden fazlası agrega oluşturduysa, kapaklardaki damlaları toplamak için bir mililitrelik bir mikropipet kullanın ve agregaları doğrudan birincil sıçan kardiyomiyosit tek katmanlarına aktarın. Agrega ko-kültürlerini iki haftaya kadar inkübe edin. Her 72 saatte bir ortamın tam hacmini değiştirmek.

Günlük olarak, fetal hücre katmanlarına bağlanan agregaları gözlemlemek için parlak alan mikroskobu kullanın. Gözlemlendiğinde sözleşme toplamlarını kaydedin. Aktif agregalar senkronize bir şekilde büzülür, aralarında fiziksel aktivitesi olmayan fetal tabaka boyunca bir iletkenlik öneriyoruz.

Ortamı aspire edin ve altı kuyulu tabağın oyuğuna iki mililitre PBS ekleyin. Ardından PBS'yi çıkarın ve kuyucuk başına iki mililitre ayrışma çözeltisi ekleyin. Bulaşıkları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte üç dakika inkübe edin.

Burada gösterildiği gibi, üç farklı tipteki HMSC'ler, doğrudan ko-kültürlerde benzer bolluk ve görünüm sergilemiştir. Asılı damlaların agrega ko-kültürlerinde kardiyak hücrelere aktarılmasından iki ila üç gün sonra, FTM'ler ve term huck PBC'ler, BMSC'lerden görülenlere kıyasla daha büyük agregalarda ortaya çıktı. Bu deneyde, farklılaşmamış MSC'lerde CD49F ekspresyonunun akış sitometrik analizi, huck PBC'lerin %89'u ve BMSC'lerin %53'ü olarak adlandırılan FTM huck PBC'lerin %96'sının hücre yüzeyi CD49F için pozitif olduğunu gösterdi.

TRA üzerindeki akış sitometrisi 85 hücre kazandı, kardiyomiyosit ile ilişkili markörün, FTM huck PBC'lerde ve term huck PBC'lerde SIRPA'nın yukarı regülasyonunu gösterdi, ancak doğrudan kardiyomiyosit ko-kültürlerinden BMSC'lerde göstermedi. Burada görüldüğü gibi, cx43 yukarı regülasyonu, FTM huck PBC'lerde, doğrudan ko-kültürlerdeki term huck PBC'lere veya BMSC'lere kıyasla önemli ölçüde daha yüksekti. Floresan mikroskopi analizi, FTM ve term huck PBC'lerin farklılaşmasının, her ikisinin de cx43'ü yukarı regüle ettiğini ortaya koydu.

Terim huck PBC'ler FTM'lerden daha yüksek bir kısımda. Bununla birlikte, floresan mikroskobu, FTM huck PBC'lerin hücre zarında cx43 pozitif punkta'nın gözlendiğini ve bunların term hücrelerde ağırlıklı olarak sitoplazmik olduğunu ortaya koydu. Son olarak, burada görüldüğü gibi, birlikte kültürlemeden sonra sıralanmış insan hücreleri üzerinde yüksek büyütmeli floresan mikroskobu yapıldı ve plazma zarındaki yüksek cx43 bolluğu doğrulandı.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedürün temel adımları, uygun şekilde gerçekleştirilirlerse, her biri bir saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, aseptik önlemlerin sürdürülmesi önemlidir. Uygun şekilde kullanılmadığı takdirde kontaminasyona neden olabilecek birincil hayvan dokuları.

Bu prosedürü takiben, bu yapıların uzun ömürlülüğü gibi ek soruları yanıtlamak için sözleşmeli agregaların daha fazla kültürlenmesi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, MSC'ler alanındaki araştırmacıların, ekstra embriyonik dokular gibi daha genç mezenkimal kök hücre kaynaklarının farklılaşma potansiyelini keşfetmelerini sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, MSC agregatlarının nasıl hazırlanacağı ve bunların kardiyomiyojenik farklılaşma için uygun bir indüksiyon sağlayacak şekilde doğrudan primer doku fetal katmanları ile nasıl birleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

BRDU ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken sitotoksik atıkların uygun şekilde işlenmesi gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.