Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

Bu prosedürün genel amacı, viral gen ekspresyonunun kimyasal işlemden etkilendiği aşamaları belirlemektir. Bunun için, doku kültürü hücreleri ekilir ve konfluens olana kadar inkübe edilir. Ardından hücreler, ya üçlü raporlayıcı vaccinia virüsü ya da kontrol amaçlı promotörsüz virüs ile enfekte edilir.

Ardından tedavi bileşikleri uygulanır ve viral gen ekspresyonunun tüm aşamalarının tamamlanması için hücreler 18 saat boyunca inkübe edilir. Oluşan floresans, daha sonra bir plaka okuyucu kullanılarak belirlenir. Sonuç olarak, deneysel bileşiklerin neden olduğu ekspresyondaki bağıl değişiklikleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, tek bir floresan füzyon proteini eksprese eden bir virüsle yapılan enfeksiyona göre temel avantajı, bu virüs setinin belirli bir terapötik ilacın viral yaşam döngüsünün neresinde etkili olduğu hakkında daha fazla bilgi sunarak etki mekanizmasına dair içgörü sağlamasıdır. Bu yöntem, viral enfeksiyon inhibitörlerini tanımlamak için kullanılabileceği gibi, non-permisif hücre hatlarında veya RNAi taramalarında tamamlanan viral replikasyon aşamasını saptayarak enfeksiyon için gerekli hücresel faktörlerin belirlenmesinde de kullanılabilir. Bu protokol, üç spektral olarak farklı floroforun tek bir vaccinia virüsünün çift sarmallı genomuna dahil edildiği triple virüs veya TrpV çok aşamalı raporlayıcı virüsü kullanmaktadır.

Bu floroforların her biri, iyi tanımlanmış evreye özgü bir promotör tarafından kontrol edilir. Venus'ün erken ekspresyonu için C 11 R promotörü, m-cherry ekspresyonu için G eight R ara promotörü ve tag BFP'nin geç evre ekspresyonu için F 17 R promotörü kullanılır. Böylece Venus, m-Cherry ve tag BFP, enfeksiyon sırasında sırasıyla eksprese edilir.

Kontrol olarak, promoter içermeyen bir virüs kullanılır. PLV, TrpV'deki ile benzer bir Venus yapısı içerir, ancak fonksiyonel bir transkripsiyon promoterine sahip değildir.

Bu protokole, 10 santimetrelik bir kapta büyütülmüş Hela hücrelerini disosiye ederek başlayın. Hücreleri büyüme ortamında yaklaşık 2,0 x 10⁵ hücre/mL olacak şekilde seyreltin. Ardından, siyah duvarlı, şeffaf düz tabanlı 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 µL dağıtın. Hücreleri, konfluens olana kadar %5 CO2 içeren 37 °C'lik bir inkübatörde 24 saat inkübe edin. Virüsleri seyreltmek için TrpV ve PLV'yi 37 °C'lik bir su banyosunda çözdürün, ardından agregatları dağıtmak için beş dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Son olarak, virüs stokunu, 37 °C'ye önceden ısıtılmış enfeksiyon ortamında 1,0 x 10⁷ PFU/mL olacak şekilde seyreltin.

Hücreleri enfekte etmek için, her kuyucuktaki büyüme ortamını 50 µL seyreltilmiş virüs ile değiştirin. Her bir işlem için, her işleme özgü arka plan floresansını hesaba katmak amacıyla üç replika kuyucuğu TrpV ile ve diğer üç kuyucuğu PLV ile enfekte edin. Bu an, enfeksiyon sonrası sıfır saat olarak tanımlanır. Örneğin, her birinde 50 µL olacak şekilde 6 adet 96'lık kuyucuk için 350 µL hazırlayın. Herhangi bir bileşik, kuyucuktaki inokülüm hacmine ekleneceği için nihai konsantrasyonun iki katı olacak şekilde seyreltilmelidir. Ardından, her bir işlem koşulu için, deneysel bileşikleri veya PBS veya DMSO gibi taşıyıcı kontrol çözücülerini, tüm replikalardan bir fazla olacak kadar enfeksiyon ortamına seyrelterek 2x'lik bir master mix hazırlayın. Deneysel gruplarınızdaki ve yalnızca vektör içeren kontrollerinizdeki çözücü konsantrasyonunun aynı olması gerektiğini unutmayın. Örneğin, DMSO içinde 1 µL/mL konsantrasyonda IBT kullanıyorsanız, vektör kontrolü olarak DMSO'yu da tek başına 1 µL/mL konsantrasyonda kullanmalısınız. Virüsü ekledikten hemen sonra, bu görselde gösterildiği gibi, her bir kuyucuğa istenen işlem ve kontrol bileşiklerini içeren 50 µL enfeksiyon ortamı ekleyin.

Her bir bileşiğin TrpV ve PLV ile üç tekrarlı olarak test edildiğini ve her bir virüs için üç tekrarlı bir taşıyıcı kontrolün yürütüldüğünü unutmayın.

37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde 18 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, her bir kuyucukta halihazırda bulunan enfeksiyon ortamına 100 µL %8 paraformaldehit ekleyerek hücreleri tespit edin. Plakayı ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.

Enfeksiyon ortamına doğrudan iki x veya %8 paraformaldehit eklemek, tespit edilmemiş virüsün doğrudan atık kabına boşaltılması durumunda meydana gelebilecek virüs aerosolizasyonunu önleyecektir. 15 dakika geçtikten sonra, plakayı atık kabına ters çevirerek fiksatif maddeyi uzaklaştırın. Ardından 100 µL oda sıcaklığında PBS ekleyin ve plakayı optik olarak şeffaf yapışkan filmle mühürleyin.

Plaka hemen okunmayacaksa, dört derece Celsius'ta saklayın. Spektrofotometre ölçümlerinin yoğunlaşma nedeniyle bozulmasını önlemek için, sızdırmaz plakaları okumadan önce oda sıcaklığına getirdiğinizden emin olun.

Virüs büyümesini nicelleştirmek için, uç nokta floresanını ölçmek üzere bir spektrofotometre kullanın. Her kanal için optimize edilmiş kazanç ayarlarını kullanarak kuyu başına dört ölçüm alın. Bu videoda kullanılan TECAN Infinite M 1000 Pro plak okuyucu, ham floresan ölçümlerini bir Microsoft Excel dosyasına aktarır. Okumalar alındıktan sonra, ham verileri Microsoft Excel'de açın.

Ardından bunu kopyalayıp bir GraphPad Prism sonuç sayfasına yapıştırın. Prism'de tekrarlı TrpV ve PLV kuyucuklarının ortalamasını belirleyin. Daha sonra, her bir işlem için ortalama PLV değerini ortalama TrpV değerinden çıkarın. Tekrarlı deneylerle karşılaştırmayı kolaylaştırmak için, arka planı çıkarılmış verileri yalnızca araç içeren TrpV kuyucuklarına bölerek verileri normalize edin. Bir deney birden çok kez tekrarlandıktan sonra, her kanal için işlemlerden herhangi birinin DMSO işleminden anlamlı düzeyde farklı olup olmadığını belirlemek için tek yönlü varyans analizi veya tek yönlü ANOVA testi ve çoklu karşılaştırma sonrası testi gerçekleştirin. Kinetik analizler yapmak için hücreleri enfekte edin ve test bileşiklerini daha önce olduğu gibi uygulayın; %5 karbon dioksit ilavesi olmadan uygun pH'ı korumak için tamponlanmış bir ortam kullanmak özellikle önemlidir.

Plaka yapışkanlı film ile kapatıldıktan sonra, 37 °C'ye dengelenmiş plaka okuyucu haznesine yerleştirin. Plakaların sürekli olarak 37 °C'de tutulmasına özel dikkat gösterilmelidir. Bu işlem, gereksiz hücre stresini ve kondansasyonu önleyecektir.

Sonraki zaman noktalarında doygunluğu önlemek için plak okuyucu kazancını manuel olarak ayarlayın. Enfeksiyonu takiben sekiz ila 24 saat boyunca saatlik okumalar alın ve uç nokta analiziyle aynı şekilde normalize edin. Münferit zaman noktaları, daha önce açıklanan uç nokta analiziyle benzer yöntemler kullanılarak istatistiksel anlamlılık açısından analiz edilebilir.

İnhibisyon noktalarını karşılaştırmak için, TrpV veya PLV vaccinia ile enfekte edilmiş HeLa hücreleri; pox virüsü inhibitörleri olan AraC, IBT, Rifampisin ve ST 246 varlığında büyütüldü. Bu hızlandırılmış video, kontrol hücrelerindeki virüs büyümesi sırasında yeşil, kırmızı ve mavi floroforların ardışık ekspresyonunu göstermektedir. DNA replikasyonunu bloke eden ilaç AraC varlığında enfekte edildiklerinde, erken dönem yeşil florofor daha önce olduğu gibi üretilir, ancak kırmızı ve mavi floresansın ara ve geç dönem üretimi gerçekleşmez.

Spektrometri ile yapılan kantitatif analiz, araC ile işlem görmüş hücrelerde erken gen ekspresyonunda %210 artış olduğunu, ancak orta ve geç ekspresyonun eksik olduğunu göstermiştir. Okuma aşamasındaki transkripsiyonu (read-through transcription) desteklediği düşünülen IBT varlığında enfekte edilen hücrelerin orta ve geç ekspresyon seviyeleri, kontrol seviyelerinin sırasıyla %24,7 ve %2,9'u düzeyindeydi. Virion montajı ve olgunlaşması sırasında geç gen ekspresyonu sonrasını inhibe eden ST246 ve rifampisin varlığında enfekte edilen hücreler, kontrollerden anlamlı düzeyde farklılık göstermemiştir. Bu sonuçlar, söz konusu bileşiklerin bilinen etki mekanizmalarıyla uyumludur ve TrpV raporlayıcı virüsün, bilinmeyen bileşikler için viral inhibisyonun spesifik aşamasını belirlemek amacıyla kullanılabileceğini göstermektedir.

Bu prosedür uygulanırken, uygun kontrollerin eklenmesinin önemli olduğu unutulmamalıdır. Bu durum sadece sonuçların doğru şekilde normalleştirilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda deneysel bileşiğiniz için potansiyel bir mekanizmanın belirlenmesine de olanak tanır. Vaccinia virüsü ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın ve önerilen BSL-iki koruma tekniklerine uyun.