Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama
28 Mart 2014
Akış sitometresi ile bağışık hücrelerin tanımlanmış alt grupları ile nanopartikül etkileşim analizi.
Bu prosedürün genel amacı, akış sitometrisi ile birincil bağışıklık hücresi alt popülasyonları ile floresan nanopartikül etkileşimlerini tespit etmektir. Bu, ilk önce ilgilenilen hücrelerin nanopartiküllerle muamele edilmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adımda, hücreler hücreye özgü yüzey belirteçlerine karşı antikor ile etiketlenir ve daha sonra akış sitometrisi ile analiz edilir.
Sonuç olarak, nanopartiküllerin bireysel bağışıklık hücresi popülasyonları ile etkileşimi ölçülebilir. Bu tekniğin mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu teknikle, nanopartiküller tarafından indüklenen floresan yoğunluklarındaki varyasyonların, yapışık olmayan hücre popülasyonlarında ölçülebilmesidir Kandaki nanopartikül içselleştirmesi için, lökositler veya saflaştırılmış monositler, kuyu başına bir mililitre içinde ilgilenilen hücrelerin beşte beşi ile beş kez 10 ila beşte bir kez kaplanarak başlar. 12 oyuklu bir plakanın her kuyusunda.
Daha sonra, her bir deney kuyucuğuna 10 mikrolitre yeni hazırlanmış çalışan floresan silikon dioksit nanopartikül süspansiyonu ekleyin ve bu sırada işlenmemiş kontrol kuyularına eşit hacimde tam ortam ekleyin. 37 santigrat derecede bir saatlik içselleştirmeden sonra, numuneleri ayrı ayrı 1.5 mililitrelik polipropilen tüplere aktarın ve daha sonra numuneleri 6.000 kez G ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca döndürün. CD 14 ile hücreleri mavi inkübe etmek için her hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini 10 mikrolitre insan antikorunda bir ila 11 oranında dört santigrat derecede 10 dakika boyunca çalışan tamponda inkübe edin. Bağlanmamış antikoru bir mililitre çalışma tamponunda yıkadıktan sonra, hücreleri akış sitometrik analizi için 200 mikrolitre taze çalışma tamponunda yeniden süspanse edin.
Ardından, spektral yayılma telafisini ayarlamak için, akış sitometrisi yazılımındaki cihaz ayarları kutusunu açın, ardından düşük akışkan hızında antikor, etiketlenmemiş nanopartikül içermeyen bir numune alın. Floresan nanopartiküllerin varlığında kompanzasyon ayarlarının ayarlanması, prosedürün en zor kısmıdır, çünkü nanopartiküller yan saçılmaya müdahale edebilir Başarıyı sağlamak için, ilgilenilen hücre popülasyonunun bir kapısı tanımlanmalıdır Voltaj kanallarını düzenleyerek ileri ve yan saçılmayı manuel olarak ayarlayın. Daha sonra istenen hücre popülasyonunun etrafına uygun büyüklükte bir kapı çizin.
Etiketsiz başka bir numune yükleyin ve cihaz ayarları kutusundaki kompanzasyon sekmesini açın. Yayılma kanalındaki floresan yoğunluğu florokrom pozitif ve negatif popülasyonlar için kabaca aynı olana kadar edinme sırasında telafi faktörünü ayarlayın. Son olarak, her bir lekeli florokrom kontrol tüpü için kompanzasyonu ayarladıktan sonra, nanopartiküllere yanıt olarak beyaz kan hücresi davranışını daha iyi karakterize etmek için nanopartikül ile muamele edilmiş numuneleri okuyun, içselleştirme testleri az önce gösterildiği gibi gerçekleştirildi.
Örneğin, bu temsili deneyde, üç ana kan lökosit alt popülasyonu, PBMC izolasyonundan sonra ileri ve yan saçılma ile açıkça tanımlandı. Ayrıca, fz silikon dioksit işleminden sonra, lenfositler, monositler ve granülositler, floresan yoğunlukları ile belirtildiği gibi farklı nanopartikül içselleştirme oranları sergiledi. Bu görüntülerde, pbmc'den saflaştırılmış primer CD 14 pozitif monositlerde nanopartikül içselleştirmesi gösterilmiştir.
Bu saçılma grafikleri, fitz'in silikon dioksit nanopartiküllerinin varlığında CD 14 pozitif monositlerini gösterir. Histogram, floresan yoğunluğu olarak ifade edilen uygun pozitif hücrelerin nicelleştirilmesini gösterir. Benzer içselleştirme deneyleri, negatif kontrol olarak işlenmemiş hücrelerle artan konsantrasyonlarda fitz'in silikon dioksit nanopartikülleri ile muamele edilen TP bir monositleri ile gerçekleştirildi.
Nokta grafikleri, nanopartikül içselleştirmesinden sonra TP bir hücre hattında değişmeyen bir ileri saçılma ile yan saçılmadaki doza bağlı artışı göstermektedir. Bu grafiklerden elde edilen veriler, fitz'in silikon dioksit nanopartikülleri ile tedavinin, bağışıklık hücreleri ve nanopartiküller arasındaki etkileşimler hakkında daha fazla bilgi edinmek için hücre içi granülerliğin arttırılmasıyla vurgulanan monositlerde doza bağlı bir içselleştirmeyi indüklediğini, mikrogliaların yedi gün boyunca kültürlendiğini göstermektedir in vitro ve bir saat boyunca nanopartiküllerle inkübe edildi. Floresan mikroskobu, çok sayıda GFP negatif, yapışık olmayan astrosit ve bazı GFP pozitif hücreler içeren karışık bir primer glial hücre kültürünü gösterdi.
Bu temsili deneyde, üç glial alt popülasyon, tek bir CD 11 B antikoru boyama CD 11 B, negatif GFP negatif astrositler ve diğer glial hücreler, mikroglial CD 11 B pozitif GFP negatif hücreler ve bir CD 11 B pozitif GFP pozitif alt popülasyonu ile akış sitometrisi ile ayırt edilebilir. Son iki alt popülasyon, GFP pozitif popülasyonu tarafından biraz artan bir eksiklik ile nanopartikülleri içselleştirebilir. Nanopartikül içselleştirmesi, çubuk domin silikon dioksit nanopartikülleri kullanılarak bu görüntüde gösterildiği gibi konfokal mikroskopi ile daha fazla doğrulanabilir.
Bu prosedürü denerken, floresan boyaların ağartılmasını önlemek için numuneleri karanlıkta tutmayı ve antikor inkübasyonu sırasında numuneleri dört derecede tutmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, nanopartiküllerin hücre içi lokalizasyonu ile ilgili ek soruları yanıtlamak için konfokal mikroskopi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, floresan nanopartiküllerin primer bağışıklık hücre alt popülasyonları ile etkileşimini akış sitometri kullanarak incelemektedir. Yöntem, çeşitli bağışıklık hücrelerinde nanopartikül içselleştirmesinin kantitasyonunu sağlayarak, bu hücrelerin davranışı hakkında bilgiler verir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Nanoteknoloji
- Akış Sitometrisi
Arka Plan
- Nanopartiküller bağışıklık hücre etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir.
- Akış sitometrisi, floresan kantitasyonu için mikroskopi üzerinde avantajlar sunar.
- Nanopartikül içselleştirmesini anlamak, terapötik stratejiler hakkında bilgi sağlayabilir.
- Farklı bağışıklık hücre tipleri, nanopartiküllere farklı tepkiler gösterebilir.
Çalışmanın Amacı
- Nanopartiküllerin bağışıklık hücre alt popülasyonları ile etkileşimini analiz etmek.
- Farklı hücre tiplerinde nanopartikül içselleştirme oranlarını kantitatif olarak belirlemek.
- Nanopartikül tedavisine bağışıklık tepkilerinin anlaşılmasına katkıda bulunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Primer bağışıklık hücreleri, floresan silikon dioksit nanopartikülleri ile tedavi edildi.
- Hücreler, akış sitometrik analiz için spesifik antikorlarla etiketlendi.
- Nanopartikül müdahalesini hesaba katmak için tazminat ayarları yapıldı.
- Nanopartikül alımını değerlendirmek için içselleştirme tahlilleri yapıldı.
Ana Sonuçlar
- Farklı bağışıklık hücre popülasyonları, nanopartikül içselleştirme oranlarında farklılık gösterdi.
- Akış sitometrisi, floresan yoğunluğuna göre hücre tiplerini etkili bir şekilde ayırt etti.
- Içselleştirme, ek mikroskopi teknikleri ile doğrulandı.
- Sonuçlar, monosit nanopartikül alımında doza bağımlı bir ilişki olduğunu gösterdi.
Sonuçlar
- Çalışma, nanopartiküllerin bağışıklık hücreleri ile etkileşimlerini analiz etmede akış sitometrisinin kullanımını göstermektedir.
- Bulgular, nanopartiküllerin bağışıklık tepkilerini nasıl etkileyebileceğini anlamak için katkıda bulunur.
- İleri araştırmalar, immünolojideki nanopartiküllerin terapötik uygulamalarını araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables quantitative assessment of nanoparticle internalization in primary immune cell subpopulations, supporting target validation and mechanistic de-risking in nanotherapeutic development. By providing dose-dependent and cell-type-specific uptake data, it enhances predictive confidence in early discovery and informs go/no-go decisions for nanoparticle-based interventions. The approach addresses a key discovery-stage challenge: translating nanoparticle-cell interactions into actionable, reproducible metrics for portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying nanoparticle uptake across immune subsets, clarifying which cell populations engage with nanocarriers.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized, reproducible measurement of internalization via fluorescence intensity and side-scattered light shifts.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying cell types with high or low nanoparticle affinity, guiding target selection for immunomodulatory nanotherapies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated immune cell systems for downstream screening by establishing baseline nanoparticle interaction profiles.
- Quantitative Outputs: Generates fluorescence intensity and SSC metrics that enable standardized, comparable readouts across conditions and time points.
- Platform Reuse: Supports scalable screening workflows through consistent gating, compensation, and antibody labeling protocols applicable to diverse nanoparticle formulations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Extends to primary microglia from mutant mice, enabling CNS-targeted nanoparticle studies in disease-relevant immune models.
- Translational Continuity: Connects flow cytometry findings to confocal microscopy confirmation, strengthening mechanistic interpretation for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs advancement decisions by revealing differential internalization rates, such as GFP-positive microglial subpopulations showing altered nanoparticle uptake.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target engagement screening to preclinical mechanistic evaluation, particularly for immunomodulatory nanotherapies where immune cell interaction profiles are critical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking nanoparticle exposure to measurable changes in cell granularity and fluorescence, clarifying mechanisms of immune cell activation or modulation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized isolation, labeling, and compensation steps that ensure reproducible quantification of nanoparticle-cell interactions.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity, SSC shifts) that enable comparison of internalization across cell types, concentrations, and time points.
- Translational Research: Connects to preclinical validation via orthogonal confirmation with confocal microscopy, aligning with biomarker-aligned mechanistic de-risking.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across nanoparticle formats (e.g., FITC-SiO₂, Rhodamine-SiO₂) and immune models (human blood leukocytes, murine microglia), reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by delivering cell-resolved, quantitative data on nanoparticle internalization, improving target confidence in immunomodulatory strategies.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined compensation protocols and antibody panels, minimizing variability across users and sites.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying early which immune subsets are prone to nanoparticle engagement, reducing late-stage biological risk in nanotherapeutic development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by highlighting nanoparticle formulations with favorable or undesirable immune cell interaction profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry compensation, particularly to address nanoparticle-induced side-scattering interference during spectral overlap correction.
- Dependent on access to flow cytometers with fluorescence and scatter detection capabilities, along with antibody panels for immune cell subset identification.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies and compensation settings to ensure consistent data interpretation between discovery and preclinical groups.
- Requires adaptation when applied to different model systems (e.g., adherent vs. non-adherent cells, human vs. murine primary cells) to maintain assay fidelity.
- Practical limitation: Nanoparticle fluorescence or scatter properties may interfere with certain fluorochromes, requiring careful panel design and compensation validation as noted in the protocol.
