Name: Exosome Kantifikasyon ve Boyut Ölçüm Yenilikçi Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Öğrenin, nanopartikül izleme analizi ile insan kanından ekzom izolasyonu ve boyutlandırma yöntemini. Bu yarı otomatik yaklaşım, nörobilim ve biyoloji araştırmalarında yüksek hassasiyetli partikül kantifikasyonu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, makalenin eleştirel okuması ve mükemmel editoryal yardım için Christina Ballázs, Hug Aubin ve Jörn Hülsmann'a teşekkür eder. Ayrıca, yazarlar teknik yardım için Gisela Mueller'e teşekkür eder. Yazarlar, yayın maliyetlerini karşılayan fonları sağladığı için Particle Metrix GmbH'ye teşekkür eder.

NOT: Bu çalışmada sunulan deneyler Düsseldorf Üniversitesi&#39;nin kurumsal etik kurulu tarafından onaylanmıştır. 1. Exosome Hazırlık <ol><li> (9 ml toplam) venipunktür yoluyla 3 sitrat tüpleri içerisine tam kan toplamak. Bir 15 ml Falcon tüpü içine kan dökün. </li><li> Plazmadan hücrelerinin ayrılmasını başlatmak için 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 1500 x g&#39;de santrifüjleyin. Yeni 15 ml şahin tüp süpernatant aktarın. </li><li> Plazmadan (; CFP hücre içermeyen plazma) tüm hücreleri çıkarmak için 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 2,800 x g&#39;de santrifüjleyin. Ultrasantrifügasyon tüpler, tüp başına 1 ml CFP aktarın. </li><li> 4 ° C&#39;de 90 dakika boyunca 100,000 x g&#39;de santrifüje eksozomlar tüketmek için. Üstte kalan sıvı kısmın 900 ul çıkarın. Ultrasantrifügasyon tüp içinde kalan 100 ul pelet yeniden askıya. 900 ul PBS ekleyin. </li><li> Tekrar santrifüj 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 100,000 x g&#39;de. Su 900 ul kaldırpernatant. Kalan 100 ul pelet yeniden askıya. </li><li> Aktarım damıtılmış su, 40 ml yeniden süspansiyon 5-20 ul. Daha büyük parçacıklar eksozomlar ayrılması için bir 450 nm filtre ile süspansiyon filtre. Parçacık ölçümü için bu son süspansiyon kullanın. </li></ol> Parçacık Takip Aracı 2. Başlangıç ​​Prosedürü <ol><li> Yazılım simgesine çift tıklayarak programı başlatın. Çeşitli yazılım sekmeleri tıklayın (&quot;Hücre Kontrolü&quot;, &quot;Ölçme&quot;, &quot;Analiz&quot;) protokol boyunca aralarında geçiş yapabilirsiniz. </li><li> Başlangıç ​​prosedürünün otomatik uygulanması için ekrandaki yönergeleri izleyin. Hücre kalite kontrol ve otomatik hizalama hem kutularını seçin. NOT: Bu adımların Ya &quot;hücre kontrolü&quot; sekmesine düğmesini (A) veya (B) tuşuna basarak ayrı gerekirse tekrar edilebilir. </li><li> NTA enstrüman giriş ve çıkış noktasını açın ve 10 m enjekteL giriş deliğinden hücre kanalının içine şırınga ile damıtılmış su. Su son miktarı enjekte ediliyor olarak çıkış deliği kapatın. Atık çözümü toplamak için çıkış portu altında bir behere koyun. Ölçüm hücresi hava kabarcıkları serbest olduğundan emin olun ve sisteme hava kabarcıkları şırınga yok. Hemen giriş deliğini kapatın. </li><li> &quot;Tamam&quot; butonuna tıklayarak hücre kalite kontrolünü gerçekleştirin. Yazılım birkaç saniye sonra hücre kaliteli sonuçlar gösterecektir. </li><li> Herhangi parçacıklar hala yazılım canlı görünümü ekranda görsel veya kalite kontrol sonucu sadece iyi ya da kötü olması durumunda, kalan parçacıklar kadar adımı tekrarlayın 2.3 ölçüm hücresinden çıkarılırsa. Ayrıca partiküllerin birikmesini önlemek için her ölçüm aşamasından sonra 2.3 tekrarlayın. Distile su enjeksiyon yinelenen ve hücre kontrolü &quot;iyi&quot; sonuç vermezse, 2.9 geçin. </li><li> Üniforma 200 nm büyüklüğünde pol içeren bir kontrol süspansiyon hazırlayın; polisitren parçacıklar lazer ve mikroskop odakları hizalamak için kullanılacak. 600 ± 100 parçacıkları canlı görünümünde bir ekranda görüntülenir, öyle ki gerekli konsantrasyon elde etmek üzere damıtılmış su 500 ml, cihaz üreticisi tarafından sağlanan süspansiyon konsantresi bir damla ekleyin. </li><li> Adım 2.3 açıklandığı gibi NTA aracı haline hizalama süspansiyon enjekte edilir. &quot;OK&quot; tuşuna oto uyum, sistem otomatik olarak iki odaklarının optimum pozisyonunu bulacaksınız hangi aracılığıyla otomatik rutin başlatmak için. </li><li> Bir istemi sistemi belirten göründüğünde ölçümü başlatmak için OK üzerine tıklayın, şimdi deneyler için hazır. </li><li> Zaman zaman, bir etanol% 30 çözeltisi ile hücre yıkama ile deneyler arasında el hücre kanalı temizleyin. Yazılım otomatik hata raporu görüntüler her kanalı temizleyin. </li></ol> Örnek 3. Ölçümü <ol><li> Ea önce distile su ile kanal yıkayın(adım 2.3 de tarif edildiği gibi) kanal numune ölçümü. </li><li> Aşama 2.3 de tarif edildiği gibi, kanal içinde (bölüm 1 &#39;de hazırlandı) eksozom süspansiyon enjekte edilir. </li><li> Gerektiğinde yazılım şu ana parametreleri ayarlayın: <ol><li> Duyarlılık. Optimum hassasiyet aralığını bulmak için, farklı hassasiyet seviyeleri için ekran başına ölçülen parçacıklar için bir eğri görüntülemek için düğmeye &quot;Duyarlılık vs Parçacıkların sayısı&quot; üzerine tıklayın. Eğrisinin maksimum eğimi önce hassasiyet seviyesini seçti. Daha yüksek hassasiyet seviyesi daha küçük parçacıkların görselleştirme sağlar, aynı zamanda arka plan gürültü ile ilgili sorunlar artar. </li><li> Asgari Parlaklık. Exosome ölçümü bir filtre olarak bu işlevi kullanmak için 20 bir başlangıç ​​parlaklığını seçti. Dışarı boş güçlü ışık saçılım parçacıklar kadar bu parametreyi düzenler. Eserler saçılma zayıf yükseltmek için aşağı düzenler. Deney boyunca gerektiği gibi parlaklığını Vary. NOT: ışık ParçacıklarÇok güçlü bir örtüşme dağılım ve yanlışlıkla analize dahil edilebilir. </li><li> Min ve Max boyutu. Minimum ve maksimum boyutu düzenleyerek boy parçacıklar piksel gürültü ve istenmeyen dağılım ortadan kaldırmak için bir dijital filtre ayarlayın. Eksozom ölçümü için 10-500 piksel aralığı kullanın. </li><li> Shutter. Kamera 1/300 sn açık süreyi ayarlayın. </li></ol></li><li> Okunan parametreleri Canlı: <ol><li> &quot;Canlı görüntü&quot; butonuna tıklayarak herhangi bir noktada bir dijital ve analog görünümü modus arasında geçiş. </li><li> Deney boyunca bir renk kodlu göstergesi olarak örnek doyma durumunu gösterir saçılma yoğunluğu bar, monitör. Saçılma çubuğu kırmızı ise eksozomlar analiz etmeyin. Böyle bir durumda, daha fazla bu olguyu önlemek için örnek seyreltin. Deneysel durum numune süspansiyonu bir manipülasyon yasaklar varsa, duyarlılık aşağı-regüle veya yazılım-s parlaklığını düzenleyenyarlar ölçüm sonuçlarını iyileştirmek için. NOT: parçacıkların son derece yüksek konsantrasyon ile örnekler incelendiğinde dağılım, bireysel parçacıkları sigorta ve onlar tek parçacık olarak sayılır. </li><li> Ekrandan görme alanında sayılır parçacıkların sayısı not edin. </li></ol></li><li> &quot;Ölçme&quot; sekmesine tıklayın. </li><li> &quot;Run seçenekler&quot; dizisindeki ayarları seçin. <ol><li> Her satın alma öncesinde, bir tekrarlanan çek parçacık sürüklenme testi için &quot;onay hareketi &#39;seçin. Bütün analiz başlamadan önce en az bir kez testi yapın. Sürüklenme daha yüksek 20 mm / sn ise, numune akan durdurur, böylece ölçüm devam etmeden önce bekleyin. </li><li> Deney sayısını (5) ve aralarındaki zaman gecikmesini (0) seçin. </li><li> Bir &quot;örnek çek &#39;Gerekirse gerçekleştirin. Bu test başlangıç ​​prosedürü otomatik hizalama parçasıdır ve gerektiği gibi sonradan tekrar edilebilir. </li&gt; </ol></li><li> Sonunda &quot;run Video kazanım&quot; butonuna tıklayın. Yeni pencerede, döngü sayısını (15) ve ölçüm pozisyonların sayısı (11) tanımlar. NOT: Lazer kafası ve mikroskop 11 farklı pozisyonlarda parçacık numarasını analiz taşınmış olabilir. Deneysel talebe bağlı olarak, deney tek pozisyona veya farklı pozisyonlarda yapılmalıdır karar. <ol><li> Bir parçacık video çözünürlüğü (düşük) ayarlayarak bir bireysel parçacık olarak sayılacak takip edilecek olan minimum süreyi onaylayın. Kısa izleme süresi düşük bir çözünürlükte sonuçları. </li><li> Bir dosya adı seçin ve Ölçümü başlatmak için &quot;Tamam&quot; tıklayın. </li></ol></li></ol> Sonuçların Yorumlanması 4. <ol><li> &quot;Sonuçlar&quot; sekmesinde ölçümden sonra görüntülenen aşağıdaki sonuçları ve parametreleri görüntüle: takip parçacıkların (1) toplam sayısı, parçanın (2) ortalama sayısıpozisyonda, ve (3) parçacık konsantrasyon başına icles. <ol><li> Parçacık numaralarının yüzdesine partikül boyutu (çapı, yüzey ve hacim) sayısal oranı sonucu ortalama tablosunu görüntüleme yanı sıra ortalama ve standart farklılaşma değerleri. </li><li> Birden fazla pik grafik analizinde varsa zirve analizi tablosunu kullanın. Bu tablo, birinci veya ikinci tepe daha küçük olan parçacıkların dağılımını göstermektedir. </li></ol></li><li> Büyüklüklerine göre parçacıkların bir dağılımını görmek için ölçümden sonra hesaplanan grafiği görüntüleyin. Ayarlarını değiştirmek için ekran modunda ve grafiğin üstünde simgeleri kullanınız. </li></ol>

<ol><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThery%2C+C+%22Current+protocols+in+cell+biology+%2F+editorial+board%22">Current protocols in cell biology / editorial board</a>. Bonifacino, J. S. (3.22), (2006).</li>
<li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).</li>
<li>Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> J. Vis. Exp. , e3037(2012).</li>
<li>Konokhova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-scattering+flow+cytometry+for+identification+and+characterization+of+blood+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical%22%5BJournal%5D)">Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles.</a> Journal of biomedical. 17, 057006(2012).</li>
<li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+current+knowledge+of+their+composition%2C+biological+functions%2C+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).</li>
<li>Sokolova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+exosomes+derived+from+human+cells+by+nanoparticle+tracking+analysis+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+surfaces.+B%2C+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy.</a> Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).</li>
<li>Exoquick, ExoQuick-TC and ExoQuick-LP. Polymer-based exosome preciption. System Biosciences. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.systembio.com/microrna-research/exoquick-exosomes/overview">http://www.systembio.com/microrna-research/exoquick-exosomes/overview</a> (2015).</li>
<li>Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigen+presenting+cell+derived+exosomes%2C+based+on+immuno-magnetic+isolation+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry.</a> Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).</li>
<li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator%5BTitle%5D)+AND+%22Amer.+J.+Phys.+Renal+Phys%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).</li>
<li>Carr, B., Warren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Company+profile%3A+NanoSight%3A+delivering+practical+solutions+for+biological+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology.</a> Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).</li>
<li>Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22International+immunology%22%5BJournal%5D)">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> International immunology. 17, 879-887 (2005).</li>
</ol>

Bu çalışma, HHU Tıp Fakültesi Kalp ve Damar Cerrahisi Anabilim Dalı'nın kurumsal fonları tarafından desteklenmiştir. Bu çalışmanın yayın maliyetleri Particle MetrixGmbH tarafından sağlanmıştır.

Bir biyolojik sıvıda eksozom boyutu ve yoğunluğunu ölçmek için bir yeni ve yenilikçi bir yöntem olarak kan ve bu nanoparçacık takip eksozom izolasyonu için detaylı bir protokol göstermektedir. Gösterilen deneylerde, insan periferik kan eksozom kaynağı olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu gibi idrar, balgam, hücre kültürü üstte kalan sıvı, diğer kaynakları, ayrıca test materyali olarak kullanılabilir. İnsanlarda eksozom konsantrasyonunun biyolojik değişkenlik göre farklı bireylerden deneyler, eksozom derece değişen konsantrasyon özelliği olabilir. Ancak, biyolojik test denemesinde parçacıkların konsantrasyonu sonuçları üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Bu nedenle, prob seyreltme için güvenilir ve standart bir yaklaşım gereklidir. Sunulan yöntem eksozom ihtiva eden plazma periferik tam kan, 9 ml elde edilmiştir. Diferansiyel santrifüj kullanılarak bir eksozom pelet izole edilmiştir adım1 ml plazma ve süspansiyona eksozom çalışma örneği meydana getirmek üzere damıtık su 5 ml yeniden süspansiyon haline. Bu ön-tanımlı ayar parçacıkların uygun bir konsantrasyon, NTA sırasında, yani uygun dağılım yoğunluğu ile bize sağladı. Hacmi ve seyreltme açıdan yanında, kullanılan çözeltilerin bir bileşim de büyük önem taşımaktadır. Biz eksozom son yeniden süspansiyon için distile su kullandık. Tabii ki, nihai seyreltme adımı için farklı medya da deney düzeneği gereklerine göre kullanılabilir. Ancak, tamponlama kapasitesi ile test, özellikle iyonik çözeltiler zeta potansiyel ölçümleri durumunda, türbülans bağımsız koşullarda ihtiyatlı bir seyreltme yararlıdır. Birden örneklerin doğrudan karşılaştırma için biz tüm örnekler için aynı seyreltme seviyesini tutmanızı öneririz. Hassasiyet ve video çözünürlüğü hariç tüm ayarlar ZetaView Analizi yazılımı kullanılarak sonradan değiştirilebilir. <p class=Yazarlar burada tanıttı sistem şu anda en uygun enstrüman temsil inanıyorum rağmen &quot;jove_content&quot;&gt;, sadece mevcut NTA sistem değildir. Daha önceki raporlarda bir dizi aynı NTA ilkelerini uygulamak, ancak bazı farklı özelliklere 10 ile birlikte gider başka enstrüman tasarımı sağlayan diğer sistemleri istihdam var. Biz sonuçların örnek işleme ve tekrarlanabilirlik ile ilgili pratik yönleri eksozom değerlendirme için metodolojik dizisi seçiminde merkezi öneme sahip olduğuna inanıyoruz. Biz de ideal bir algılama sistemi ölçümleri sonuçları ile etkileşime girebilir kullanıcı bağlı faktörleri ortadan kaldırmak gerektiğine inanıyoruz. Burada sunulan eksozom analiz yaklaşımı yüksek derecede kolay kullanım kriterlerini yerine getirmektedir. İlave bir avantaj olarak, numune, yarı-otomatik bir analiz, kısa sürede sonuç üreten, hızlı bir şekilde gerçekleşmektedir. Eksozom bir çevrimiçi görselleştirme ga için analizörü yardımcılarıeksozom özellikleri, örneğin, brüt konsantrasyon bir anlık fikir. Burada sunulan ölçüm tekniği çok basit ama şık bir ek antikor etiketli eksozomlann kullanımı ve dedektör önünde bir önceki filtre kullanarak dağınık lazer ışınının yakalama. Bu şekilde, eksozom alt-popülasyonları bulunduğunu seçici floresan boyama teknik erişilebilir yüzey antijenleri ve diğer biyolojik olarak ilgili özelliklerine göre ayırt edilebilir. Bizim parçacık izleme aracının güncel sürümü bir dezavantajı çok yüksek hassasiyet seviyelerinde arka plan gürültüsü gibi eserler hücre kanalı duvarına dayanan, mevcut olabilir olmasıdır. Mevcut sisteme bir teknik çözüm ve iyileştirme yakın gelecekte kullanılabilir hale gelebilir. Kanal duvarına lazer dağılım ışık bu yöntem yansımaları ile bu şekilde artan azalacaktır<html> Ölçülen sinyaller ve elde edilen verilerin ve algılama sınırı düşürücü doğruluğu. Exosome izolasyonu için şu anda kullanılan protokol köklü ve uygulamalı parçacık izleme aracı, 30 nm düşük boyut dağılımı ile son derece hassas çözünürlüğe sahip olmasına rağmen, tespit edilen parçacıklar aslında tamamen doğru eksozomlar olduğuna dair hiçbir garanti yoktur. Bu gibi ölü hücre fragmanları ya da daha büyük bir protein kompleksleri gibi diğer parçacıklar da eksozom süspansiyon içinde mevcut olabilir ve yanlış pozitif sinyallere neden olabilir. Örneğin &quot;kirlilik&quot; elektron mikroskobu (EM), iletim EM ya da tarama EM da olabilir dışı bırakılabilir hangi biri güvenilir bir yöntem. Daha önce önerilen yüzey markerlerinin bir dizi tetraspanin (Tspan), CD81, C63, CD9, vb 11 de dahil olmak üzere dikkat artan bir miktarını, kazanmıştır, ancak ne yazık ki, eksozom için genel ve spesifik bir işaretleyici, şimdiye kadar tanımlanmış edilmiştir. &quot;&gt; Bağımsız olarak eksozom biyoloji, özellikle de eksozom özel işaretleyiciler ile ilgili araştırma, gelecekteki ilerleme, burada sunulan protokol izolasyonu ve eksozom tespiti için güçlü bir yöntem sağlar. Konsantrasyon ve büyüklüğü de kolayca bir yazılım destekli tespit edilebilir basit moda. selektif floresan belirteçler ya da fluoroforun birleştiğinde antikorların eklenmesi muhtemel daha NTA sunulmuştur yaklaşımın olası uygulamalarını geliştirmek olacaktır.

dolaşımdaki eksozom tam işlevi uzun bir süre için bilinmemektedir. Şimdi bile eksozom tam yolu mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir. Eksozomlar taşımak beri antijenler, proteinler ve menşe ebeveyn hücrenin, hücre-hücre sinyal vericiler olarak işlev onları ilgilidir RNA (mRNA ve miRNA) esas öncelik verilmiştir. Pek çok farklı yöntem izolasyonu ve eksozom 1,2 nicel tespiti için literatürde tarif edilmiştir. Ancak, &#39;altın standart&#39; üzerinde görüş birliği ulaşıldı. Bu arada exosome araştırma alanında aktif bilim adamlarının çoğunluğu izolasyonu tutarlı bir yöntem oldukça farklı raporlar ve çalışmalar arasında karşılaştırılabilirlik daha yüksek bir derece elde etmek garanti olduğunu kabul ediyorsunuz. Floresan aktive hücre sıralama (FACS) eksozom analizi 3 için en yaygın ve yaygın bir araçtır. FACS Ben&#39;i varflüoresan işaretleme ile, farklı kökenlerden gelen hücreler bir aşamada karşılaştırılabilir Efit. FACS önemli dezavantajlar daha az bunların boyutunu ölçmek için, eksozomlar çapı 5 30-120 nm arasında değişir ise, bu yöntem, parçacıkların daha küçük 0,5 ila 4 um, tespit için yeterince duyarlı değildir bulunmaktadır. Taramalı elektron mikroskopisi (SEM) ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) partikül boyutu ve eksozom morfoloji analizi için başka araçlar. Ancak, SEM ve TEM hem de numunelerin hazırlanması zaman alıcı, her iki yöntem emek-yoğun adımları dahil olduğunu dezavantajı var ve her buluntu nesil bazı riskler vardır. Her iki yöntem, yüksek numune ve bir numunenin bir parçacık binlerce karakterizasyonu için uygundur. Ayrıca, örnekler çoğu zaman bilgisi, klinik günlük rutin için bir nicel analiz çok kısa bir süre içinde eş zamanlı olarak ya da en azından analiz edilecekgerçekleştirmek zor. Yeni nesil teknikleri artık bize öncesinde yoğun hazırlık çalışmaları (örn, çevresel SEM) olmadan eksozomlar analiz sağlar. Bu modern teknikler hala ortalama sayısı ve boyut dağılımını 6 belirlemek için eksozomlar içeren büyük hacimli süspansiyonları analiz için oldukça sakıncalı. Görselleştirme ve eksozom analizi için diğer bir yüksek ölçüde hassas bir yöntem nanopartikül izleme analizi (NTA) &#39;dir. Bu yöntem, fizik iki prensip yararlanır. İlk olarak, parçacıklar, bir lazer ışını ile ışımaya zaman dağınık ışık ile tespit edilir. İkinci bir fenomen olduğu için uygun bir sıvı süspansiyon içinde farklı parçacıkların difüzyon büyüklükleriyle ters orantılıdır, Brown hareketi olarak da bilinir. Bu durumda hareket, aynı zamanda, sıcaklık ve sıvının viskozitesine bağlıdır. Bununla birlikte, bu oran, doğrudan parçacık büyüklüğü ile ilgilidir ve NTA kullanılır. Yumuşak kullanmaware-tabanlı analiz, tek parçacıklardan saçılan ışığın dijital görüntüler kaydedilir. Dağınık ışık noktalar Arsalar ve hareket onların hızı, toplam partikül sayısı ve büyüklüğü dağılımının belirlenmesini kolaylaştırmak verileri sağlamak. Bu teknik en az 100 nm bir ortalama çapa sahip parçacıkların analiz edilmesi için güçlü bir araçtır. boyutu ve konsantrasyon ölçümleri ZetaView Brown ve Elektroforez Hareket Video Analizi Mikroskop ile yapılmaktadır. Bu (bundan sonra partikül izleme aracı olarak anılacaktır), sıvı örnekleri için yarı-otomatik masa üstü nanoparçacık analiz cihazıdır. Bu parçacık izleme analizörü yanı sıra veri analizi için kullanılan yazılım ile bir dizüstü bilgisayar oluşur. Heterojen biyolojik örnekler, inorganik parçacıkların en çok homojen süspansiyonlar gibi bu yöntem için de uygundur. Bir video kamera ile bir lazer kırılmalı mikroskop parçacıkların tespiti için ve Obse için kullanılanonların hareket rvation. Mikroskop ekseni yatay ve eksozomlar ihtiva eden bir süspansiyon ile doldurulabilir hücre kanalının içine odaklanmış olsa da, lazer ışını dikey yönlendirilmiştir. mikroskop (Şekil 1) üzerinden bir dijital video kamera ile 90 ° altında kaydedilir lazer ışığı yayılımı ile ışınlanmış parçacıklar. saçılan ışığın yoğunluğu, daha büyük partiküller 60 nm çapında gözlenmesini sağlar. Böyle bir ortamda, bir parçacığın parlaklık parçacık büyüklüğü tek göstergesi değildir. Herhangi bir elektrik alanı uygulandığında, parçacık hareketinin Brownian hareketi takip eder ve parçacık boyutuna hesaplamak için bir gösterge olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, cihaz, aynı zamanda, hücre kanalı boyunca bir elektrik alanı uygulamak yeteneğine sahiptir. Bu alana maruz kaldığında, potansiyel, polarizasyon ve süspansiyon eksozom iyonik yük seviyesi, kendi hareket yönünde, daha belirleyici olmaktadır. Bir elektroforetik mo Hız ve yön sonucubility histogramı. Izole eksozomlar analiz için en uygun yöntem bulma bir sorun olsa da, başka bir tür kan, asit, idrar, süt, amniyotik sıvı veya hücre medya gibi farklı medya, gelen eksozom etkili izolasyon yatıyor. Farklı yöntemler Ultrasantrifügasyon 1 dayandığı, şimdiye kadar tarif edilmiştir (örneğin Exoquick gibi) endüstriyel ayırma reaktifleri 7, 8 veya ayrılık ultrafiltrasyon istihdam antijen için manyetik boncuk 9 adımları. Bu protokolde Ultrasantrifügasyon yoluyla eksozom izolasyon tüm süreci göstermek ve partikül izleme aracı vasıtasıyla süspansiyon içeren ortaya çıkan exosome analiz nasıl gösterir. Insan plazması ya da hücre kültür ortamı türetilmiş eksozom analizi için özel hususlar sağlanır.

<table><tbody><tr><td>Sitrat tüpü</td><td>BD</td><td>364305</td><td>BD Vacutainer</td></tr><tr><td>Damıtılmış su</td><td>Braun</td><td>3880087</td><td>Aqua ad iniektabililia</td></tr><tr><td>Falcon tüpü</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td>PP Tüp, Steril 15 ml</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj tüpü</td><td>Beckman</td><td>357448</td><td>Mikrofüj Tüpü Poliallomer 1.5 ml</td></tr><tr><td>Polybead</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>07304</td><td>%2,6 Katılar-Lateks Hizalama Solüsyonu</td></tr><tr><td>Şırınga (Filtre)</td><td>Braun</td><td>4617053V</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Şırınga (ZetaView)</td><td>Braun</td><td>4606051V</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>İğne</td><td>BD</td><td>305180</td><td>BD Künt Dolum İğneli</td></tr><tr><td>Filtre</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16555</td><td>Şırınga filtresi, hidrofilik, 450 &mikro; m</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman</td><td>L8-M</td><td>Rotor: 70Ti Ser. No E21078</td></tr><tr><td>ZetaView</td><td>Parçacık Metrix</td><td>PMX 100, Tip 101</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Rotor: A-4-44</td></tr></tbody></table>

exosome kantifikasyon ve boyut Ölçüm yenilikçi yöntem

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Eksozomların biyolojik önemi son zamanlarda giderek artan miktarda bilimsel ve klinik ilgi kazanmış olsa da, karmaşık yolakları, biyoyararlanımları ve sağlık ve hastalıktaki çeşitli işlevleri hakkında hala çok şey bilinmemektedir. Mevcut çalışma, özellikle onkoloji, jinekoloji ve kardiyoloji alanlarında, farklı insan bozuklukları bağlamında eksozomların (in vitro ve in vivo) varlığına ve davranışına odaklanmaktadır.
Ne yazık ki, ne eksozom izolasyonu için altın standart konusunda bir fikir birliği var, ne de kantitatif analizleri için böyle bir yöntem üzerinde bir anlaşma var. Eksozomların saflaştırılması için birçok yöntem ve ayrıca kantitatif ve kalitatif analizleri için birçok olasılık olduğundan, ideal yaklaşım için bir yöntem kombinasyonu belirlemek zordur. 
Burada, ultrasantrifüjleme ile insan plazmasından izole edildikten sonra eksozomların karakterizasyonu için yarı otomatik bir yöntem olan nanopartikül izleme analizini (NTA) gösteriyoruz. Sunulan sonuçlar, izolasyon için bu yaklaşımın yanı sıra eksozomların ortalama sayısının ve boyutunun belirlenmesinin, taramalı elektron mikroskobu (SEM) gibi diğer yöntemlerle onaylandığı gibi tekrarlanabilir ve geçerli veriler sağladığını göstermektedir.

Bu gösteri için kullanılan örnek% 85 duyarlılık, hassasiyet eğrisinin maksimum eğimi önce (Şekil 2) ile ölçümü için optimum ayarı gösterir. protokol önerildiği gibi parlaklık, min / max değerleri seçildi. 5.3 parçacıkların bir konsantrasyon / ml x parçacıklarının ortalama boyutu, çoğu 0.137 um idi, 0.149 mikron idi ise 10 6, ölçülmüştür. Ölçme işleminden sonra alınan değerler .pdf bir dosya biçimi veya bir veritabanına ihracat için bir .txt olarak raporda kaydedilebilir. tercih edildiği protokolü (bölüm 4) &#39;de tarif edildiği gibi grafik ayarlanabilir. video dizisi de kaydedilir ve daha sonra hat-dışı yeniden analiz için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu tür bir off-line analiz, kameranın ön alıcı ayarları geriye dönük olarak değiştirilemez. Bir ölçüm için en uygun parametre ayarlarını bulmak için, biz burada th açıklamak100 nm polistiren boyutu standart örnek gösterge ayarları e optimizasyonu. iki parametre, video görüntüsü ve parçacık büyüklüğü dağılımına duyarlılık ve / üst büyüklüğünün etkisinin altında ayrıntılı olarak ele alınmıştır. Diğer bütün parametreler Tablo 1 &#39;de özetlenmiştir. Analog ve dijital görüntüler üzerinde (50-94 arasında) duyarlılık etkisinin bir görsel izlenim Şekil 3&#39;te görüntülenmiştir. Görüntülerden elde edilen nicel bilgiler Tablo 1&#39;de ayarlara dayalı, Şekil 4&#39;te sunulmuştur Min Boyutu = 5 ve en büyük boyutu = 200 hassasiyet genel tespit parçacıkların sayısı tipik bir ilişki Şekil 4A&#39;da gösterilmiştir. 50 ve 90 yılları arasında, tespit edilen parçacıkların sayısı duyarlılığı artmış ve 90&gt; hassasiyetleri dramatik olarak artmıştır. Duyarlılık optimum aralığı 66 ve 86 (A) arasında bulunmuştur. Parçacık boyutu dağılımları dif ile elde edilenferent duyarlılığı ayarları Şekil 4B&#39;de gösterilmektedir. Parçacık boyutu dağılımları, üç ayrı ölçümün ortalamasını temsil etmektedir. Oldukça kötü istatistik sonuçlanan sadece birkaç parçacıklar analiz edildi çok düşük bir hassasiyet (duyarlılık = 62, kırmızı eğri) için. analiz parçacıkların sayısı duyarlılığı artmış ve 70 (sarı eğri) ve 86 (tan eğri) arasındaki bir optimum ulaştı. Daha küçük boyutlarda (duyarlılık = 94, mavi eğri) doğru kayması bırakarak parçacıklar ve boyut dağılımının sayısı ile parçacık boyutu dağılımı bir bozulmaya duyarlılık öne artar. Şekil 4C sayısı göre x50 çapının eğilimi (% 50 göstermektedir parçacıklar duyarlılık bir fonksiyonu olarak) bu çapından daha küçüktür. Kırmızı bölge kötü istatistiği (hassasiyet çok düşük) ya da geniş bir dağılım göstermesi sonucunda&gt;% 8 MSB göstermektedir bej aralığı içinde, partikül büyüklüğü MSB% 8&#39;den az ve A&#39;da uygun aralığına tekabülDaha küçük boyutlarda (hassasiyet çok yüksek) kayma ile rı payı. Min Boyutu ve Max Boyutu ayarları Min Boyutu daha küçük ve Max Boyutu daha büyük nokta boyutları ile parçacıkları kaldırmak için dijital görüntülere uygulanan filtreler vardır. Işığı dağıtır yeteneği nedeniyle, bir tanecik, bir dijital görüntü ile ilgili belirli bir büyüklükte bir nokta oluşturur. nokta boyutu piksel sayısı (piksel) olarak ölçülür. Bir parçacık çok iyi (örn, parçacıklar&gt; 200 nm veya agrega) ışık saçar zaman, nokta boyutu, örneğin,&gt; 500 px, oldukça büyüktür. spot büyüklüğü parçacık malzemeye bağlı olarak küçük parçacıklar (örneğin, &lt;20 nm) için (örneğin, &lt;10 px) oldukça küçük. Aynı değillerdir ve bu iki değişken arasında doğrudan bir ilişki olduğu gibi spot büyüklüğü (px) partikül boyutu (nm) ile değiştirilebilir olmayabilir. Min ve Max Boyutu bir optimizasyon kullanıcı gibi aglomeralar (Maks Boyu) ya da küçük olarak istenmeyen nesneleri filtrelemek için izin verirarka plan gürültüsü (Min Boyutu) olarak nesneler. 100 nm boyutlu standart parçacık boyutu dağılımına Min / Maks Boyutu etkisi Şekil 4D (duyarlılık = 82) &#39;de gösterilmiştir. Aralık küçük nokta boyutları ayarlandığında (örneğin, min = 1, max = 52; turuncu eğrisi), analiz parçacıkların sayısı azalır ve sayı tabanlı x50 çapı biraz daha küçük boyutlarda doğru kaydırılır. Büyük noktalar için bir ayar (min = 40, max = 1,000; kırmızı eğri) geniş bir parçacık boyut dağılımının sonuçları büyük boyutlarda doğru kaymıştır. Parçacıkların eşit toplam sayıları elde etmek için, turuncu ve kırmızı hem dağılımlarının aralığı sınırları 80 parçacıkları maç ayarlandı. en uygun ayarlarla dağılımı (dk = 5, max = 200; ten rengi eğrisi) 360 parçacıklardan oluşur. Başarılı bir seri deney eksozom ultra-santrifüj ile izole edildi ve sunulan sistem kullanılarak NTA ile ölçülen ile yapıldı. Elde edilen veriler son derece vardıve tutarlı yeniden üretilebilirlik yüksek düzeyde doğruladı. Diğer izolasyon yöntemleri benzer sonuçlar göstermelidir. Fakat bu seyreltme adımı özellikle kritik bir aşama olarak tespit edilmiştir ve parçacıkların hesaplanan toplam sayısı üzerindeki etkisi yeniden değerlendirilmelidir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/50974/50974fig1.jpg" /> NTA kurulumu Şekil 1. şematik. mikroskop / görüntü ekseni ve lazer ışını hücre kanal kesiti kapısını birbirine dik yönlendirilir. Parçacıkların tarafından saçılan ışık yazılımı &quot;canlı görünüm&quot; penceresinde görüntülenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50974/50974fig2.jpg" /> <stronduyarlılık eğrisi parçacıkların g&gt; Şekil 2. sayısı. duyarlılık eğrisi parçacıkların sayısı otomatik hassasiyet tarama sırasında bir anda bir pozisyonda parçacıkları görüntüler. Bu grafik görselleştirme ilk ölçümler için en iyi tercihlerini belirlemek için kullanılır. Bir hassasiyet değeri grafik yer alan maksimum eğim önce seçilir. Bu eserler bu test deney elimine edilmez ve grafik etkileyebilir unutmamak önemlidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50974/50974fig3.jpg" /> Canlı görünümü ekranda parçacıkların analog ve dijital görüntü. Görselleştirme üzerine duyarlılığı Şekil 3. Etki hem analog (üst satır) An 50 ve 94 arasında hassasiyetleri için görüntülenird dijital (alt sıra) bakıldı. Hassasiyet çok düşük olduğunda, sadece bir kaç partiküller (sol) tespit edilir. Optimum hassasiyet at parçacıklar birbirlerini iyi (orta) izole olarak tek noktalar görünür. Nispeten yüksek hassasiyet parçacıkları bir arada kötü görüntü kalitesi (sağda) yol açan birleştirme at. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50974/50974fig4.jpg" /> Bir kontrol 100 nm polistiren partikül örnek için duyarlılık minimum ve maksimum boyutu ayarları Şekil 4. Etkisi (A) parçacıkların tespit sayıda karşı duyarlılık Arsa.; optimum aralığı, 66-86 eğrisinin azami eğimiyle önce gelir. (B) Partikül büyüklüğü dağılımları birkaç hassasiyet ayarları (62-94 elde); (62), çok düşük ya da çok yüksek için grafikler (94) karşı, 100 nm polistiren kontrol örneği için parçacık boyutu dağılımı toplanmamaktadır. (C) duyarlılık karşı Sayısı tabanlı x50 çapı; bej aralığında x50 hata% 8&#39;den az, uygun aralık 66&#39;dan parçacık boyutu dağılımına Min ve Maks Boyutu 86. (D) etkisi için olduğu; Optimal parametreler (min = 5 ve max = 200), kontrol numunesi için doğru dağıtım yakalamak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Ön-satın alma parametreleri </td></tr><tr><td> Duyarlılık </td><td> değişken </td></tr><tr><td> Panjur </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Kare hızı </td><td> 30 fps </td></tr><tr><td> Çözüm </td><td> Selamgh </td></tr><tr><td> Bisikletler </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Çoklu Devralmalar </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Pozisyon </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> Post-satın alma parametreleri </td></tr><tr><td> Min Parlaklık </td><td> 30 </td></tr><tr><td> Max Boyut </td><td> değişken </td></tr><tr><td> Min Boyutu </td><td> değişken </td></tr></tbody></table> Parçacık izleme aracının ayarı için öncesi ve sonrası satın alma parametreleri Tablo 1. Özeti.

Bu makalede eksozomların tam kandan izolasyonu ve yarı otomatik bir alet kullanılarak nanopartikül izleme ile daha fazla analiz için bir yöntem sunulmaktadır. Sunulan teknoloji, sıvı süspansiyondaki partikülleri görselleştirmek ve analiz etmek için son derece hassas bir yöntem sağlar.

Exosome Kantifikasyon ve Boyut Ölçüm Yenilikçi Yöntem

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Bu prosedürün amacı, yarı otomatik bir yöntem aracılığıyla nanopartikül takip analizi veya NTA cihazı kullanarak eksozomları boyutlarına göre analiz etmek ve miktarlarını belirlemektir. Bu işlem, insan kanından eksozom peleti elde etmek için diferansiyel santrifügasyon basamakları kullanılarak gerçekleştirilir. Uygun saçılım yoğunluğunu elde etmek için eksozomlar, başlangıç plazma miktarı için önceden belirlenmiş bir konsantrasyonda yeniden süspande edilir.NTA sırasında, eksozomları daha büyük partiküllerden ayırmak için süspansiyon filtrelenir. Ardından, 200 nanometre boyutunda polistiren partiküller içeren bir kontrol süspansiyonu kullanılarak NTA cihazının kalibrasyonu gerçekleştirilir. Daha sonra eksozom çözeltisi NTA cihazına enjekte edilir ve nihai testten önce bir ön test yapılarak NTA'nın ideal ayarları seçilir.Sonuç olarak, ölçülen tüm partiküllerin miktar tayininin yapıldığı ve partiküllerin boyutlarına göre listelendiği veriler elde edilebilir. Hazırlanan her eksozom çözeltisi için çözelti hazırlama ve ayar işlemlerinin en iyi sonuçları almak adına ayrı ayrı yapılması gerektiğinden, bu yöntemin gösterimi kritik öneme sahiptir. Ölçülen eksozomlar, canlı izleme modunun ekran başına yaklaşık 600 partikül görüntüleyeceği bir konsantrasyonda olmalıdır.Ayrıca, ölçüm için optimal hassasiyet aralığını belirlemek amacıyla bir ön test gerçekleştirilmelidir. Hassasiyetin yüksek ayarlanması daha fazla küçük parçacığın görüntülenmesini sağlar, ancak arka plan gürültüsüyle ilgili sorunları da artırır. Prosedür, laboratuvarımızdan lisansüstü öğrencisi Anto May tarafından gösterilecektir. Eksozom hazırlığına başlamak için, venipunkiyon yoluyla üç adet sitrat tüpüne toplam dokuz mililitre tam kan toplayın.Ardından kanı 15 milliliter'lik bir Falcon tüpüne aktarın ve hücrelerin plazmadan ayrılmasını başlatmak için örneği 4 °C'de 20 dakika boyunca 1.500 G'de santrifüjleyin. Üst fazı yeni bir 15 milliliter'lik Falcon tüpüne transfer edin. Daha sonra, plazmadaki tüm hücreleri uzaklaştırmak için örneği 4 °C'de 20 dakika boyunca tekrar 2.800 G'de santrifüjleyin.Hücreden arındırılmış plazmayı veya CFP'yi, tüp başına bir mililitre olacak şekilde ultrasantrifüj tüplerine aktarın. Ardından, eksozomları uzaklaştırmak için CFP'yi 4 °C'de 90 dakika boyunca 100.000 G'de santrifüjleyin. Süpernatandan 900 µL çekin ve pellet'i ultrasantrifüj tüpünde kalan 100 µL içerisinde yeniden süspande edin.900 µL PBS ekledikten sonra, 4 °C'de 30 dakika boyunca 100.000 G'de santrifüjleyin. Daha önce yapıldığı gibi, süpernatandan 900 µL uzaklaştırın ve peletleri geri kalan 100 µL ile yeniden süspanse edin. Resus süspansiyonundan 5 ila 20 µL'yi 40 mL distile suya aktarın.Ekzozomları daha büyük partiküllerden ayırmak için süspansiyonu 450 nanometrelik bir filtreden geçirin. Partikül izleme cihazını kullanmak amacıyla partikül ölçümü için bu nihai süspansiyonu kullanın. İlk olarak, yazılım simgesine çift tıklayarak programı başlatın.Protokol boyunca farklı yazılım sekmeleri arasında geçiş yapmak için ilgili sekmelere tıklayın. Ekrandaki talimatları izleyin. Başlatma prosedürünün otomatik olarak uygulanması için hem hücre kalite kontrolü hem de otomatik hizalama kutucuklarını seçin.Hücre kontrol sekmesindeki A veya B düğmesine basılarak, gerektiğinde bu adımların her biri ayrı ayrı tekrarlanabilir. Atık çözeltiyi toplamak için çıkış portunun altına bir beher yerleştirin ve sisteme hava kabarcığı enjekte etmeyin. Nanoparçacık izleme analizi veya NTA cihazının giriş ve çıkış portlarını açın ve şırınga yardımıyla giriş portundan hücre kanalına 10 milliliters saf su enjekte edin.Suyun son miktarı enjekte edilirken giriş ve çıkış portlarını hemen kapatın. Ölçüm hücresinin hava kabarcıklarından arındırıldığından emin olun. Tamam'a tıklayarak hücre kalite kontrolünü gerçekleştirin.Yazılım, birkaç saniye sonra hücre kalite sonucunu görüntüleyecektir; yazılımın canlı izleme ekranında hala partiküller görülüyorsa veya kalite kontrol sonucu sadece "iyi" (good) veya "kötü" (poor) ise, kalan partiküller ölçüm hücresi L'den uzaklaştırılana kadar distal su enjeksiyonunu tekrarlayın. Ayrıca, partikül birikimini önlemek için bu adımı her ölçümden sonra tekrarlayın. Ardından, tek tip, 200 nanometre boyutunda polistiren partiküller içeren bir kontrol süspansiyonu hazırlayın. Lazer ve mikroskop odaklarını hizalamak için, canlı izleme ekranında ekran başına 600 ± 100 partikül görüntülenecek şekilde gerekli konsantrasyonu elde etmek amacıyla, cihaz üreticisi tarafından sağlanan süspansiyon konsantresinden bir damlayı 500 mililitre distile suya ekleyin.Hizalama süspansiyonunu, distile su baskısında yapıldığı gibi NTA cihazına enjekte edin. İki odak noktasının optimum konumunu sistemin otomatik olarak bulmasını sağlayan otomatik bir rutin olan hizalamayı da başlatabilirsiniz. Sistemin artık deneyler için hazır olduğunu belirten bir istem göründüğünde, ölçümü başlatmak için tamam'a tıklayın.Deneyler arasında hücre kanalını ara sıra %30'luk etanol çözeltisi ile yıkayarak manuel olarak temizleyin. Yazılım otomatik bir hata raporu görüntülediğinde kanalı temizleyin. Sistemin ölçümünü gerçekleştirmek için.Öncelikle, her örnek ölçümünden önce kanalı distile su ile yıkayın. Ardından, ekzozom süspansiyonunu kanala enjekte edin. Bir sonraki adım, hassasiyeti ayarlamak için yazılımdaki ana parametreleri düzenlemektir.Farklı hassasiyet seviyeleri için ekran başına ölçülen partikül eğrisini görüntülemek amacıyla, partikül sayısı ile hassasiyet grafiğine tıklayarak optimal hassasiyet aralığını bulun. Eğrinin maksimum eğiminden önceki bir hassasiyet seviyesini seçin. Daha yüksek bir hassasiyet seviyesi, daha fazla küçük partikülün görselleştirilmesine olanak tanır, ancak aynı zamanda arka plan gürültüsüyle ilgili sorunları da artırır.Minimum parlaklığı ayarlamak için, ekzosom ölçümü için başlangıç parlaklığını 20 olarak seçin. Bu işlevi bir filtre olarak kullanmak için, güçlü ışık saçan partikülleri yok etmek amacıyla bu parametreyi yükseltin. Deney boyunca gerektiği gibi, zayıf saçılma artefaktlarını belirginleştirmek için parlaklığı düşürün.Ardından, piksel gürültüsünü ve istenmeyen saçılma kaynaklı aşırı büyük partikülleri ortadan kaldırmak için bir dijital filtre ayarlayın. Minimum ve maksimum boyutu düzenleyerek, eksozomların ölçümü için 10 ila 500 piksel arasında bir aralık kullanın. Kameranın açık kaldığı süreyi değiştirerek perdeyi ayarlayın ve perde değerini 3,3 milisaniyeye karşılık gelen 300 olarak belirleyin.Canlı okuma parametrelerini ayarlamak için, canlı görüntü düğmesine tıklayarak herhangi bir noktada dijital ve analog görünüm modları arasında geçiş yapın. Deney boyunca, numunenin doygunluk durumunu renk kodlu bir gösterge olarak sunan saçılma yoğunluğu çubuğunu izleyin.Saçılım çubuğu kırmızıysa eksozomları analiz etmeyin. Ölçüme başlamak için ölçüm sekmesine tıklayın. Çalıştırma seçenekleri dizisinden ayarları seçin.Her veri toplama işlemi öncesinde hareket kontrolünü (check movement), tekrarlı parçacık sürüklenmesi testini (check particle drift) seçin, deney sayısını ve deneyler arasındaki zaman gecikmesini belirleyin. Gerekiyorsa bir örnek kontrolü gerçekleştirin. Son olarak, video veri toplama başlatma (run video acquisition) düğmesine tıklayın.Yeni pencerede, döngü sayısını ve ölçüm pozisyonlarının sayısını tanımlayın. Minimum süre süresini onaylayın. Bir parçacığın tek bir bireysel parçacık olarak sayılması için takip yapılması gerekir.Video çözünürlüğü ayarlandığında, daha düşük çözünürlük daha kısa bir izleme süresiyle sonuçlanır. Son olarak, bir dosya adı seçin ve ölçümü başlatmak için tamam'a tıklayın. Parçacık sayısı ile hassasiyet eğrisi, tek bir andaki tek bir konumdaki parçacıkları görüntüler.Otomatik hassasiyet taraması sırasında, grafik eğrisinin maksimum eğiminden önce bir hassasiyet değeri seçilir. Bu test deneyinde artefaktlar elimine edilmez ve grafiği etkileyebilir. Doğru hassasiyet değerini ayarlamak için canlı izleme ekranındaki partikül görselleştirmesinden faydalanılabilir.Çok düşük bir değer, az sayıda partikül saptanmasına yol açar. Çok yüksek bir değer ise kötü bir görüntüye neden olurken, optimum hassasiyet seviyesinde kaliteli partiküller, birbirlerinden iyi ayrılmış tekil noktalar şeklinde görünür. Ölçüm sonrası sonuç sekmesi; izlenen toplam partikül sayısı, pozisyon başına ortalama partikül sayısı ve partikül konsantrasyonunun yanı sıra, partikül boyutunun partikül sayısı yüzdesine olan sayısal oranını içeren parametrelerin okunmasına olanak tanır.Ölçümden sonra hesaplanan grafik, partiküllerin boyuta göre dağılımını göstermektedir. Görüntüleme modundaki simgeler, grafiğin ayarlarını değiştirmek için kullanılabilir. Ayrıca, eksozomları analiz etmenin farklı yolları mevcuttur.Bu yöntem, kısa sürede sonuçlar üretmek için hızlı bir süreçte benzer bir yöntem analizi gerçekleştirmenin çok basit ve zarif bir yolunu göstermektedir. Birden fazla örneği karşılaştırmak için, tüm örnekler için aynı seyreltme düzeyinin korunmasını öneririz. Hassasiyet hariç tüm ayarlar kabul edilebilir ve video çözünürlüğü daha sonra birkaç analiz yazılımı seti kullanılarak değiştirilebilir.Bu sayede, eksozom miktarı ve boyutu üzerine farklı deneylerde elde edilen verilerin karşılaştırmalı analizi, yarı otomatik bir şekilde gerçekleştirilebilir hale gelir.

an-innovative-method-for-exosome-quantification-and-size-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, küçük hacimli biyoakışkan numunelerdeki belirli eksozomları ölçmek için düşük büyütmeli, karanlık alan mikroskobunun kullanımı açıklanmaktadır. Bu şekilde tanımlanan eksozomlar, potansiyel kanser biyobelirteçleri olarak hizmet edebilir.

Karanlık Alan Mikroskobu Kullanılarak Antikor Konjuge Nanopartikül Tabanlı Miktar Tayini: Vücut Sıvılarından Belirli Eksozomları Yakalama ve Ölçme Prosedürü

Bu videoda, döteryum oksitte hazırlanan %25 (a/a) sükroz yastığı kullanılarak insan embriyonik böbrek hücre kültürlerinden hasat edilen şartlandırılmış ortamdan eksozomları izole etmek için yoğunluğa dayalı bir ultrasantrifüjleme tekniği açıklanmaktadır. İzole edilmiş eksozomlar, aşağı akış uygulamaları için kullanılabilir.

Eksozom İzolasyonu: Kültürlenmiş Hücrelerin Şartlandırılmış Ortamlarından Eksozomları Ayırmak için Sükroz Yastığı Kullanan Yoğunluğa Dayalı Bir Ultrasantrifüjleme Tekniği

Bu el yazması, modifiye edilmiş bir çökeltme tekniği kullanarak eksozomları insan idrarından izole etmek için bir protokolü açıklar.

Bir Modifiye Yağış Yöntemi İdrar eksozomlar yalıtmak için

Hücre dışı veziküller koagülasyon, bağışıklık karşılıklarının ve kanser ilaç uygulaması veya rejeneratif tıpta potansiyel terapötik maddeler dahil olmak üzere, fizyolojik ve patalojik sürece, önemli bir rol oynamaktadır. Bu protokol ayarlanabilir direnç darbe algılama kullanarak çeşitli sıvıların izole ve izole olmayan hücre dışı veziküllerin miktar ve boyut karakterizasyonu için yöntemler sunar.

Sayımı ve Ayarlanabilir Dirençli Darbe Algılama Yöntemi Ekstrasellüler Veziküller boyutu-profil

Eksozomlar, potansiyel olarak önemli hastalık ayırıcı biyobelirteçler taşıyan biyosıvılar içinde bulunan mikroveziküler yapılardır. Burada, eksozomları spesifik olarak çıkarmak ve tekdüze olmayan elektrikli döngüsel kare dalgalar kullanılarak eksozomların parçalanmasını takiben her iki RNA/protein hedefi için ekzozomal yükü hızlı bir şekilde test etmek için yeni bir yöntem kullanılmaktadır.

Elektrik Alan-kaynaklı Release ve Ölçme (EFIRM) tarafından Exosomal Biomarker Algılama

Bu protokol, dolaşımdaki miRNA'ların kontaminasyonunu önlemek ve NSCLC'deki biyobelirteç özelliklerini değerlendirmek için NSCLC hastalarının plazmasında salınan eksozomlarda miRNA profillemesinin Proteinaz K ve RNAse tedavileri ile ticari bir eksozom izolasyon kiti aracılığıyla gerçekleştirilmesinin fizibilitesini açıklar.

qPCR sayesinde küçük hücre dışı akciğer kanseri (KHDAK) Hasta Plazma içinde Exosomal miRNA Analizi: Bir Uygulanabilir Sıvı Biyopsi Aracı

Safra sıvısı, potansiyel olarak önemli biyobelirteçler içeren hücre dışı veziküller/eksozomlar için değerli bir kaynaktır. Bu protokol, miRNA profillemesi de dahil olmak üzere daha ileri analizler için eksozomları insan safrasından izole etmek için sağlam bir yöntemi temsil eder.

İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar

Bir eksozom ilaç teslim taşıyıcıları yeni nesil olduğunu. Bir eksozom yalıtım protokolü ile yüksek verim ve saflık siRNA teslimat için kurduk. Biz de fluorescently etiketli non-spesifik siRNA exosomes kapsüllenir ve siRNA yüklü exosomes kanser hücreleri hücresel alımını araştırıldı.

SiRNA kanser hücrelerinin teslim için Exosomes hazırlanması

Hastalıklı ve malign hücreler için dış türev biomarkerlerin klinik çevirisi, hızlı ve doğru ölçme yöntemlerinin olmaması ile engellenmiştir. Bu raporda, küçük hacimli serum veya plazma örneklerindeki belirli dış alt türleri ölçmek için düşük büyütme koyu alan mikroskop görüntülerinin kullanımı açıklanmaktadır.

Tümör türevi Exosomes ölçmek için Nanoplasmon-gelişmiş saçılma ve düşük büyütme mikroskop görüntüleme kullanma

Fare perigonadal yağ dokusundan ve insan plazmasından izole edilmiş hücre dışı veznelerin boyut dağılımını ve toplam partikül konsantrasyonu tahmin etmek için yeni bir nanopartikül izleme analiz aracının nasıl kullanılacağını gösteriyoruz.

Hücre Dışı Veziklinlerin Nicelleştirilmesi ve Boyut Tayini için Nanopartikül Takip Analizi

Öğrenin, nanopartikül izleme analizi ile insan kanından ekzom izolasyonu ve boyutlandırma yöntemini. Bu yarı otomatik yaklaşım, nörobilim ve biyoloji araştırmalarında yüksek hassasiyetli partikül kantifikasyonu sağlar.

Exosome Kantifikasyon ve Boyut Ölçüm Yenilikçi Yöntem

Daha fazla video keşfet