Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Bu prosedürün genel amacı, floresan nanopartiküllerin primer bağışıklık hücresi alt popülasyonları ile olan etkileşimlerini akış sitometrisi ile tespit etmektir. Bu işlem, öncelikle ilgili hücrelerin nanopartiküllerle tedavi edilmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adımda, hücreler hücreye özgü yüzey belirteçlerine karşı antikorlarla işaretlenir ve ardından akış sitometrisi ile analiz edilir.

Nihayetinde, nanoparçacıkların tekil bağışıklık hücresi popülasyonlarıyla olan etkileşimi ölçülebilir. Bu tekniğin mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, nanoparçacıkların tetiklediği floresans yoğunluğu değişimlerininlele yapışmayan hücre popülasyonlarında nicelleştirilebilmesidir. Kan lökositlerinde veya saflaştırılmış monositlerde nanoparçacık internalizasyonu için, 12 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna, ilgilenilen hücrelerden 5 × 10⁵ tanesini bir mililitrede olacak şekilde ekleyerek başlayın.

Ardından, her bir deneysel kuyucuğa 10 µL taze hazırlanmış çalışan floresan silikon dioksit nanopartikül süspansiyonu ekleyin; aynı anda işlem görmemiş kontrol kuyucuklarına da eşit hacimde tam besiyeri ekleyin. 37 °C'de bir saatlik internalizasyonun ardından, örnekleri bireysel 1,5 mL polipropilen tüplere aktarın ve hücreleri CD14 ile boyamak için örnekleri oda sıcaklığında 6.000 ×g'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Her bir hücre süspansiyonundan 100 µL'yi, çalışma tamponunda (running buffer) 1:11 oranında 10 µL insan antikoru ile 4 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Bağlanmamış antikoru 1 mL çalışma tamponu ile yıkayıp uzaklaştırdıktan sonra, hücreleri akış sitometrik analiz için 200 µL taze çalışma tamponu içinde yeniden süspande edin.

Ardından, spektral taşma kompanzasyonunu ayarlamak için akış sitometrisi yazılımındaki cihaz ayarları kutusunu açın ve düşük akış hızında antikorla işaretlenmemiş nanopartikül içermeyen bir örnek alın. Floresan nanopartiküller yan saçılımı etkileyebileceği için kompanzasyon ayarlarının nanopartiküller varlığında yapılması prosedürün en zor kısmıdır; başarıyı garanti etmek için ilgilenilen hücre popülasyonunun bir kapısı (gate) tanımlanmalıdır. Voltaj kanallarını düzenleyerek ileri ve yan saçılımı manuel olarak ayarlayın. Ardından, istenen hücre popülasyonunun etrafına uygun büyüklükte bir kapı çizin.

Etiketlenmemiş başka bir numune yükleyin ve cihaz ayarları kutusundaki kompanzasyon sekmesini açın. Florokrom pozitif ve negatif popülasyonlar için taşma kanalındaki floresan yoğunluğu yaklaşık olarak eşitlenene kadar veri toplama sırasında kompanzasyon faktörünü ayarlayın. Son olarak, tekli boyanmış her bir florokrom kontrol tüpü için kompanzasyon ayarlandıktan sonra, nanopartiküllere yanıt olarak beyaz kan hücresi davranışını daha iyi karakterize etmek amacıyla, az önce gösterildiği gibi internalizasyon analizleri gerçekleştirilerek nanopartikülle işlem görmüş numuneleri okuyun.

Örneğin, bu temsili deneyde, PBMC izolasyonunun ardından forward ve side scattering ile üç ana kan lökosit alt popülasyonu net bir şekilde tanımlanmıştır. Ayrıca, fz silikon dioksit uygulaması sonrası lenfositler, monositler ve granülositler, floresans yoğunluklarının gösterdiği üzere farklı nanopartikül internalizasyon hızları sergilemiştir. Bu görüntülerde, pbmc'den saflaştırılmış primer CD 14 pozitif monositlerde nanopartikül internalizasyonu gösterilmektedir.

Bu dağılım grafikleri, fitz silikon dioksit nanopartiküllerinin varlığındaki CD 14 pozitif monositleri göstermektedir. Histogram, floresan yoğunluğu olarak ifade edilen fitzy pozitif hücrelerin miktarını örneklemektedir. Benzer internalizasyon deneyleri, negatif kontrol olarak tedavi edilmemiş hücreler kullanılarak, artan konsantrasyonlarda fitz silikon dioksit nanopartikülleri ile tedavi edilen TP one monositleri ile gerçekleştirilmiştir.

Nokta grafikleri, nanoparçacık internalizasyonu sonrası TP one hücre hattında ileri saçılmanın değişmediği, ancak yan saçılmanın doz bağımlı arttığını göstermektedir. Bu grafiklerden elde edilen veriler, fitz silikon dioksit nanoparçacıkları ile tedavinin, hücre içi granülite artışı ile belirginleşen, monositlerde doz bağımlı bir internalizasyona yol açtığını göstermektedir. İmmün hücreler ve nanoparçacıklar arasındaki etkileşimler hakkında daha derin bilgi edinmek amacıyla, mikroglialar in vitro ortamda yedi gün boyunca kültüre edilmiş ve bir saat boyunca nanoparçacıklarla inkübe edilmiştir. Floresan mikroskopi, çok sayıda GFP negatif non-adherent astrosit ve bazı GFP pozitif hücrelerin bulunduğu karma bir primer glial hücre kültürüne işaret etmiştir.

Bu temsili deneyde, tek bir CD 11 B antikor boyamasıyla akış sitometrisi kullanılarak üç glial alt popülasyon ayırt edilebilmiştir: CD 11 B negatif GFP negatif astrositler ve diğer glial hücreler, mikroglial CD 11 B pozitif GFP negatif hücreler ve CD 11 B pozitif GFP pozitif bir alt popülasyon. Son iki alt popülasyon, GFP pozitif popülasyonda hafifçe artmış bir yeterlilikle nanoparçacıkları internalize edebilmektedir. Nanoparçacık internalizasyonu, çubuk şeklinde silikon dioksit nanoparçacıkları kullanılarak bu görüntüde gösterildiği üzere konfokal mikroskopi ile daha ileri düzeyde doğrulanabilir.

Bu prosedürü uygularken, floresan boyaların solmasını önlemek için örneklerin karanlıkta tutulması ve antikor inkübasyonu sırasında örneklerin dört derece sıcaklıkta tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, nanopartiküllerin hücre içi lokalizasyonu hakkında ek sorularye yanıt bulmak için konfokal mikroskopi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.