Viral Genomu Ölçmek için Nokta Blot Testi

Nokta leke tahlilini kullanarak viral DNA'yı ölçmek için, izole edilmiş bir viral DNA süspansiyonu ile başlayın. Çift sarmallı DNA'yı sonraki hibridizasyon için tek sarmallara denatüre etmek için alkali bir çözelti ile muamele edin.

Nokta leke aparatını önceden ıslatılmış bir naylon membran ile monte edin. Denatüre viral DNA ve doğrusallaştırılmış standart plazmid DNA çözeltilerini kuyucuklara yükleyin. Etkili negatif yüklü viral tek sarmallı DNA transferini kolaylaştıran ve elektrostatik etkileşimler yoluyla pozitif yüklü membran yüzeyine bağlanarak nokta desenleri oluşturan uygun bir vakum uygulayın.

Çalıştırmanın ardından, zarı sodyum sitrat tamponu ile yıkayın ve tahlil hassasiyetini artırmaya yardımcı olun. Kurutma sonrası, zarı ultraviyole ışığa maruz bırakın ve lekelenmiş DNA'yı zara çapraz bağlayın.

Membrana hibridizasyon tamponunda ısıyla denatüre edilmiş, heterolog olmayan bir DNA fragmanı ve viral genoma özgü radyoaktif fosfor etiketli DNA prob süspansiyonu ekleyin. İnkübe edin, hibridizasyonun kolaylaştırılması.

DNA fragmanları, kalan zar bölgelerine bağlanarak bloke edici ajanlar olarak işlev görür ve spesifik olmayan prob bağlanmasını en aza indirir. Radyoaktif prob, viral tek sarmallı DNA üzerindeki tamamlayıcı dizi ile melezleşir.

Hibritlenmemiş probları çıkarmak için yıkama tamponu ile yıkayın. Fosfor görüntü tarama sistemini kullanarak, nokta leke sinyalleri elde etmek için zar üzerindeki viral genoma hibritleştirilmiş radyoaktif problar tarafından yayılan radyoaktif sinyalleri ölçün

Standart eğriden, zar üzerindeki her bir noktanın sinyal yoğunluğu, numunedeki viral DNA miktarını hesaplamak için kullanılabilir.

Nokta leke tahlilini gerçekleştirmek için, AAV vektör genom plazmit DNA'sını su veya Tris-HCl tamponu içinde mikrolitre başına 10 nanograma seyrelterek plazmit DNA standartlarını hazırlayın. Seyreltilmiş plazmit DNA'nın 25 mikrolitrelik bir alikotunu taze bir tüpe aktarın ve bir saat boyunca 50 mikrolitrelik bir reaksiyon hacminde uygun bir kısıtlama enzimi ile doğrusallaştırın.

Sindirilmiş plazmid DNA standardını içeren tüpe 450 mikrolitre su veya TE ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra, seyreltilmiş bir plazmit standardı oluşturmak için bu karışımın 70 mikrolitresini 1.330 mikrolitre su veya TE içeren yeni bir 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Nokta leke aparatını kurmak için makas kullanarak, lekeleme zarını numune sayısı ve standartlar için uygun bir boyutta kesin. Nokta leke aparatına yerleştirmeden önce zarı 10 dakika su ile ıslatın. Daha sonra kullanılmayan kuyuların üzerini örtün. Numunelerin yükleneceği kuyulara su ekleyin. Bir vakum uygulayın, suyu kuyulardan çekin, hataları kontrol edin ve ardından vidaları yeniden sıkın. Gerekirse yeniden test edin.

Her bir oyuğa her seyreltilmiş plazmit DNA standardından 400 mikrolitre uygulayın ve dört şerit standart seyreltme çalıştırın. Standart özetin iki ayrı kopyasını kullanın ve her birini kopya olarak yükleyin. Ardından, her viral DNA örneğinin kuyusu başına 200 mikrolitre uygulayın. DNA solüsyonlarını kuyucuklardan geçirmek için hafif bir vakum uygulayın. Ardından, tüm kuyular boşaldıktan sonra, üç vanayı ayarlayarak vakumu serbest bırakın.

Her kuyucuğa 400 mikrolitre 1X alkali çözelti ekleyin. Ardından, kuyuları boşaltmak için tekrar vakum uygulamadan önce beş dakika bekleyin. Vakumu tekrar uygulayın ve nokta leke aparatını sökün. Ardından zarı çıkarın ve 2X SSC ile durulayın.

Fazla tamponu çıkarmak için zarı, DNA'ya bağlı tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir kağıt havlu üzerine yerleştirin. Lekelenmiş DNA'yı zara UV çapraz bağlamak için uygun bir UV çapraz bağlayıcı kullanın. Membran artık hibridizasyon için hazırdır.

Membranı, DNA'ya bağlı tarafı yukarı bakacak şekilde bir hibridizasyon şişesine yerleştirin. Membranı 5 ila 10 mililitre önceden ısıtılmış hibridizasyon tamponu ile durulayın ve tamponu atın. Ardından, 10 mililitre önceden ısıtılmış hibridizasyon tamponu ekleyin ve şişeyi 65 santigrat dereceye ayarlanmış dönen bir hibridizasyon fırınına yerleştirin. Şişeyi en az beş dakika döndürün.

Denatüre sperm DNA'sını ve radyoaktif probu şişedeki hibridizasyon tamponuna hızlı bir şekilde ekleyin ve karıştırmak için 10 saniye çalkalayın. Şişeyi 65 santigrat derece fırına geri koyun ve en az dört saat boyunca 65 santigrat derecede döndürülerek inkübe edin.

Hibridizasyon tamamlandıktan sonra, dönüşü durdurun, hibridizasyon şişesini çıkarın ve ardından radyoaktif prob çözeltisini sızdırmaz tapa conta kapaklı 50 mililitrelik konik bir tüpe dökün. Membranı yıkamak için, hibridizasyon şişesine 20 ila 30 mikrolitre önceden ısıtılmış yıkama tamponu ekleyin ve beş dakika döndürün. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.

Üçüncü yıkamadan sonra, zarı hibridizasyon şişesinden çıkarın ve kağıt havlularla fazla tamponu zardan çıkarın. Ardından, zarı şeffaf plastik bir kağıt tutucuya yerleştirin. Bir Geiger sayacı ile membran üzerindeki radyoaktif sinyalleri kontrol edin.

[TRILLING]

Silinen fosfor görüntüleme ekranını membrana maruz bıraktıktan sonra, bir fosfor görüntü tarama sistemi kullanarak ekranı tarayın ve her noktanın sinyal yoğunluğu ile ilgili verileri elde edin.