Düşük frekanslı somatik mutasyonları tespit etmek için vahşi tip bloke edici PCR

Vahşi tip bloke edici polimeraz zincir reaksiyonu veya WTB-PCR, DNA örneklerinde yüksek bolluklu vahşi tip alellerin amplifikasyonunu inhibe ederken, düşük bolluklu mutant alelleri seçici olarak amplifiye ederek nokta mutasyonlarını tespit eder.

WTB-PCR, kilitli nükleik asitler veya LNA içeren tek sarmallı, modifiye oligonükleotid, numunenin tamamlayıcı olarak tamamlayıcı olarak tamamlayıcı olarak bağlanan vahşi tip DNA zincirine tamamlayıcı olarak kullanılır. LNA bağlanması, DNA polimerazın aktivitesini bloke eder ve vahşi tip şablon DNA'nın uzamasını engeller.

WTB-PCR gerçekleştirmek için, nükleaz içermeyen damıtılmış suda dNTP'ler, LNA'lar ve hedefe özgü ileri ve geri primerler içeren bir ana karışım alın.

Tüpe termostabil bir DNA polimeraz içeren çözelti ekleyin ve karışımı bir PCR plakasının kuyucuğuna pipetleyin. Yabani tip ve mutant DNA içeren genomik DNA örneğini kuyuya ekleyin ve PCR'ye başlayın.

PCR sırasında, yüksek sıcaklık aracılı denatürasyon, çift sarmallı DNA'ları ayırır. Ayrılan iplikler, primerlerin tavlanması için şablon görevi görürken, LNA, tamamlayıcı vahşi tip DNA zincirine bağlanır ve engelleyici-vahşi tip DNA hibritini oluşturur. Daha yüksek bir sıcaklıkta, DNA polimeraz dNTP'ler ekler ve primer-DNA şablonlarını genişletir.

LNA-DNA hibritinin DNA-DNA kompleksinden daha yüksek bir erime sıcaklığı, onu sağlam tutar. LNA'nın modifikasyonu sonunda DNA polimerazın LNA-DNA hibritini uzatmasını bloke eder ve bu da uzamasını engeller.

Birkaç PCR döngüsü boyunca, LNA aracılı blokaj, numunedeki vahşi tip varyantına göre mutant tip amplikonların sayısını arttırır ve seçici tespitlerine yardımcı olur.

İleri ve geri astarlar, tamamlayıcı sıralama astarlarının tavlanmasına izin vermek için 5'-M13 dizisi ile tasarlanmıştır. Bloke edici oligonükleotidi yaklaşık 10 ila 15 baz uzunluğunda olacak ve mutant zenginleştirmenin istendiği vahşi tip şablonu tamamlayacak şekilde tasarlayın.

Daha kısa bir oligo, uyumsuzluk ayrımcılığını iyileştirecektir. Yüksek hedef özgüllüğü elde etmek için, çok "yapışkan" bir oligonükleotid ile sonuçlanacağından, çok fazla bloke edici nükleotid kullanmamak önemlidir.

Bloke edici oligonükleotidi tasarlamak için Oligo Tools web sitesine giderek başlayın. "Oligo T_M Tahmini" aracını seçin. Yeni bir pencere açılacaktır. Engellenecek vahşi tip şablonun sırasını "Oligo Sırası" kutusuna yapıştırın. İşaretlemek için engelleyici tabanların önüne bir artı işareti ekleyin. DNA bloker hibritinin_{yaklaşık TM'sini} belirlemek için "Hesapla" düğmesine tıklayın. Hesaplanan erime sıcaklıkları aşağıdaki kutularda görünecektir.

Blokaj oligosunu, termodöngü sırasında uzatma sıcaklığının 10 ila 15 santigrat derece üzerinde bir erime sıcaklığına sahip olacak şekilde tasarlayın. Burada uzatma sıcaklığı 72 santigrat derecedir. Erime sıcaklığını ayarlamak için engelleme tabanları ekleyin, çıkarın veya yerine koyun. Üç ila dört blokaj C veya G tabanının uzun süre gerilmesinden kaçının.

Ardından, ikincil yapı oluşumunu veya kendi kendine dimerizasyonu önlemek için Oligo Tools web sitesi ana ekranına geri dönün ve "Oligo Optimizer" aracını seçin. Yeni bir pencere açılacaktır. Engellenecek vahşi dosya türü şablonun sırasını kutuya yapıştırın. Engelleme tabanlarını belirtmek için bir artı işareti ekleyin. "İkincil Yapı" ve "Yalnızca Öz" için iki kutuyu seçin ve hibridizasyon ve ikincil yapı puanlarını görmek için "Analiz Et" düğmesine basın.

Bu skorlar, sırasıyla kendi kendine dimerlerin ve ikincil yapıların erime sıcaklıklarının çok kaba tahminlerini temsil eder. Daha düşük puanlar optimaldir ve bloker-bloker eşleşmesini sınırlayarak elde edilebilir. Daha düşük puanlar elde etmek için bloke edici nükleotidleri çıkarın veya yeniden konumlandırın. Burada gösterilen MyD88 için optimize edilmiş bloke edici oligonükleotid, DNA bloker hibrit erime sıcaklığı ile yeterince düşük hibridizasyon ve ikincil yapı skorları arasında bir denge kurar.

Q262 ila I266 amino asitlerini kapsayacak şekilde tasarlanmıştır ve hem DNA polimeraz tarafından uzamayı hem de 3'-eksonükleaz ile bozunmayı inhibe etmek için 3' ters çevrilmiş bir dT'ye sahiptir. Primerler tasarlandıktan sonra, vahşi tip bloke edici PCR'yi ayarlayın ve ekteki belgede açıklandığı gibi termodöngü gerçekleştirin.