Üç Boyutlu İnsan Cilt Model Yeniden İnşa: Aracı Normal Cilt ve Melanom İlerleme Eğitim

Bu prosedürün genel amacı, melanosit, melanoma ve deri kök hücresi biyolojisi çalışmaları için 3B insan deri rekonstrüksiyonu oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle doku kültürü tepsilerinin bir insertinin nötralize sığır kolajeni ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise fibroblastlar ve kolajen kullanarak hücresel dermal kompartman oluşturmaktır.

Ardından, keratinositlerin melanositler veya melanoma hücreleri ile karıştırılmasıyla epidermal kompartman oluşturun. Prosedürün son adımı, 18. günde deri rekonstrüktünü hasat etmek ve bu deri rekonstrüktünü bir fareye greftlemektir. Sonuç olarak, greftin immünohistokimyasal ve immünofloresan analizleri, melanositler içeren normal deri mimarisini, normal kök hücrelerin göçünü ve farklılaşmasını ve evreye özgü melanoma fenotiplerini göstermektedir.

Normal melanositlerin veya melanoma hücrelerinin bir kapta kültürlenmesinin, doku bağlamındaki hücrelerden çok farklı davrandığını çalışmalarımızın başında fark ettiğimiz için 20 yıl önce deri rekonstrüksiyon modelini geliştirdik. Bu nedenle deri rekonstrüksiyon modeli, hücrelerin derideki bir bölmeden başka herhangi bir yere nasıl hareket ettiğini görmek için bizim için idealdir. Daha önce hazırlanan aselüler tabaka kolajen karışımını buz üzerinde bekletin ve ardından saman sarısı çözeltiden bir mililitre ekleyerek altılı her bir inserte yerleştirin.

Kuyucuklu doku kültürü tepsisini, jelin katılaşması için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu süre zarfında, jel katılaşırken çözeltinin rengi sarıdan pembeye dönmelidir. Tripsin ile beş dakika sonra, kültür flasklarındaki human fibroblast hücrelerini %0.25 tripsin EDTA ile ayırın. Tripsinizasyon sürecini nötralize etmek için %10 FBS içeren DMEM ekleyin.

Ayrılan hücreleri oda sıcaklığında 200 G'de beş dakika santrifüj ederek toplayın ve ardından hücreleri 1,5 mililitre %10 FBS ile desteklenmiş DMEM içinde 4,5 x 10⁵ hücre olacak şekilde yeniden süspande edin. Daha sonra, 50 mililitrelik bir tüpü önceden hazırlanmış hücresel tabaka kollajen karışımı ile doldurun ve tüpü buza yerleştirin.

Tüpe 1,5 milliliters fibroblast süspansiyonu ekleyin ve iyice karıştırın. Her bir aselüler tabaka kaplı insert'e üç milliliters saman sarısı hücresel tabaka çözeltisi ekleyin. Ardından, inkübasyon süresi boyunca doku kültürü tepsisini, %5 carbon dioxide içeren bir doku kültürü inkübatöründe 37 degrees Celsius sıcaklıkta 45 dakika boyunca inkübe edin.

Hücresel tabaka solüsyonunun rengi de sarıdan pembeye dönmelidir. Üst tabaka jel katılaştıktan sonra, doku kültürü tepsisindeki insertin içine %10 FBS içeren iki mililitre DMEM ve insertin dışına 10 mililitre DMEM ekleyin. Doku kültürü tepsilerini dört gün boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun dördüncü gününde jelin büzüldüğünü kontrol ederek, her bir insertin hem içinden hem de dışından medyumun aspire edin. Normal serumu yıkamak için insertlerin içine iki mililitre ve dışına 10 mililitre yıkama medyumu ekleyin. Ardından, epidermisin oluşumu için tepsileri 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

İlk olarak insan keratinositleri tripsinizleyin. Ardından, ayrılan hücreleri 200 G'de beş dakika boyunca santrifüjledikten sonra, tripsini nötralize etmek için soya fasulyesi tripsin inhibitörü kullanın. Hücre peletini, cilt içerisinde mililitre başına 4,17 × 10⁶ hücre olacak şekilde yeniden süspande edin.

Keratinositler toplandıktan sonra birinci ortamı yeniden oluşturun. İnsan melanositlerini bir ila iki dakika boyunca tripsin ile inkübe edin. Ardından, tripsini soya fasulyesi tripsin inhibitörü ile nötralize edin.

Ardından, hücreleri daha önce olduğu gibi aynı koşullarda santrifüjledikten sonra, melanosit peletini skin içinde 8,3 × 10⁵ hücre/mL olacak şekilde yeniden süspande edin. Medium one'ı da aynı şekilde hazırlayın. Sonrasında, dermal tabakalı bir doku kültürü tepsisinin her bir insert'inin hem içinden hem de dışından yıkama ortamını uzaklaştırın.

Her bir insertin içine 1,5 mililitre ve dışına 10 mililitre deri rekonstrüksiyon medyumu ekleyerek yıkama medyumunu değiştirin. Ardından, 600 mikrolitre keratinosit hücre süspansiyonunu 600 mikrolitre melanosit süspansiyonu ile karıştırın. Karıştırılan hücre süspansiyonundan 200 mikrolitre dağıtın.

Her bir insertin içine damla damla ekleyin. Doku kültürü tepsisini iki gün boyunca 37 °C'de inkübe edin. Hücreleri inkübe ettikten sonra, her bir insertin hem içinden hem de dışından deri rekonstrüksiyon medyumu bir'i aspire edin ve ardından insertin içine iki mililitre deri rekonstrüksiyon medyumu iki, dışına ise 10 mililitre ekleyin.

Ardından, rekonstrüksiyonları 37 °C'de iki gün daha inkübe edin. İkinci iki günlük inkübasyonun ardından, her bir insert'in içinden ve dışından deri rekonstrüksiyon ortamı ikisini aspire edin. Şimdi, sadece insert'lerin dış kısmına 7,5 mL deri rekonstrüksiyon ortamı üç ekleyin.

Rekonstrüktleri inkübatöre geri yerleştirin ve besiyerini değiştirin. 18. güne kadar gün aşırı olarak rekonstrükt besiyeri 3 kullanın. İnkübasyonun 18. gününde, deri rekonstrüktü yüklü doku kültürü tepsisindeki insertlerin iç ve dış kısımlarındaki besiyerini aspire edin.

Insertleri pens ile tepsiden çıkarın. Bir skalpel bıçağıyla kenara yakın bir daire çizerek polikarbonat filtre dahil olmak üzere konstrütü kesin. Ardından, filtre üzerindeki rekonstrütü sert bir yüzeye yerleştirin ve bıçakla ikiye bölün.

Rekonstrüksiyonun bir yarısını siyah bir TBS biyopsi kağıdı üzerine yerleştirin ve ardından kağıdı bir histoloji kasetine koyun. Tüm kaseti dört saatten fazla süreyle %10 formalinde bekletin. Daha sonra kaseti %70 etanol içine yerleştirin ve rekonstrüksiyonu parafin gömme işlemi için hazırlayana kadar dört °C'de saklayın.

Rekonstrüksiyonun diğer yarısını 4 °C'de %50 sakkaroz içerisinde bir ila iki saat bekletin. Ardından sakkarozu 2 molar ile değiştirin ve tekrar 4 °C'de bir ila iki saat boyunca saklayın. Bir taban kalıbını yarıya kadar optimal kesim sıcaklığı, dondurma medyumu veya OCT ile doldurun.

Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Rekonstrükte yapının kenarını pensle tutun ve onu sükrozdan çıkarın. Sükroz emilene kadar Kim wipe üzerine yerleştirin.

Pens ve spatula kullanarak, rekonstrütü OCT üzerindeki tekneye aktarın. Teknede tamamen dolana kadar rekonstrütün üzerini daha fazla OCT ile kapatın. Bu sırada yine hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin.

OCT'nin tamamen donmasını sağlamak için tekneyi kırılmış kuru buz üzerine eşit şekilde yerleştirin. Ardından taban kalıbını ve folyoyu sarın ve kriyostat ile kesime hazır olana kadar minus 70 degrees Celsius'ta saklayın. Fare üzerinde bir deri rekonstrüksiyonu greftleme işlemine hazırlanmak için bir kabı sıvı azotla doldurun ve 50 milliliter'lik bir tüpe beş milliliters DMEM ekleyin.

Bir beherin içine 600 milliliters musluk suyu doldurun ve ısıtmak için beheri bir ısıtıcı plakanın üzerine yerleştirin. Ardından, yaklaşık altı haftalık, dişi, skid tüy süz olan outbred bir fare seçin. Fareyi izofluran ile anestezi ettikten sonra.

İşlem boyunca anesteziyi sürdürmek için bir burun konisi kullanın. Hipotermiyi önlemek için steril oftalmik lubrikan uygulayın ve ısı desteği sağlayın. Ardından, fare derisini bileşik benzoat tinktürü ve alkollü temizleme mendilleri ile temizleyin.

Daha sonraki dikiş işlemi için aynı konumu korumak amacıyla farenin sırtının üst kısmına bir çizgi işaretleyin. İris makası ve pens kullanarak farenin sırtında yuvarlak bir yara yatağı oluşturun ve ardından yara yatağını steril gazlı bezlerle kapatın. Yuvarlak fare derisini 50 milliliter DMEM içeren tüpe yerleştirin.

Tüpü, tüm ortam ve doku tamamen donana kadar bir sıvı azot kabına daldırın. Ardından, tüpü tamamen çözülene kadar sıcak su dolu bir behere yerleştirerek çözdürün. Bu dondurma ve çözdürme işlemini üç kez tekrarlayın.

Bir deri rekonstrüktünü ekten ayırmak için cerrahi bıçak kullanın. Membranı çok dikkatli bir şekilde çıkarın ve ardından deri rekonstrüktünü fare yara yatağının üzerine yerleştirin. Şimdi, fare derisini deri rekonstrüktünün üzerine yerleştirin.

İlk sütünin önceden etiketlenmiş işaretçinin üzerinde, ikincisinin ise altında olduğundan emin olun. Ardından, fare derisini sabitlemek için deri rekonstrüksiyonunun yan taraflarında iki sütur daha kullanın. Greftleme işleminden sonra fare derisini temizleyin ve ardından fareyi yeni bir kafese yerleştirin.

18. günde, yeniden yapılandırılan derinin epidermisi tabakalı keratinosit katmanlarından oluşur; farklılaşmamış bazal tabaka ve sırayla farklılaşmış tabakalar dikey olarak yönlenmiştir. Yeniden yapılandırılmış doku kesitleri melanositik belirteç ile boyanır.

Siyah oklarla belirtilen S 100, melanositlerin epidermisin bazal tabakasında hizalandığını ve dendrit uzantıları aracılığıyla çok sayıda keratinosit ile iletişim kurduğunu göstermektedir. Dermal kompartman, bir tip bir kollajen matrisine gömülü fibroblastlar içerir; çökelmiş kollajen dört ise epidermisi dermisten ayıran bazal membranı belirtir. Aşağıdaki şekiller, epidermisteki çok katmanlı keratinositlerin nasıl geliştiğini göstermektedir.

GFP lentiviral vektörü ile işaretlenmiş dermal kök hücreler fibroblastlar ile birlikte gömüldüğünde, tip bir kolajen matris içerisinde epidermise göç ederler ve beşinci günde melanositlere farklılaşırlar. Keratinositlerin ekilmesinin ardından, tekil hücreler kürelerden dışarı göç etmeye başlar.

Epidermisin hala tek bir tabakadan oluştuğuna dikkat edin. Sekizinci günde, birkaç hücre epidermis-dermis arayüzüne ulaşır.

Burada görülebileceği üzere, 10. güne gelindiğinde GFP pozitif hücreler bazal membran konumunda sıkıca dizilmiştir. Epidermise göç eden GFP pozitif hücreler, melanositik belirteç HMB 45 eksprese eder. Farklı evrelerdeki melanom hücre hatları deri rekonstrüktlarına dahil edildiğinde, hücrelerin davranışı in vivo özelliklerini yansıtır.

Burada, 2D kültürlerde büyütülen normal melanositler ve melanoma hücreleri bu şekilde görülebilir. Normal melanositlerin konumu ve büyüme hızı, burada görüldüğü gibi deri rekonstrüksiyonlarında sıkı bir şekilde kontrol edilir; radyale büyüme fazındaki primer melanomalar ağırlıklı olarak epidermiste çoğalırken, vertikal büyüme fazındaki melanomalar bu şekilde görüldüğü üzere dermise invaziv olarak büyür. Son olarak, metastatik melanomaların dermisin derinliklerine agresif bir şekilde invaze olma biçimi burada görülebilir.

Normal cilt üzerindeki çalışmalarımız, melanom gelişimi ve ilerlemesinin daha iyi anlaşılması için temel oluşturmaktadır.