Üç Boyutlu İnsan Cilt Model Yeniden İnşa: Aracı Normal Cilt ve Melanom İlerleme Eğitim

Bu prosedürün genel amacı, melanosit, melanom ve cilt kök hücre biyolojisi çalışmaları için bir 3D insan derisi rekonstrüksiyonu oluşturmaktır. Bu, önce bir doku kültürü tepsisi ekinin nötralize edilmiş sığır kollajeni ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, hücresel dermal bölmeyi fibroblastlar ve kollajenden yapmaktır.

Daha sonra, epidermal bölmeyi melanositler veya melanom hücreleri ile karıştırılmış keratinositlerden yapın. Prosedürün son adımı, 18. günde bir cilt rekonstrüksiyonu elde etmek ve bir cilt rekonstrüksiyonunu bir fareye aşılamaktır. Sonuç olarak, greftin immünohistokimyasal ve immünofloresan analizleri, melanosit içeren normal derinin mimarisini, normal kök hücrelerin göçünü ve farklılaşmasını ve evreye spesifik melanom fenotiplerini gösterir.

20 yıl önce cilt rekonstrüksiyon modelini geliştirdik çünkü çalışmalarımızın başlarında bir tabak üzerinde kültürlenen normal melanositlerin veya melanom hücrelerinin doku bağlamındaki hücrelerden çok farklı davrandığını bulduk. Bu nedenle cilt rekonstrüksiyon modeli, hücrelerin ciltteki bir bölmeden başka bir yere nasıl hareket ettiğini görmemiz için idealdir. Önceden hazırlanmış aselüler tabaka kollajen karışımı buz üzerinde ve daha sonra altılı bir parçanın her bir parçasına bir mililitre saman sarısı çözeltisi ekleyin.

Kuyu, doku kültürü tepsisi, jelin katılaşmasını sağlamak için tepsiyi oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bu süre zarfında, jel tripsin gözlerini katılaştırırken, çözeltinin rengi sarıdan pembeye değişmelidir, insan lifi beş dakika sonra% 0.25 tripsin EDTA ile kültür şişesinden patlar. Izasyon işlemini nötralize etmek için %10 FBS içeren DMEM ekleyin.

Ayrılan hücreleri, oda sıcaklığında 200 G'de beş dakika boyunca santrifüjleme ile toplayın ve daha sonra hücreleri 1.5 mililitre başına 10 ila beşinci hücrelere 4.5 kez yeniden süspanse edin. DMEM% 10 FBS ile desteklenmiştir. Daha sonra, 50 mililitrelik bir tüpü önceden hazırlanmış hücresel tabaka kollajen karışımı ile doldurun ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.

Tüpe 1.5 mililitre fibroblast süspansiyonu ekleyin ve karıştırın. Her bir aselüler tabaka kaplı eke üç mililitre saman sarısı hücresel tabaka çözeltisi ekleyin. Daha sonra doku kültürü tepsisini, inkübasyon süresi boyunca% 5 karbondioksit doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede 45 dakika inkübe edin.

Hücresel tabaka çözeltisinin rengi de sarıdan pembeye değişmelidir. Üst tabaka jeli katılaştıktan sonra, doku kültürü tepsisindeki ekin iç kısmına% 10 FBS içeren iki mililitre DMEM ve ekin dışına 10 mililitre ekleyin. Doku kültürü tepsilerini dört gün boyunca inkübe edin.

Dördüncü günde, inkübasyonun dördüncü gününde jelin kasılıp kasılmadığını kontrol ederek, ortamı her bir ekin hem içinden hem de dışından aspire edin. Normal serumu yıkamak için eklerin içine iki mililitre ve dışına 10 mililitre yıkama ortamı ekleyin. Daha sonra epidermisin oluşması için tepsileri 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.

İlk tripsin insan keratinositleridir. Daha sonra beş dakika sonra, ayrılmış hücreleri beş dakika boyunca 200 G'de döndürdükten sonra tripsini nötralize etmek için soya fasulyesi tripsin inhibitörü kullanın. Reus, hücre peletini deride mililitrede 10 ila altı hücreye 4.17 kez askıya alır.

Keratinositler toplandıktan sonra orta olanı yeniden yapılandırın. Tripsin, insan melanositlerini bir ila iki dakika buzlayın. Yine tripsini soya fasulyesi tripsin inhibitörü ile nötralize edin.

Daha sonra, hücreleri daha önce olduğu gibi aynı koşullar altında döndürdükten sonra, melanosit peletini ciltte mililitre başına 8.3 kez 10 ila beşinci hücrede yeniden süspanse edin. Orta olanı da yeniden yapılandırın. Daha sonra, yıkama ortamını bir dermal tabaka hazırlanmış doku kültürü tepsisinin her bir ekinin hem içinden hem de dışından çıkarın.

Yıkama ortamını 1,5 mililitre cilt ekleyerek değiştirin, her bir parçanın içine bir tane ve dışına 10 mililitre olmak üzere ortamı yeniden yapılandırın. Daha sonra 600 mikrolitre keratinosit hücre süspansiyonunu 600 mikrolitre melanosit süspansiyonu ile karıştırın. Karışık hücre süspansiyonundan 200 mikrolitre dağıtın.

Her bir ekin içine damla damla in. Doku kültürü tepsisini 37 santigrat derecede iki gün inkübe edin. Hücreleri inkübe ettikten sonra, cildi aspire edin, her bir ekin hem içinden hem de dışından bir tane yeniden yapılandırın ve ardından iki mililitre cilt ekleyin, ortamı yeniden yapılandırın, ikisi içine ve 10 mililitre dışına çıkın.

Daha sonra rekonstrüksiyonları 37 santigrat derecede iki gün daha inkübe edin. İkinci iki günlük inkübasyondan sonra cildi aspire edin, her bir ekin içinden ve dışından orta ikiyi yeniden yapılandırın. Şimdi 7,5 mililitre cilt ekleyin, orta üç tanesini sadece eklerin dışına doğru yeniden yapılandırın.

Rekonstrüksiyonları inkübatöre geri yerleştirin ve cildi değiştirin. 18. güne kadar her gün orta üçünü yeniden oluşturun. İnkübasyonun 18. gününde, bir cilt rekonstrüksiyonu yüklü doku kültürü tepsisinin eklerinin içinden ve dışından ortamı aspire edin.

Ekleri forseps ile tepsiden çıkarın. Bir neşter bıçağı ile kenara yakın bir daireyi izleyerek polikarbonat filtre de dahil olmak üzere yapıyı kesin. Daha sonra rekonstrüksiyonu filtreye sert bir yüzeye yerleştirin ve bıçakla ikiye bölün.

Rekonstrüksiyonun yarısını siyah bir TBS biyopsi kağıdına yerleştirin ve ardından kağıdı bir histoloji kasetine yerleştirin. Tüm kaseti dört saatten fazla% 10 formalin içinde bekletin. Daha sonra kaseti% 70 etanole yerleştirin ve parafin gömme için yeniden yapılandırmayı işlemeye hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın.

Rekonstrüksiyonun diğer yarısını bir ila iki saat boyunca dört santigrat derecede% 50 sükroz içine yerleştirin. Daha sonra sakarozları iki azı dişine değiştirin ve ardından bir ila iki saat daha dört santigrat derecede saklayın. Bir taban kalıbını yarıya kadar optimum kesme sıcaklığı, dondurma ortamı veya OCT ile doldurun.

Herhangi bir baloncuktan kaçının. Rekonstrüksiyonun kenarını forseps ile kavrayın ve rekonstrüksiyonu sakarozdan çıkarın. Sükroz emilene kadar Kim mendillerinin üzerine koyun.

Forseps ve bir spatula kullanarak, yeniden yapılandırmayı OCT'nin üstündeki tekneye aktarın. Tekne tamamen dolana kadar yeniden yapılandırmanın üstünü daha fazla OCT ile örtün. Yine, baloncuklardan kaçınmak.

OCT'nin tamamen donmasını sağlamak için tekneyi kırılmış kuru buzun üzerine eşit şekilde yerleştirin. Ardından taban kalıbını ve folyoyu sarın ve bir kriyostat ile kesmeye hazır olana kadar eksi 70 santigrat derecede saklayın. Bir farede bir cilt rekonstrüksiyonu aşılamaya hazırlanmak için, bir kabı sıvı nitrojenle doldurun ve 50 mililitrelik bir tüpe beş mililitre DMEM ekleyin.

Bir beheri 600 mililitre musluk suyuyla doldurun ve beheri ısınması için sıcak bir plakanın üzerine yerleştirin. Ardından, yaklaşık altı haftalık bir dişi kızak, tüysüz soylu fare seçin. Fareyi flor ile uyuşturduktan sonra.

İşlem boyunca anesteziyi korumak için bir burun konisi kullanın. Hipotermiyi önlemek için steril oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın ve ısı desteği sağlayın. Ardından, fare derisini bileşik benzoin tentürü ve alkol hazırlama çubuklarıyla temizleyin.

Daha sonra dikiş atmak üzere aynı pozisyonu korumak için farenin üstünde bir çizgi işaretleyin. İris makası ve forseps kullanarak farenin sırtında yuvarlak bir yara yatağı kesin ve ardından yara yatağını steril gazlı bez süngerlerle örtün. Yuvarlak fare derisini 50 mililitrelik DMEM tüpüne koyun.

Tüm ortam ve doku tamamen donana kadar tüpü sıvı bir nitrojen kabına daldırın. Daha sonra, tüpü tamamen çözülene kadar bir beher sıcak suda çözün. Bunu tekrarlayın, işlemi üç kez dondurun ve çözün

Bir cilt rekonstrüksiyonunu bir ek parçadan ayırmak için cerrahi bir bıçak kullanın. Membranı çok dikkatli bir şekilde çıkarın ve ardından cilt rekonstrüksiyonunu fare yara yatağının üstüne aktarın. Şimdi, fare kaplamasını dış görünümün yeniden yapılandırılmasının üzerine yerleştirin.

İlk sütürün daha önce etiketlenmiş işaretleyicinin üstünde ve ikincisinin altta olduğundan emin olun. Ardından, fare derisini sabitlemek için cildin yanlarında iki dikiş daha kullanın. Aşılamadan sonra fare derisini temizleyin ve ardından fareyi yeni bir kafese koyun.

18. günde. Deri rekonstrüksiyonlarının epidermisi, tabakalı keratinosit tabakalarından oluşur, farklılaşmamış bazal tabaka ve sıralı olarak farklılaşmış tabakalar dikey olarak yönlendirilir. Rekonstrüksiyon bölümünün melanositik işaretleyici ile boyanması.

Siyah oklarla gösterildiği gibi S 100, melanositlerin epidermisin bazal tabakasında hizalandığını ve dendrit uzantıları yoluyla çoklu keratinositlerle iletişim kurduğunu gösterir. Dermal bölme, bir kollajen tip bir matris içine gömülü fibroblastlar içerir, kollajen dört, epidermisi dermisten ayıran bazal zarı gösterir. Aşağıdaki şekiller, epidermiste çok sayıda keratinosit tabakasının nasıl geliştiğini göstermektedir.

Bir GFP lentiviral vektörü ile işaretlenmiş dermal kök hücreler fibroblastlarla gömüldüğünde. Bir kollajen tip bir matriste, epidermise göç ederler ve beşinci günde melanositlere farklılaşırlar. Keratinositleri tohumladıktan sonra, tek hücreler kürelerden göç etmeye başlar.

Epidermisin hala tek bir katmandan oluştuğunu unutmayın. Sekizinci günde. Birkaç hücre epidermis dermis arayüzüne ulaşır.

10. günde, GFP pozitif hücreler, burada görülebileceği gibi, bazal membran pozisyonunda sıkıca hizalanır. Epidermisteki göç etmiş GFP pozitif hücreler, melanositik belirteç HMB 45'i eksprese eder. Melanom hücre dizilerinin farklı aşamaları cilt rekonstrüksiyonlarına dahil edildiğinde, hücrelerin davranışı in vivo özelliklerini yansıtır.

İşte bu şekilde normal melanositler ve 2 boyutlu kültürlerde büyütülmüş melanom hücreleri görülmektedir. Normal melanositlerin yeri ve büyüme hızı, burada görüldüğü gibi cilt rekonstrüksiyonlarında sıkı bir şekilde kontrol edilir, radyal büyüme fazı, primer melanomlar ağırlıklı olarak epidermiste çoğalırken, dikey büyüme fazı melanomları bu şekilde görüldüğü gibi dermise invaziv olarak büyür. Son olarak, metastatik melanomların agresif bir şekilde dermisin derinliklerine nasıl istila ettiği burada görülebilir.

Normal cilt üzerinde yaptığımız çalışmalar, melanom gelişimi ve ilerlemesi hakkında daha iyi bilgi sahibi olmak için temel sağlar.