Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Akış sitometresi ile bağışık hücrelerin tanımlanmış alt grupları ile nanopartikül etkileşim analizi.

Bu prosedürün genel amacı, akış sitometrisi ile birincil bağışıklık hücresi alt popülasyonları ile floresan nanopartikül etkileşimlerini tespit etmektir. Bu, ilk önce ilgilenilen hücrelerin nanopartiküllerle muamele edilmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adımda, hücreler hücreye özgü yüzey belirteçlerine karşı antikor ile etiketlenir ve daha sonra akış sitometrisi ile analiz edilir.

Sonuç olarak, nanopartiküllerin bireysel bağışıklık hücresi popülasyonları ile etkileşimi ölçülebilir. Bu tekniğin mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu teknikle, nanopartiküller tarafından indüklenen floresan yoğunluklarındaki varyasyonların, yapışık olmayan hücre popülasyonlarında ölçülebilmesidir Kandaki nanopartikül içselleştirmesi için, lökositler veya saflaştırılmış monositler, kuyu başına bir mililitre içinde ilgilenilen hücrelerin beşte beşi ile beş kez 10 ila beşte bir kez kaplanarak başlar. 12 oyuklu bir plakanın her kuyusunda.

Daha sonra, her bir deney kuyucuğuna 10 mikrolitre yeni hazırlanmış çalışan floresan silikon dioksit nanopartikül süspansiyonu ekleyin ve bu sırada işlenmemiş kontrol kuyularına eşit hacimde tam ortam ekleyin. 37 santigrat derecede bir saatlik içselleştirmeden sonra, numuneleri ayrı ayrı 1.5 mililitrelik polipropilen tüplere aktarın ve daha sonra numuneleri 6.000 kez G ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca döndürün. CD 14 ile hücreleri mavi inkübe etmek için her hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini 10 mikrolitre insan antikorunda bir ila 11 oranında dört santigrat derecede 10 dakika boyunca çalışan tamponda inkübe edin. Bağlanmamış antikoru bir mililitre çalışma tamponunda yıkadıktan sonra, hücreleri akış sitometrik analizi için 200 mikrolitre taze çalışma tamponunda yeniden süspanse edin.

Ardından, spektral yayılma telafisini ayarlamak için, akış sitometrisi yazılımındaki cihaz ayarları kutusunu açın, ardından düşük akışkan hızında antikor, etiketlenmemiş nanopartikül içermeyen bir numune alın. Floresan nanopartiküllerin varlığında kompanzasyon ayarlarının ayarlanması, prosedürün en zor kısmıdır, çünkü nanopartiküller yan saçılmaya müdahale edebilir Başarıyı sağlamak için, ilgilenilen hücre popülasyonunun bir kapısı tanımlanmalıdır Voltaj kanallarını düzenleyerek ileri ve yan saçılmayı manuel olarak ayarlayın. Daha sonra istenen hücre popülasyonunun etrafına uygun büyüklükte bir kapı çizin.

Etiketsiz başka bir numune yükleyin ve cihaz ayarları kutusundaki kompanzasyon sekmesini açın. Yayılma kanalındaki floresan yoğunluğu florokrom pozitif ve negatif popülasyonlar için kabaca aynı olana kadar edinme sırasında telafi faktörünü ayarlayın. Son olarak, her bir lekeli florokrom kontrol tüpü için kompanzasyonu ayarladıktan sonra, nanopartiküllere yanıt olarak beyaz kan hücresi davranışını daha iyi karakterize etmek için nanopartikül ile muamele edilmiş numuneleri okuyun, içselleştirme testleri az önce gösterildiği gibi gerçekleştirildi.

Örneğin, bu temsili deneyde, üç ana kan lökosit alt popülasyonu, PBMC izolasyonundan sonra ileri ve yan saçılma ile açıkça tanımlandı. Ayrıca, fz silikon dioksit işleminden sonra, lenfositler, monositler ve granülositler, floresan yoğunlukları ile belirtildiği gibi farklı nanopartikül içselleştirme oranları sergiledi. Bu görüntülerde, pbmc'den saflaştırılmış primer CD 14 pozitif monositlerde nanopartikül içselleştirmesi gösterilmiştir.

Bu saçılma grafikleri, fitz'in silikon dioksit nanopartiküllerinin varlığında CD 14 pozitif monositlerini gösterir. Histogram, floresan yoğunluğu olarak ifade edilen uygun pozitif hücrelerin nicelleştirilmesini gösterir. Benzer içselleştirme deneyleri, negatif kontrol olarak işlenmemiş hücrelerle artan konsantrasyonlarda fitz'in silikon dioksit nanopartikülleri ile muamele edilen TP bir monositleri ile gerçekleştirildi.

Nokta grafikleri, nanopartikül içselleştirmesinden sonra TP bir hücre hattında değişmeyen bir ileri saçılma ile yan saçılmadaki doza bağlı artışı göstermektedir. Bu grafiklerden elde edilen veriler, fitz'in silikon dioksit nanopartikülleri ile tedavinin, bağışıklık hücreleri ve nanopartiküller arasındaki etkileşimler hakkında daha fazla bilgi edinmek için hücre içi granülerliğin arttırılmasıyla vurgulanan monositlerde doza bağlı bir içselleştirmeyi indüklediğini, mikrogliaların yedi gün boyunca kültürlendiğini göstermektedir in vitro ve bir saat boyunca nanopartiküllerle inkübe edildi. Floresan mikroskobu, çok sayıda GFP negatif, yapışık olmayan astrosit ve bazı GFP pozitif hücreler içeren karışık bir primer glial hücre kültürünü gösterdi.

Bu temsili deneyde, üç glial alt popülasyon, tek bir CD 11 B antikoru boyama CD 11 B, negatif GFP negatif astrositler ve diğer glial hücreler, mikroglial CD 11 B pozitif GFP negatif hücreler ve bir CD 11 B pozitif GFP pozitif alt popülasyonu ile akış sitometrisi ile ayırt edilebilir. Son iki alt popülasyon, GFP pozitif popülasyonu tarafından biraz artan bir eksiklik ile nanopartikülleri içselleştirebilir. Nanopartikül içselleştirmesi, çubuk domin silikon dioksit nanopartikülleri kullanılarak bu görüntüde gösterildiği gibi konfokal mikroskopi ile daha fazla doğrulanabilir.

Bu prosedürü denerken, floresan boyaların ağartılmasını önlemek için numuneleri karanlıkta tutmayı ve antikor inkübasyonu sırasında numuneleri dört derecede tutmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, nanopartiküllerin hücre içi lokalizasyonu ile ilgili ek soruları yanıtlamak için konfokal mikroskopi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.