Virüs tabanlı Cre Rekombinasyon kullanarak Postnatal Fare Beyin Gelişimi Gen Fonksiyonu Mosaic Analizi

Bu prosedürün genel amacı, beyin gelişiminin doğum sonrası döneminde gen fonksiyonunu manipüle etmektir. Bu, önce uygun virüslerin seçilmesi ve hazırlanması, bunların şırıngaya yüklenmesi ve enjeksiyon ekipmanının hazırlanması ile gerçekleştirilir. Daha sonra yeni doğan fare yavrularının beyinlerine virüs enjekte edilir ve son adım hayvanları kurban etmek ve enjekte edilen bölgeleri görüntülemektir.

Sonuç olarak, immünofloresan mikroskobu ile kontrol ve nakavt hücrelerinin diferansiyel etiketlenmesini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, doğum sonrası gelişim döneminin genetik olarak nasıl düzenlendiği gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Enjeksiyon için, ticari olarak temin edilebilen adeno-ilişkili bir virüs çözeltisi, çok sayıda hücreyi manipüle etmek için mililitre başına tipik olarak 10 ila 12. genom kopyaları olmak üzere tam titrede kullanılabilir.

Seyrek veya etiketleme isteniyorsa, bir ila 10 seyreltme ile başlayın. Virüsü buz üzerinde çözdürdükten sonra, ön seyreltme hacmini hemen steril 250 mikrolitrelik bir PCR tüpüne aktarın. Seyreltmeyi buz üzerinde tutun. Şimdi.

Uygun bir şırınga seçerek ve bir yükleme iğnesine bağlayarak enjeksiyon pompasını hazırlayın. Daha sonra, şırıngada çok küçük bir hava kabarcığı görülene kadar virüs çözeltisini yavaşça çekin ve bu adımı kolaylaştırmak için inert yükleme boyası kullanılabilir. Şimdi şırıngayı bir tutucu ile pompaya sabitleyin.

Ardından şırınga ile iğne tutucu arasına bağ borusunu yavaşça takın. Enjeksiyon iğnesinin, iğne tutucunun içindeki bağ borusu ile doğrudan temas halinde olduğundan emin olun. Şimdi, iğnenin ucunda küçük bir çözelti damlası görünene kadar çözeltiyi bağ borusundan yavaşça hareket

Pistonu, itici bloğun yanındaki pistonu, pompa üzerindeki bir braket ile dikkatlice sabitleyin. Enjeksiyon hızını dakikada sekiz mikrolitreye ayarlayın ve enjeksiyon hacmini bir ila iki mikrolitre arasında ayarlayın. Ardından, pompa şırınga çapı ayarını, kullandığınız şırınganın çapına uyacak şekilde ayarlayın.

Son olarak, iyileşme aşamasında yavruları korumak için sıcak plakayı 38 santigrat dereceye ayarlayın ve üzerini bir kağıt havluyla örtün. IACUC onaylı bir protokol kullanarak, P zero veya P bir fare yavrularını soğuk anesteziye tabi tutarak enjeksiyon için hazırlayın. Birkaç kağıt havluyu suyla nemlendirin ve buzun üzerine koyun.

Daha sonra iyice ayrılmış kağıt havlunun üzerine dört veya beş yavru yerleştirin. Kağıt havluları yavruların üzerine katlayın, nazikçe kağıt havluların üzerine az miktarda kırılmış buz koyun ve yavruları yaklaşık beş dakika kuluçkaya yatırın. Yavrular 15 dakikaya kadar güvenli bir şekilde buz üzerinde tutulabilir ve yine de iyi bir iyileşme sağlayabilir.

Şimdi, enjeksiyon bölgesine en iyi erişim için anestezi uygulanmış bir yavruyu bir montaj bloğuna yerleştirin. Örneğin kortekse en kolay şekilde hayvanı karnının üzerine düz bir şekilde yatırarak erişilebilir. Yavru bir yara bandı kullanılarak yerine sabitlenebilir, yavrunun kafasını manuel olarak stabilize edebilir ve hareket etmesini önlemek için cildi sıkıca çekebilir.

Daha sonra lambda dikişi gibi kafatasının anatomik işaretlerinde gezinin ve diğer elinizle tekrarlanabilir bir enjeksiyon noktası seçin, iğneyi yavaşça kafatasından geçirin. İğne kafatasına kolayca nüfuz etmiyorsa sert itmeyin. Bunun yerine, iğneyi yeniden konumlandırın ve nazikçe tekrar deneyin.

Enjeksiyon derinliği, bireysel hayvanlar ve korteks için suşlar arasında biraz değişir, genellikle yarım ila bir milimetre derinlik işe yarar. Şimdi, el hareketlerini en aza indirmek için bir iş arkadaşınıza pompayı etkinleştirerek virüs solüsyonunu enjekte edin. İdeal olarak, enjeksiyondan sonra pompayı çalıştırmak için bir ayak pedalı kullanılabilir.

İğneyi birkaç saniye yerinde tutun, ardından yavrunun kafasını düzgün bir şekilde sabit tutun. İğneyi dışarı kaydırın. Şimdi, yavrunun kapalı sıcak plaka üzerinde beş ila 10 dakika iyileşmesine izin verin.

Bu süre zarfında, diğer yavruları enjekte etmeye devam edin. Yavruların hepsi pembe renklerini geri kazandıklarında ve hepsi hareket etmeye başladığında, onları ev yataklarının bir kısmıyla nazikçe ovalayın. Ancak o zaman annelerine geri dönebilirler.

Aksi takdirde, yavrular annelerine geri verildikten sonra annenin büyük olasılıkla öldüreceği yabancı yavrular olarak muamele görebilirler. Şırıngayı aseton veya% 70 etanol ile tamamen yükleyerek enjeksiyon kurulumunu temizleyin. Sano, akupuntu, yapıştırıcılar gibi asetona duyarlı bileşenler kullanılıyorsa, her seferinde taze solüsyon kullanarak solüsyonu enjeksiyon kurulumundan birkaç kez yıkayın.

Bu, kalan virüs çözeltisini ortadan kaldıracak ve çözücüleri buharlaştıracaktır. Kurulumu temizledikten sonra, bir sonraki deneyci için hazır bırakmak için çamaşır suyunun çalışma alanını dezenfekte edin. Akıl hocası. Başarılı teknik, enjeksiyon bölgesinde sağlam bir nöronal enfeksiyon oluşturur.

Korteks ve superior colliculus gibi belirli bölgelere yapılan enjeksiyonlar tipik olarak bitişik bölgelere minimum yayılma ile lokal enfeksiyonlar oluşturur. Yüksek titreli bir virüs çözeltisinin kullanılması, hipokampus gibi bitişik alanların enfeksiyonunu yapar, düşük titreli bir virüs çözeltisi ile enjeksiyon olasılığı daha yüksektir. Orta hatta serebellar enjeksiyon gibi tipik olarak enjeksiyon bölgesinin yakınında seyrek enfeksiyonla sonuçlanır, enfekte olan hücre sayısı, enjekte edilen viral çözeltinin bir titresi ile ilişkili olmalıdır.

Örneğin, farklı floresan proteinleri eksprese eden iki R AAV sekiz virüsünün yüksek titre çözeltilerinin bir karışımını serebelluma enjekte etmek, farklı şekilde etiketlenmiş birçok kinji hücresini enfekte eder. Tersine, düşük titreli bir virüs çözeltisi enjekte etmek, tek hücrelerin görselleştirilmesine yardımcı olmak için seyrek enfeksiyona neden olabilir. Floresan etiketli nöronlar doğrudan taze kesilmiş canlı dokuda gözlenebilir veya immün boyamaya tabi tutulabilirler.

Bu, daha sonra geniş alan veya konfokal floresan mikroskobu ile görüntü elde etmek için endojen floresan sinyallerini geliştirir. Son olarak, RAAV sekiz, ince işlemlerin güçlü bir şekilde etiketlenmesi ile korteksteki çeşitli nöron tiplerini enfekte etme yeteneğine sahiptir Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde gerçekleştirilirse yaklaşık 30 dakika içinde yapılabilir.