Karanlık Alan Mikroskobu Kullanılarak Antikor Konjuge Nanopartikül Tabanlı Miktar Tayini: Vücut Sıvılarından Belirli Eksozomları Yakalama ve Ölçme Prosedürü

Eksozomlar, hücreler tarafından hücre dışı boşluğa salgılanan küçük, zarla çevrili yapılardır. Eksozomlar biyosıvılarda bol miktarda bulunur.

Vücut sıvılarından belirli eksozomları tanımlamak ve yakalamak için, çok kuyulu bir immünolojik test slaydı alarak başlayın. Bu slayt, antijen görevi gören ve spesifik antikorlara bağlanan proteinlerle işlevselleştirilir.

Slaytı istenen birincil antikor çözeltisi ile destekleyin ve inkübe edin. Bu antikorlar, kayma yüzeyindeki önceden kaplanmış antijenlere bağlanır.

Bağlanmamış antikorları çıkarmak için kalan çözeltiyi aspire edin. Şimdi, serbest antijenleri bloke eden ve böylece eksozomların spesifik olmayan bağlanmasını önleyen bir bloke edici tampon ekleyin.

Daha sonra, bloke edici tamponu çıkarın, serum süspansiyonu içeren eksozomları lam üzerine yükleyin ve inkübe edin. Bu, hedefe özgü eksozomların yakalanan primer antikorlara özel olarak bağlanmasına izin verir.

Daha sonra, slayt yüzeyine altın nanopartikül konjuge ikincil antikorlardan oluşan bir süspansiyon yükleyin. Bu antikorlar önceden bağlanmış eksozomlara bağlanır ve bir tespit kompleksi oluşturur.

Son olarak, bir pipet kullanarak, bağlanmamış ikincil antikorları atın. Slaytları karanlık alan mikroskobu altında görselleştirin. Eksozomların yüzeyinde bulunan altın nanoparçacıklar ışığı saçar ve koyu arka plana karşı parlak noktalar olarak görünür.

Slaytı hazırlamaya başlamak için, istenen eksozom yakalama antikorlarını PBS'de mililitre başına 0.025 miligrama seyreltin. Optik dereceli camla desteklenmiş protein A / G ile muamele edilmiş bir slaytın her bir oyuğuna 1 mikrolitre çözelti pipetleyin. Ardından, inkübasyon sırasında kuyuların kurumamasını sağlamak için sürgüyü bir nemlendirme kutusuna aktarın.

Yakalama antikorlarını hareketsiz hale getirmek için slaydı 37 santigrat derecede 1 saat inkübe edin. Ardından, bağlanmamış antikorları çıkarmak için kalan çözeltiyi aspire edin. 1 mikrolitre PBS'yi üç kez ekleyip aspire ederek kuyuları yıkayın. Daha sonra, her bir kuyucuğu 1 mikrolitre PBS bazlı engelleme tamponu ile hızlı bir şekilde yükleyin ve slaytı 2 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Yaklaşık 15 numune çalıştırırken, bloke edici maddenin buharlaşmasını önlemek için çalışma tamponunu 120 kuyuya 5 dakikadan daha kısa sürede yüklemek için tek kanallı bir pipet kullanmalıyız.

Slayt blokajı sırasında antikor konjuge altın nanoçubuklardan oluşan bir çözelti hazırlamaya başlayın. Blokaj bitmeden yaklaşık 30 dakika önce, plazma veya serum örneklerini oda sıcaklığında bir su banyosunda hızla çözün. Süspansiyonların homojen olduğundan emin olmak için çözülmüş numuneleri 30 saniye boyunca vorteksleyin. Ardından, protein agregatlarını ve diğer kalıntıları çökeltmek için numuneleri 500 x g'da 15 dakika santrifüjleyin.

Süpernatanların 10 mikrolitrelik alikotlarını taze tüplere aktarın ve PBS ile bire bir seyreltme yapın. Seyreltilmiş numuneleri uygun şekilde hafif girdaplama veya ters çevirme ile karıştırın. Slayt engelleme bittiğinde, engelleme tamponunu aspire edin ve kuyucukları 1 mikrolitrelik PBS ile üç kez yıkayın. Numuneleri, kuyu başına 1 mikrolitre ve numune başına 8 kopya ile hemen kuyucuklara yükleyin.

Eksozom standartlarını aynı şekilde uygun kuyulara yükleyin. Slaytı 4 santigrat derecede bir buzdolabında 12 ila 18 saat inkübe edin. Daha sonra, kuyucukları aspire edin ve her bir kuyuyu 1 mikrolitre PBS ile bir kez yıkayın. Her bir oyuğa 1 mikrolitre antikor konjuge altın nanoçubuk süspansiyonu yükleyin ve slaytı 2 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, nanoçubuk süspansiyonunu aspire edin ve slaytı% 0.01 Polisorbat-20 ile desteklenmiş PBS'de bir karıştırıcı kullanarak 10 dakika boyunca yıkayın. Daha sonra kuyucukları aspire edin ve slaytı dönen bir karıştırıcı üzerinde 10 dakika boyunca deiyonize suda yıkayın. Suyu çıkarın ve slaytı karanlık alan mikroskobuna getirmeden önce temiz bir Petri kabında kurumaya bırakın.