Exosome Kantifikasyon ve Boyut Ölçüm Yenilikçi Yöntem

Bu prosedürün amacı, eksozomları boyutlarına göre analiz etmek ve yarı otomatik bir yöntemle bir nanopartikül izleme analizi veya NTA cihazı kullanarak bunları ölçmektir. Bu, insan kanından bir eksozom peleti elde etmek için diferansiyel merkezleme adımları kullanılarak gerçekleştirilir. Eksozomlar, uygun saçılma yoğunluğunu elde etmek için başlangıç plazması miktarı için önceden belirlenmiş bir konsantrasyonda yeniden süspanse edilir.

NTA sırasında, süspansiyon daha sonra eksozomları daha büyük parçacıklardan ayırmak için filtrelenir. Daha sonra, NTA cihazının kalibrasyonu, 200 nanometre boyutlu polistiren parçacıkları içeren bir kontrol süspansiyonu kullanılarak gerçekleştirilir. Eksozom çözeltisi daha sonra NTA cihazına enjekte edilir ve son test gerçekleştirilmeden önce bir ön test gerçekleştirilerek NTA'nın ideal ayarı seçilir.

Sonuç olarak, ölçülen tüm parçacıkların niceliklerini ve parçacıkların boyutlarına göre listelenmesini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntemin gösterilmesi kritiktir, çünkü en iyi sonuçları elde etmek için hazırlanan her bir eksozom çözeltisi için çözelti ve ayarın ayrı ayrı yapılması gerekir. Ölçülen eksozomlar, canlı görüntü modunun ekran başına yaklaşık 600 parçacık göstermesi için I konsantrasyonunda olmalıdır.

Ayrıca, ölçüm için en uygun hassasiyet aralığını bulmak için bir ön test yapılmalıdır. Yüksek bir hassasiyet ayarı, daha küçük parçacıkların görselleştirilmesine yol açar, ayrıca arka plan gürültüleriyle ilgili sorunları da artırır. Prosedür, laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Anto May tarafından gösterilecektir Eksozom hazırlığına başlamak için, toplam dokuz mililitre boyunca veniponksiyon yoluyla üç sitrat tüpünde tam kan toplayın.

Daha sonra kanı 15 mililitrelik bir Falcon tüpüne dökün, hücrelerin plazmadan ayrılmasını başlatmak için numuneyi 20 dakika boyunca dört santigrat derece boyunca 1.500 G'de santrifüjleyin. S'nin yeni bir 15 mililitrelik Falcon tüpüne aktarın. Daha sonra, tüm hücreleri plazmadan çıkarmak için numuneyi dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 2.800 G'de tekrar santrifüjleyin.

Hücresiz plazmayı veya CFP'yi tüp başına bir mililitre olacak şekilde ultrasantrifüj tüplerine aktarın. Daha sonra, eksozomları tüketmek için CFP'yi 100.000 G'de dört santigrat derecede 90 dakika santrifüjleyin. 900 mikrolitre süpernatanı çıkarın ve ultrasantrifüj tüpünde kalan 100 mikrolitredeki peleti yeniden süspanse edin.

900 mikrolitre PBS santrifüjü ekledikten sonra, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 100.000 G'de kazanırsınız. Daha önce olduğu gibi, sırtüstü ajanın 900 mikrolitresini çıkarın ve peletleri kalan 100 mikrolitre ile yeniden süspanse edin. Beş ila 20 mikrolitre Resus süspansiyonunu 40 mililitre damıtılmış suya aktarın.

Eksozomları daha büyük parçacıklardan ayırmak için süspansiyonu 450 nanometrelik bir filtreden geçirin. Partikül izleme cihazını kullanmak için partikül ölçümü için bu son süspansiyonu kullanın. İlk olarak, yazılım simgesine çift tıklayarak programı başlatın.

Protokol boyunca aralarında geçiş yapmak için çeşitli yazılım sekmelerine tıklayın. Ekrandaki yönergeleri izleyin. Başlatma yordamının otomatik olarak uygulanması için, hem hücre kalitesi denetimi hem de otomatik hizalama kutularını seçin.

Gerekirse bu adımlardan herhangi biri, hücre kontrolü sekmesindeki A veya B düğmesine basılarak ayrı ayrı tekrarlanabilir. Atık çözeltiyi toplamak için görünüm portunun altına bir beher yerleştirin ve sisteme hava kabarcıkları enjekte etmeyin. Nanopartikül izleme analizinin veya NTA cihazının giriş ve görünüm portunu açın ve giriş portundan hücre kanalına şırınga ile 10 mililitre damıtılmış su enjekte edin.

Son miktarda su enjekte edilirken giriş ve çıkış portunu hemen kapatın. Ölçüm hücresinde hava kabarcığı olmadığından emin olun. Üzerine tıklayarak hücre kalite kontrolünü gerçekleştirin. Tamam.

Yazılım, yazılımın canlı görüntü ekranında herhangi bir parçacık hala görselleştiriliyorsa, veya kalite kontrolünün sonucu sadece iyi veya kötüyse, birkaç saniye sonra hücre kalitesi sonucunu gösterecektir, kalan parçacıklar ölçüm hücresinden çıkarılana kadar distal su enjeksiyonunu tekrarlayın L. Partikül birikimini önlemek için her ölçümden sonra bu adımı tekrarlayın. Daha sonra, tek tip, 200 nanometre boyutlu polistiren parçacıkları içeren bir kontrol süspansiyonu hazırlayın. Lazer ve mikroskobun odaklarını hizalamak için, cihaz üreticisi tarafından sağlanan süspansiyon konsantresinden bir damla 500 mililitre damıtılmış suya ekleyin, bu da canlı görüntüde ekran başına 600 artı veya eksi 100 parçacık görüntülenecek şekilde gerekli konsantrasyonla sonuçlanır.

Hizalama süspansiyonunu, damıtılmış su presi için yapıldığı gibi NTA cihazına enjekte edin. Sistemin iki odağın optimum konumunu otomatik olarak bulacağı otomatik bir rutin olan hizalamayı da başlatmak için tamam. Sistemin artık deneyler için hazır olduğunu belirten bir istem göründüğünde, ölçümü başlatmak için Tamam'a tıklayın.

Bazen, hücreyi% 30'luk bir etanol çözeltisi ile yıkayarak deneyler arasında hücre kanalını manuel olarak temizleyin. Yazılım otomatik bir hata raporu görüntülediğinde kanalı temizleyin. Sistemin ölçümünü yapmak.

İlk olarak, her numune ölçümünden önce kanalı damıtılmış su ile yıkayın. Ardından eksozom süspansiyonunu kanala enjekte edin. Bir sonraki adım, hassasiyeti ayarlamak için yazılımdaki ana parametreleri ayarlamaktır.

Farklı hassasiyet seviyeleri için ekran başına ölçülen partiküller için bir eğri görüntülemek üzere partikül sayısına karşı hassasiyete tıklayarak optimum hassasiyet aralığını bulun. Eğrinin maksimum eğiminden önce bir hassasiyet seviyesi seçin. Daha yüksek bir hassasiyet seviyesi, daha küçük parçacıkların görselleştirilmesine izin verir, ancak aynı zamanda arka plan gürültüsüyle ilgili sorunları da artırır.

Minimum parlaklığı ayarlamak için, eksozom ölçümü için 20 başlangıç parlaklığını seçin. Bu işlevi bir filtre olarak kullanmak için, güçlü ışık saçan parçacıkları köreltmek için bu parametreyi düzenleyin. Deney boyunca gerektiği kadar parlak olan haftalık saçılma artefaktlarını yükseltmek için aşağı doğru düzenleyin.

Ardından, piksel gürültüsünü ve istenmeyen dağınık büyük boyutlu parçacıkları ortadan kaldırmak için bir dijital filtre ayarlayın. Minimum ve maksimum boyutu düzenleyerek, eksozomların ölçümü için 10 ila 500 piksel arasında bir aralık kullanın. Deklanşörü 3,3 milisaniyeye eşit olan 300'e ayarlayarak kameranın açık olduğu süreyi değiştirerek deklanşörü ayarlayın.

Canlı okuma parametrelerini ayarlamak için, canlı görüntü düğmesine tıklayarak herhangi bir noktada dijital ve analog arasında geçiş yapın. Deney boyunca. Numunenin doygunluk durumunu renk kodlu bir gösterge olarak görüntüleyen saçılma yoğunluğu çubuğunu izleyin.

Saçılma çubuğu kırmızıysa eksozomları analiz etmeyin. Ölçüme başlamak için ölçüm sekmesine tıklayın. Çalıştırma seçenekleri dizisinde ayarları seçin.

Her alımdan önce, kontrol hareketini, tekrarlanan bir kontrol parçacık sürüklenme testini seçin, deney sayısını ve aralarındaki zaman gecikmesini seçin. Gerekirse bir numune kontrolü yapın. Son olarak, video alımını çalıştır düğmesine tıklayın.

Yeni pencerede, döngü sayısını ve ölçüm konumlarının sayısını tanımlayın. Minimum süreyi onaylayın. Bir parçacık, tek bir parçacık olarak sayılmak üzere izlenir.

Video çözünürlüğünü ayarlayarak, daha düşük bir çözünürlük, daha kısa bir izleme süresine neden olur. Son olarak, bir dosya adı seçin ve ölçümü başlatmak için Tamam'a tıklayın. Parçacık sayısına karşı duyarlılık eğrisi, parçacıkları bir anda tek bir konumda gösterir.

Otomatik hassasiyet taraması sırasında, grafiğin maksimum eğiminden önce bir hassasiyet değeri seçilir. Bu test deneyinde artefaktlar ortadan kaldırılmaz ve grafiği etkileyebilir. Canlı görüntü ekranında parçacıkların görselleştirilmesi, doğru hassasiyet değerini ayarlamak için yararlıdır.

Çok düşük bir değer, az sayıda partikülün algılanmasına yol açar. Çok yüksek bir değer kötü bir görüntü gösterirken, kaliteli parçacıklar optimum hassasiyet seviyesinde birbirinden iyi izole edilmiş tek bir nokta olarak görünür. Ölçümden sonraki sonuç sekmesi, izlenen toplam partikül sayısı, konum başına ortalama partikül sayısı ve partikül konsantrasyonunun yanı sıra partikül boyutunun partikül sayılarının yüzdesine sayısal oranı dahil olmak üzere parametrelerin okunmasına izin verir.

Ölçümden sonra hesaplanan grafik, parçacıkların boyuta göre dağılımını gösterir. Ekran modundaki simgeler, grafiğin ayarlarını değiştirmek için kullanılabilir. Ayrıca, eksozomları analiz etmenin farklı yolları vardır.

Bu yöntem, kısa sürede sonuç elde etmek için benzer bir yöntem analizini hızlı bir süreçte gerçekleştirmek için çok basit ve zarif bir yöntem gösterir. Birden fazla numuneyi karşılaştırmak için, tüm numuneler için aynı seyreltme seviyesini korumanızı öneririz. Tüm ayarlar hassasiyeti kabul eder ve video çözünürlüğü daha sonra birkaç analiz yazılımı seti kullanılarak değiştirilebilir.

Bu şekilde, eksozom miktarı ve boyutu ile ilgili farklı deneylerde elde edilen verilerin karşılaştırmalı analizi, yarı otomatik bir şekilde kullanılabilir hale gelir.