Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

Bu prosedürün genel amacı, viral gen ekspresyonunun kimyasal tedaviden etkilendiği aşamaları belirlemektir. Bunu yapmak için, doku kültürü hücreleri kaplanır ve inkübe edilir. Birleşene kadar, hücreler daha sonra ya üçlü raportör aşı virüsü ya da bir kontrol promotör listesi virüsü ile enfekte edilir.

Daha sonraki tedavi bileşikleri uygulanır ve hücreler, viral gen ekspresyonunun tüm aşamalarının tamamlanmasına izin vermek için 18 saat inkübe edilir. Elde edilen floresan daha sonra bir plaka okuyucu kullanılarak belirlenir. Sonuç olarak, deneysel bileşiklerin neden olduğu ifadedeki nispi değişiklikleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, tek bir floresan füzyon proteinini eksprese eden bir virüsle enfeksiyona göre ana avantajı, bu virüs grubunun, spesifik bir terapötik ilacın viral yaşam döngüsünün neresinde etkili olduğu hakkında daha fazla bilgi sağlaması ve etki mekanizması hakkında bilgi sağlamasıdır. Bu yöntem viral enfeksiyon inhibitörlerini tanımlamak için kullanılabilse de, izin verilmeyen hücre hatlarında veya RNAi ekranlarında tamamlanan viral replikasyon aşamasını tespit etmek ve enfeksiyon için gerekli hücresel faktörleri tanımlamak için de kullanılabilir. Bu protokol, tek bir venia virüsünün çift sarmallı genomuna spektral olarak farklı üç floro dörtlüsünün dahil edildiği üçlü virüs veya Trip V çok aşamalı raportör virüsünü kullanır.

Bu floro dörtlülerinin her biri, iyi tanımlanmış bir aşamaya özgü promotör tarafından kontrol edilir. Venüs'ün erken ekspresyonu için C 11 R promotörü, m kirazının ekspresyonu için G eight R ara promotörü ve BFP etiketinin geç aşama ekspresyonu için F 17 R promotörü. Böylece, Venüs m Kiraz ve etiket BFP, enfeksiyon sırasında sırayla ifade edilir.

Kontrol olarak, bir promoter list virüsü kullanılır. PLV, Trip V'dekine benzer bir venöz yapı içerir.Ancak, fonksiyonel bir transkripsiyon promotörüne sahip değildir. Bu protokole ayrışarak başlayın.

10 santimetrelik bir tabakta büyütülen hela hücreleri, büyüme ortamındaki hücreleri mililitre başına yaklaşık 2.0 kez 10 ila beşinci hücreye seyreltir. Daha sonra, siyah duvarlı, açık, düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre dağıtın, hücreleri 24 saat boyunca 37 santigrat derece inkübatörde% 5 karbondioksit ile, virüsleri seyreltmek için birleşene kadar inkübe edin, Tripp V ve PLV'yi 37 santigrat derece su banyosunda çözdün, ardından ayrıştırmak için beş dakika sonikasyon yapın. Daha sonra, hücreleri enfekte etmek için 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış enfeksiyon ortamında virüs stoğunu mililitre başına 1.0 çarpı 10 ila yedinci PFU'ya seyreltin.

Her tedavi için büyüme ortamını 50 mikrolitre seyreltilmiş virüs ile değiştirin. Her tedaviye özgü arka plan floresansını hesaba katmak için üç replike kuyucuğu Tripp V ile ve diğer üçünü PLV ile enfekte edin. Bu, zamanın sıfır saate eşit olması olarak tanımlanır.

Enfeksiyon sonrası, örneğin, her biri 50 mikrolitre olan 6 96 kuyu için 350 mikrolitre yapın. Her bir bileşik, nihai konsantrasyonun iki katına kadar seyreltilmelidir, çünkü zaten kuyucukta bulunan aşı hacmine eklenecektir. Daha sonra, her bir tedavi koşulu için, deneysel bileşikleri veya PBS veya DMSO gibi araç kontrol çözücülerini tüm kopyalar için yeterli enfeksiyon ortamına seyrelterek iki x ana karışımı yapın.

Artı bir, hem deneysel hem de yalnızca vektör kontrollerinizdeki çözücü konsantrasyonunun aynı olması gerektiğini unutmayın. Örneğin, DMSO'da mil başına bir mikrolitre IBT kullanıyorsanız, vektör kontrolünüz olarak mil başına bir mikrolitre olarak tek başına DMSL de kullanmalısınız. Virüsü ekledikten hemen sonra, bu şekilde gösterildiği gibi her birine istenen tedavi ve kontrol bileşiklerini içeren 50 mikrolitre enfeksiyon ortamı ekleyin.

Her bileşiğin Tripp V ve PLV ile üç kopya halinde test edildiğini ve her virüs için üç kopya halinde bir araç kontrolünün çalıştırıldığını unutmayın. 37 santigrat derece inkübatörde 18 saat artı %5 karbondioksit inkübe edin. Ertesi gün, her bir kuyucukta bulunan enfeksiyon ortamına 100 mikrolitre% 8 paraform aldehit ekleyerek hücreleri sabitleyin, plakayı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca ışıktan koruyun.

Enfeksiyon ortamına doğrudan iki x veya% 8 paraform aldehit eklemek, virüsün aerosolizasyonunu önleyecektir, aksi takdirde sabitlenmemiş virüs doğrudan atık kabına ters çevrilirse meydana gelebilir. 15 dakika geçtikten sonra, plakayı atık kabına ters çevirerek sabitleyiciyi çıkarın. Daha sonra 100 mikrolitre oda sıcaklığında PBS ekleyin ve plakayı optik olarak şeffaf yapışkan film ile kapatın.

Plaka hemen okunmayacaksa, dört santigrat derecede saklayın. Yoğuşmanın spektrofotometre ölçümlerini bozmasını önlemek için okumadan önce kapalı plakaları oda sıcaklığına geri getirdiğinizden emin olun. Virüs büyümesini ölçmek için, son nokta floresansını ölçmek için bir spektrofotometre kullanın.

Her kanal için optimize edilmiş kazanç ayarlarını kullanarak kuyu başına dört ölçüm yapın. Bu videoda kullanılan TAN Infinite M 1000 Pro plaka okuyucu, ham floresan ölçümlerini bir Microsoft Excel dosyasına aktarır. Okumalar elde edildikten sonra, ham verileri Microsoft Excel'de açın.

Ardından kopyalayıp bir GraphPad prizmasına yapıştırın. Prizma'daki sonuç sayfası, tekrarlanan Tripp v ve PLV kuyularının ortalamasını belirler. Daha sonra her tedavi için ortalama PLV değerini ortalama Tripp V değerinden çıkarın.

Tekrarlanan deneylerle karşılaştırmayı kolaylaştırmak için, arka planda çıkarılan verileri yalnızca Tripp v Wells aracına bölerek verileri normalleştirin. Bir deney birden çok kez tekrarlandıktan sonra, tedavilerden herhangi birinin DMSO tedavisinden önemli ölçüde farklı olup olmadığını belirlemek için tek yönlü bir varyans analizi veya tek yönlü bir NOVA testi ve çoklu karşılaştırma son testi gerçekleştirin. Kinetik tahliller yapmak için her kanalın hücreleri enfekte etmesi ve daha önce olduğu gibi test bileşiklerini uygulaması için, %5 karbondioksit ilavesi olmadan uygun pH'ı korumak için tamponlu bir ortam kullanmak özellikle önemlidir.

Plakayı yapışkan film ile kapattıktan sonra, 37 santigrat dereceye kadar dengelenmiş plaka okuyucu odasına yerleştirin. Plakaları sürekli olarak 37 santigrat derecede tutmak için özel dikkat gösterilmelidir. Bu, aşırı hücre stresini ve yoğunlaşmayı önleyecektir.

Daha sonraki zaman noktalarının doygunluğunu önlemek için plaka okuyucu kazancını manuel olarak ayarlayın. Enfeksiyonu takiben sekiz ila 24 saat boyunca saatlik okumalar alın ve normalleştirin. Uç nokta tahliline gelince, bireysel zaman noktaları, daha önce açıklanan son nokta tahliline benzer yöntemler kullanılarak istatistiksel anlamlılık açısından analiz edilebilir.

İnhibisyon noktalarını karşılaştırmak için, TPV veya PLV aşısı ile enfekte olmuş topuk hücreleri, çiçek virüsü inhibitörleri, Aris, CIBT, Rifampisin ve ST 2 46'nın varlığında büyütüldü. Bu kez, atlamalı film, DNA replikasyonunu bloke eden ilaç aee'nin varlığında enfekte olduğunda kontrol hücrelerinde virüs büyümesi sırasında yeşil, kırmızı ve mavi floro dörtlüsünün sıralı ekspresyonunu gösterir. Erken yeşil floro dörtlüsü daha önce olduğu gibi üretilir, ancak orta ve geç kırmızı ve mavi floresan üretimi gerçekleşmez.

Spektrometri ile yapılan kantitatif analiz, erken gen ekspresyonunda% 210'luk bir artış gösterdi, ancak IBT varlığında enfekte olmuş bir C hücresi ile tedavi edilen hücrelerde ara ve geç ekspresyon eksikliği gösterdi ve bunun teşvik ettiği düşünülüyor. Transkripsiyon yoluyla okuma, kontrol seviyelerinin %24.7 ve %2.9'u olan orta ve geç ekspresyon seviyelerine sahipti, ST 2 46 ve rifampisin varlığında enfekte olmuş hücreler, virion montajı ve olgunlaşması sırasında geç gen ekspresyonunu inhibe eden kontrollerden önemli ölçüde farklı değildi. Bu sonuçlar, bu bileşiklerin anlaşılan etki mekanizması ile tutarlıdır ve Trip V raportör virüsünün, bilinmeyen bileşikler için viral inhibisyonun spesifik aşamasını tanımlamak için kullanılabileceğini düşündürmektedir.

Bu yordamı denerken, uygun denetimleri dahil etmeyi unutmamak önemlidir. Bu sadece sonuçların uygun şekilde normalleştirilmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda deneysel bileşiğiniz için potansiyel bir mekanizma belirlemeye de izin verir. Vaccinia virüsü ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın, her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman giyin ve önerilen bsl'ye uyun.

İki çevreleme tekniği.