Name: Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Rekombinant DNA ve Protein Kompleksleri Görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Keşfedin, atomik kuvvet mikroskobu ile tamponlu ortamda plazmid DNA ve protein komplekslerini gerçek zamanlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, biyomoleküllerin boyut, miktar ve organizasyonunu analiz ederek moleküler şaperon araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Ulusal Sağlık Hibe GM086822 Enstitüleri tarafından finanse edildi. Yazarların Dr teşekkür etmek istiyorum. Alec Pakhomov &amp; Paul Wallace (Washington Nanoteknoloji Kullanıcı Tesisi Üniv (NTUF)) ve uzman teknik yardım için Andrea Slade (Bruker AXS). DNA AFM görüntüleme Üniversitesi yapıldı. Washington NTUF, Ulusal Nanoteknoloji Altyapı Ağı üyesi. 2xGal4 2xGRE-luciferease plazmid lütfen Dr. Keith Yamamoto (California Üniv, San Francisco) laboratuvar tarafından sağlanmıştır.

1. Yabancı maddelerden arındırılmış yansıması DNA ve protein örneklerinin hazırlanması <ol><li> Görüntülü ve yer olarak uygun bir sulu tampon biyomoleküllerin izole edin. Görüntülenecek Proteinler kullanarak saflaştırılmış sıvı kromatografi 6 olabilir, immunoadsorption antikor ve pelet 1,2 kaldırılması, ya da Profinity tam bir arınma ve etiketini çıkarma 7 (Şekil 2A) izledi . Miniprep arıtma (Şekil 2B) tarafından görüntülendi DNA molekülleri izole edin. </li><li> SDS-PAGE ve western blot kullanarak görüntülü protein örneklerinin bileşimi ve saflığı onaylayın. DNA dizisi ve saflık bir kısıtlama sindirmek ve agaroz jel elektroforezi tamamlayarak onaylayın. </li><li> Mika için numune bağlılığı teşvik etmek için bir AFM adsorpsiyon tampon örnekler inkübe edin. Protein örnekleri için, 10 mM HEPES tamponu kullanılıyor olabilir. Ek düşük iyonik kuvvet tuzları veya diğer kofaktör de eklenebilir. DNA örnekleri, kalsiyum katyon (örneğin Mg 2 + veya Ni 2 +) mika yüzeye adsorbsiyon teşvik etmek. DNA için uygun Mg 2 + içeren tampon 10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 3. Alternatif bir Ni 2 + tampon, 10 mM Hepes, pH 6.8, 10 mM NiCl 2 . </li><li> Adsorpsiyon tampon 5 mg / ml 'lik bir konsantrasyon için örnek seyreltilir. Hafifçe karıştırın. Mikroskop hazırlanan edilirken buz üzerinde saklayın. </li></ol> 2. Montaj AFM prob <ol><li> Sıvı hücre prob tutucu ilgili konsol yükleme yerleştirme istasyonu üzerine yerleştirin. </li><li> Görüntüleme için kullanılan keskin nitrür kolunu (SNL) prob uzun, kalın konsol ('B' konsol olarak anılacaktır) bulun. Dikkatle ucu dik kalmasını sağlayarak, sıvı hücre prob tutucu transfer. Teknik not: prob transit ise Extreme bakımı, herhangi bir yükseklikte bırakarak olarak ödenmelidir konsol veya ucu zarar veya zarar verebilir. Microlever SNL (MSNL) prob SNL prob alternatif olarak kullanılıyor olabilir. </li><li> Yerleştirme istasyonu prob tutucu çıkarın ve konsol sağlam ve düzgün bir şekilde sıvı hücre prob tutucu oturduğundan emin olmak için bir ışık mikroskop altında incelenmesi. </li><li> Dikkatle tırtıllı kafa vidalı kelepçe sıkma aleti dovetail montaj AFM baş kaldırmak. Teknik not: AFM baş işlenirken çok titizlikle, hatta kısa bir mesafe (kurtağzı montaj doğru şekilde oturduğundan değilse örneğin) bırakarak, ödenmesi gereken önemli hasara neden olabilir. </li><li> AFM başını ters çevirin ve dört iğne üzerine sıvı hücre prob tutucu AFM kafa tabanına sıkıca itin. AFM kafası alet dovetail montaj içine dikkatlice dönün. Cihazın içine AFM baş tutturmak için tırtıllı kafa vidalı kelepçe bırakın. </li></ol> 3. Konsol ucu Konumlandırılması lazer hizalama ve fotodetektör ayarlayarak <ol><li> AFM enstrüman yazılımı kullanarak, onboard ışık mikroskobu kollarını hareket ettirerek konsol ucu bulun. Gerekirse uç kimlik geliştirmek için mikroskop aydınlatma ayarlayın. Cihaz yazılımı görüntülenen crosshair'i yakın içine konsol ucu sonuna getirin. </li><li> Konsol ucu yazılım optik kontrol yukarı ve aşağı okları ayarlayarak odak noktası haline getirin. Optik ayarlama, yavaş (S) veya orta (M) hız kullanın. </li><li> Lazer, lazer ayarlama düğmeleri kullanarak konsol ucu aynı hizaya getirin. Kırmızı lazer nokta, beyaz aydınlatma spot içinde ayar düğmeleri kadar hareket ettirin. Lazer konsol ucu üzerine getirilinceye kadar zig-zag desen kullanarak konsol kol boyunca iz. Düzgün hizalanmış, güçlü bir yansıması nokta AFM başın ön penceresinde görünecektir. </li><li> Merkezi AFM kafasına fotodetektör düğmeleri ayarlayarak fotodetektör. Bu cihaz yazılım fotodetektör ekran crosshair'i lazer nokta uyumlu hale getirecektir. Gözlenen sinyal toplamı yaklaşık 4-6 olmalıdır. </li></ol> 4. Konumlandırma AFM baş ve ayar konsol <ol><li> AFM tutucu plakası tepesinde manyetize numune tutucu bir metal AFM örnek diske bağlı mika taze bölünmüş bir yaprak yerleştirin. Bu kurulum öncesinde görüntüleme Adım 1 hazırlanan DNA veya protein örnek AFM kafa pozisyonu kullanılacaktır. <ol><li> Teknik not: manyetize olan numune tutucu ve sıvı hücre prob tutucu, mekanizmalar ve prob sahipleri tespit diğer örnek daha kalındır. Mika-numune tutucu montaj ve AFM kafa arasında yeterli boşluk varsa, cihaz yazılımı birkaç kez çekilme simgesini seçerek AFM başını yukarı hareket ettirin. </li></ol></li><li> Örnek disk ilk görüntüleme için konumlandırılmış böylece AFM tutucu plakası döndürün. Mika substrat AFM başlık altında merkezli olduğundan emin olun. </li><li> Doğru AFM baş aşağı hareket ettirincihaz yazılım odak yüzey kontrolü kullanarak mika örnek disk yüzeyi. Z motor orta (M) hızını seçin ve yüzeye doğru devam AFM baş mika üzerinde yaklaşık 2 mm kadar. Şu anda, prob ve yüzey (ucu çökmesini olarak anılacaktır) arasında ani temastan kaçınmak için yavaş (S) Z motor hızı kullanarak geçin. </li><li> Mika yüzey veya ucu yansıması farklı özellikler Odak kadar prob mika substrat yüzeyine yakın taşımak için devam edin. Cihazın yazılımı simgesi: yüzey ve "odak noktası" kullanarak ucu yansıması odak düzlemleri arasında geçiş. </li><li> Cihazın yazılımı ayar simgesini seçin ve konsol ayarlamak. Önerilir SNL ve MSNL konsol probları rezonans frekansı 20-60 kHz. Ofset% 5 tepe seçin. Teknik not: Yeterli konsol ayarı yeterli örnek görüntüleme için çok önemlidir. </li></ol> 5. Görüntüleme mika örnek yüzey <ol><li> Mika yüzeye prob meşgul. İlk tarama boyutu 10 mm ve 1 Hz tarama hızı ayarlayın. İntegral kazanç ve oransal kazanç başlangıçta sırasıyla 0.2 ve 0.4 olarak ayarlanmış olabilir. Iz var ve tekrarlanırken taramaları kabaca örtüştüğü için gerektiği gibi kazanımlar ayarlayın. Genlik set azaltılması, sonda ve mika arasındaki etkileşimi artırmak ve katılımı sağlamak. </li><li> 10 mikron alanında tam bir tarama görüntüler yakalayın. 1, büyüklükleri 5 ila tarama, ve 0.5 mikron ve her bir alanın tam görüntü yakalamak azaltın. Gerekli kazanç ve tarama hızı ayarlayın. Mika yüzey görüntülerini yakalama, DNA ve protein içeren örnekler için karşılaştırma için bir temel sağlar. </li><li> Cihazın yazılımı boşa simgesine tek bir tıklama ile prob ayırın. </li></ol> 6. Görüntüleme biyomoleküllerin <ol><li> Adım 1 hazırlanan DNA veya protein örnek hafifçe karıştırın ve görüntülü mika yüzeye yüklemek için hazırlamak. Taze adsorpsiyon tampon 45 ul (son örnek konsantrasyon = 0.5 mg / ml) ile hazırlanan örnek 5 ul karıştırın. </li><li> Mika yüzeye direkt olarak 0.5 mikrogram / ml biyomolekülün içeren bir çözüm dikkatlice 50 ul ekleyin. Bu prob veya AFM kafa hareket ettirmeden yapın ve örnek çözümü sağlamak (ancak pipetlemeyin ucu) prob ile temas yapar. </li><li> Pause 5 dakika örnek biyomoleküllerin mika yüzey uymak için izin vermek. </li><li> 5 dakika, pipetlemeyin sıvı hücre prob tutucu içine adsorpsiyon tampon ek 50-100 ul bitiminde prob AFM başkanı veya pipetlemeyin ucu ile mika dokunmayın dikkatli olmak. Bu formu ve bir menisküs AFM sıvı dokunarak modu görüntüleme için izin. Şekil 3 sıvı hücre, konsol, örnek, numune tutucu ve menisküs son düzenleme gösterir. </li><li> Fotodetektör yeniden ayarlayınız ve gerekli olarak konsol için lazer yeniden hizalayın. Teknik not: prob ucu ve lazer hizalama incelemekte prob tutucu örnek tampon ekleyerek kaynaklanan kırınım nedeniyle karmaşıktır. Elle gerekirse, konsol retune. </li><li> Cihazın yazılımını kullanarak prob yeniden meşgul. Dikey saptırma, integral kazanç ve gerektiğinde oransal kazanç ayarlayın. Bu mika bölümü hemen önce örnek ve yakalama görüntüleri ekleyerek taranan yeniden görüntüleme süreci başlayacaktır. </li><li> Ilgi alanları tanımlamak için (500 nm-10 mikron) tarama boyutu artırın. Zoom-in ve görüntü çözünürlüğü artırmak için 0.5 Hz tarama hızı azaltmak </li><li> Görüntüleme tamamlandıktan sonra, cihaz yazılımı simgesini çekilme birkaç kez seçilmesi prob boşa. AFM demontaj sıvı hücre veya numune disk önce baş ve örnek disk arasında yeterli mesafe olun. </li><li> Iyice artık adsorpsiyon tampon buharlaşır olarak oluşan tuz kristalleri önlemek için, saf su ile sıvı hücre prob tutucu ve örnek disk durulayın. Basınçlı hava ile kurutun. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: AFM görüntüleri örnek olarak Şekil 4'te sunulmaktadır . Mika substrat (A) DNA ve protein adsorbe hangi üzerine moleküler düz bir yüzey sağlar. Görüntüleme mika önce biyomolekülün örnekleri görüntüleme gürültü bir negatif kontrol ve değerlendirme sağlar. Ayrıca konsol düzgün bir şekilde ayarlanmıştır ve sonraki örnek görüntüleme başarılı olacağına güvence düzeyi sağlar. Çift iplikli plazmid DNA (B, D), varsayımsal olarak supercoiled, asimetrik görünüm ve üniforma önceden normaldi mika substrat üzerine yatırılması ile kolayca tanımlanır. Sağduyulu parçacık boyutları (C, E) Protein kompleksleri de mika substrat benzersiz ayırt edilebilir. Partikül büyüklüğü farklılıkları örnek heterojenite gösterir ve protein kompleksi stokiyometri veya biyokimyasal aktivite yaklaştırmak için yararlı olabilir. Yanlısı genel çapraz şekli ve tutarlı bir yönelimPanel C görülen protein parçacıkları, proteinler expectedly mika substrat üzerinde rastgele bir moda odaklı olduğu gibi bir görüntüleme eserdir. Gözlenen artifakı Olası nedenleri fiziksel bir ucu anormalliği ya da çok hızlı bir tarama hızı AFM görüntüleme. Ucu konvolüsyon (Şekil 1B gösterilen) mutlak uzunluk ölçü hesaplamaları engellerken, x ve y eksenleri, yükseklik ölçümü (z ekseni) ve bağıl x ve y değerleri görüntülü biyomoleküllerin biyofiziksel özellikleri tahmin etmek için yine de faydalı olabilir. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: modu atomik kuvvet mikroskobu (AFM) vurma şematik sunumu. A, mikroskop. Konsol, sonunda mika substratın yüzey üzerinde tarar gibi dolaşacaktır ve aşağı keskin bir ucu biyomoleküler kompleksleri emilir. Tarayıcı x ve y doğrultularında hareket ettikçe, bir lazer ışını, üzerine oturtulmuş biyomoleküler kompleksleri üzerinden geçerken ucu hareket dikey (z) mesafe harita bir pozisyon duyarlı fotodiyot dedektörü üzerine konsol arka yansır mika. B. ucu konvolüsyon neden x ve y yönlerinde görüntü Distorsiyon. Geleneksel silisyum nitrür ucu nominal yarıçapı Görüntülenecek parçacıklar daha büyük, ve ucu temas örnek kenarından yüzeye erişir. İpucu konvolüsyon görüntülü x ve y yönünde daha büyük görünmesini zerrelerden değil z yönünde sonuçlanır. Bu etki, küçük bir nominal uç yarıçaplı ipuçları kullanımı minimize edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: İllüstrasyon immunoadsorbed protein ve DNA numune hazırlama. Immunoadsorbed GR A, Yayın monoklonal antikor (mAb) protein A-sepharose (PAS) pelet • hsp70 protein kompleksi. MAb epitopu içeren bir peptid ile immunopellet kuluçka karmaşık supernatant ve AFM tarafından görüntülenmiştir alınacak izin, pelet GR • hsp70 protein kompleksi serbest kolaylaştıracaktır. B, AFM görüntüleme için DNA hazırlanması, kalsiyum katyon adsorpsiyon tampon kullanımını gerektirir. Kalsiyum katyonu mika substrat için DNA yakınlığı artar. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3: AFM baş, sıvı hücre prob tutucu, örnek, numune tutucu ve tampon menisküs Final düzenleme. A, Bakım, mika yüzey üzerine pipetlemeyin ucu ve AFM baş, sıvı arama, ve mika yüzeyler arasındaki fiziksel temas önlemek için örnek ve ek tampon yatırma alınmalıdır. B, A. tampon menisküs sıvı hücre prob tutucu örnek diskten yayılan Büyütme. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4: mika substrat Atomik kuvvet mikrograflar (A) tampon çözeltisi 2xGal4-2xGRE luciferease plazmid DNA 8 (B, D) ve GR • hsp70 protein kompleksleri (C, E). Mika, DNA ve protein görselleştirme ile karşılaştırmak için bir kontrol görüntü olarak hizmet vermektedir. GR • hsp70 protein kompleksleri ile astarlanmalıdır mAb rakip antikor (Şekil 2A gösterilen) ile antikor-boncuk pelet serbest hsp70 ve GR immunoadsorption tarafından hazırlanmıştır. DNA geleneksel plazmid miniprep tarafından hazırlanmıştır. Paneller A, B, ve C eşdeğer bir büyütme (ölçek bar = 200 nm), Paneller D ve E (ölçek bar = 40 nm).

<ol><li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor%C2%95hsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptorhsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J Biol Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li>
<li>Harrell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+glucocorticoid+receptor+transport+on+microtubules+by+dynein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence for glucocorticoid receptor transport on microtubules by dynein.</a> J Biol Chem. 279, 54647-54654 (2004).</li>
<li>Pastre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+DNA+to+mica+mediated+by+divalent+counterions%3A+a+theoretical+and+experimental+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Adsorption of DNA to mica mediated by divalent counterions: a theoretical and experimental study.</a> Biophys J. 85, 2507-2518 (2003).</li>
<li>Guthold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+one-dimensional+diffusion+and+transcription+by+Escherichia+coli+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Direct observation of one-dimensional diffusion and transcription by Escherichia coli RNA polymerase.</a> Biophys J. 77, 2284-2294 (1999).</li>
<li>Petrucco, S., Volpi, G., Bolchi, A., Rivetti, C., Ottonello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nick-sensing+DNA+3%27-repair+enzyme+from+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A nick-sensing DNA 3'-repair enzyme from Arabidopsis.</a> J Biol Chem. 277, 23675-23683 (2002).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation%2Fdeacetylation+of+the+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J Biol Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li>
<li>Ruan, B., Fisher, K. E., Alexander, P. A., Doroshko, V., Bryan, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+subtilisin+into+a+fluoride-triggered+processing+protease+useful+for+one-step+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Engineering subtilisin into a fluoride-triggered processing protease useful for one-step protein purification.</a> Biochemistry. 43, 14539-14546 (2004).</li>
<li>Meijsing, S. H., Elbi, C., Luecke, H. F., Hager, G. L., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ligand+binding+domain+controls+glucocorticoid+receptor+dynamics+independent+of+ligand+release%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The ligand binding domain controls glucocorticoid receptor dynamics independent of ligand release.</a> Mol Cell Biol. 27, 2442-2451 (2007).</li>
<li>Shen, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+effective+sample+preparation+method+for+atomic+force+microscopy+visualization+of+individual+DNA+molecules+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">A simple and effective sample preparation method for atomic force microscopy visualization of individual DNA molecules in situ.</a> Mol Biol Rep. 38, 965-969 (2010).</li>
<li>Paulite, M., Fakhraai, Z., Akhremitchev, B. B., Mueller, K., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly%2C+tuning+and+use+of+an+apertureless+near+field+infrared+microscope+for+protein+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assembly, tuning and use of an apertureless near field infrared microscope for protein imaging.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+effects+of+matrix+stiffness+on+cellular+function+using+acrylamide-based+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Brunger, A. T., Weninger, K., Bowen, M., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+the+neuronal+SNARE+fusion+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of the neuronal SNARE fusion machinery.</a> Annu Rev Biochem. 78, 903-928 (2009).</li>
</ol>

AFM, sulu ve yakın-fizyolojik tamponlu çözümleri gerçek zamanlı olarak görüntüleme bireysel kaplanmamış biyomoleküllerin yapabilen eşsiz bir mikroskopik tekniğe sağlar. Bu görünüm için bireysel proteinler ve DNA molekülleri, yanı sıra multiprotein kompleksleri ve protein-DNA kompleksleri izin verir. AFM ile Görüntüleme makromoleküler parçacıklar değerlendirmek için örnek homojenlik ve gözlenen parçacıkları oluşturan bileşenlerin fiziksel olarak düzenleme tanımlamak için yararlı olabilir. Bu yaklaşım, bireysel makromoleküler parçacıkları gözlemleyerek immunoprecipitation deneyleri, poliakrilamid jel elektroforezi ve faiz 10 3 -10 11 ayrı biyomoleküler kompleksleri temsil eden önemli bir özetleyici veri sağlayan boyutu dışlanma kolon kromatografisi, gibi geleneksel biyokimyasal teknikleri, faydalı bir yardımcı olabilir bir örnek. Multiprotein karmaşık stokiyometri, biyomoleküler etkileşimleri ve kofaktör gereksinimleri üzerinde yapılan araştırmalar, tüm AFM kullanılarak incelenmiştir olabilir. Burada sunulan yöntem, özel ilgi biyofiziksel soruları karşılamak için adapte edilebilir. Örneğin, tampon değişimi yapabilen bir sıvı hücre prob tutucu kullanarak, kofaktör gereksinimleri protein kompleksi oluşumu için tahlil etmek mümkün olabilir. Hatta yakın gerçek zamanlı ve görüntülü sırasında DNA-protein meclisleri kuruldu ve ayrışmış olabilir. Hipotez bağlayıcı protein ile karıştırılarak özel ilgi dizileri (olası bir yanıt elemanları veya yeni protein bağlayıcı dizisi gibi), DNA ve moleküller arası etkileşimlerin doğrudan kanıt görüntülü olabilir. Kuru örnekleri numune sulu çözeltiler ve lineer DNA standları ve kapalı daire DNA plazmid bu şekilde 3,9 imaged her ikisi de yerine kullanılmaktadır Vurma modunda AFM görüntüleme önemli ölçüde daha az karmaşık. Burada sunulan yöntem, daha fizyolojik bir görüntüleme ortamı sağlamak amacıyla tamponlu çözümler örnekleri kullanır. Diğer göze çarpan görüntüleme proteinlerin yöntemleri alanında kızılötesi mikroskopi 10 yakınlarındaki de dahil olmak üzere, göz önüne alınmalıdır. AFM ile sanatçılı immunoadsorption tamamlayıcı kullanımı köklü biyokimyasal teknikler kullanarak, sayısız protein kompleksleri hazırlamak için bir fırsat sağlar ve daha sonra tahliye immunoadsorbing antikor-boncuk pelet onları görselleştirmek. Örneğin, karmaşık bir boyut ve stoichiometries tahmin etmek için bu yaklaşım kullanarak immunoadsorbed GR 2 hsp70 moleküler şaperon protein 1 dynein motor proteinin yanı sıra, dernek için test edilmiştir . Partikül büyüklüğü ve biyofizik özellikleri (örneğin, katılık) AFM görüntülü örnekleri 11,12 gözlenen biyomoleküllerin kimlik ascertaining yararlı olmuştur. Bu hedef biyomolekülün varsa, hedef ve neden bir tanecik boyutunu artırmak bağlamak istiyorsunuz etkileşim biyomolekülün (örneğin bir ligand veya monoklonal antikor), ek biyomolekülün kimliğini onaylamak için de mümkündür.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Boyut 3100 </td><td> Bruker </td><td> Boyut 3100 </td></tr><tr><td> Boyut Akışkan Hücresi </td><td> Bruker </td><td> DTFML-DD-HE </td></tr><tr><td> Keskin nitrür kolunu (SNL) silisyum nitrür AFM prob </td><td> Bruker </td><td> SNL-10 </td></tr><tr><td> Microlever keskin nitrür kolu (MSNL) silisyum nitrür AFM prob </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td></tr><tr><td> NanoScope AFM enstrüman yazılımı </td><td> Bruker </td><td> 004-132-000 </td></tr><tr><td> Metal AFM örnek diskler </td><td> Ted Pella </td><td> 16208 </td></tr><tr><td> Sınıf V1 Mika diskler, 12 mm </td><td> Ted Pella </td><td> 50-12 </td></tr></tbody></table>

atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak rekombinant dna ve protein kompleksleri görselleştirme

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), bireysel protein, DNA molekülleri, protein-protein kompleksleri, ve DNA-protein kompleksleri görselleştirmek için sağlar. Nanometreden mikrometre arasında değişen traversler görüntü alanlarında, herhangi bir noktada substrat yüzeyinde dinlenme makromoleküllerin yükseklik ölçme nano ölçekli bir prob, mikroskop konsol ucunda. Elektrostatik kuvvetler gevşek rastgele yönlerde yüzeye tutunur ve görüntüleme izni, proteinler, lipidler, ve nükleik asitlerin neden olur. Oluşturulan veriler, makromoleküllerin üç boyutlu parçacıklar ayrık boyutları (Şekil 1) 1,2 olarak çözmek bir topografik harita, benzerler . Vurma modunda AFM, DNA ve proteinler gibi nispeten yumuşak biyomalzemeler görüntüleme izin konsol tekrarlanan bir salınım içerir. AFM diğer nano ölçekli mikroskopi teknikleri üzerinde kayda değer faydalar bireysel yakın fizyolojik tamponlu koşulları dahil olmak üzere gerçek-zamanlı olarak, boyama veya kaplama yansıması için örnek olmadan sulu tamponlar, proteinler ve makromoleküler kompleksleri görselleştirmek için göreceli bir adaptasyon. Burada sunulan DNA ve çözüm tamponlu bir immunoadsorbed transkripsiyon faktörü (yani glukokortikoid reseptör, GR) (Şekil 2) görüntüleme yöntemi açıklamaktadır. Immunoadsorbed proteinler ve protein kompleksleri antikor epitop ve sonra görüntülü (Şekil 2A) ile rekabet immunoadsorbing antikor-boncuk pelet ayrılabilir. Bu görüntüleme için önce ilgi biyomoleküllerin biyokimyasal manipülasyon için izin verir. Bir kere, saflaştırılmış DNA ve proteinler karışık olabilir ve ortaya çıkan etkileşim kompleksi de görüntülü olabilir. Mika DNA bağlayıcı Ni 2 gibi 3, kalsiyum katyon gerektirir + veya Mg 2 +, protein aktivitesi korumak henüz örnek tamponlar eklenebilir. Benzer bir yaklaşım kullanarak AFM, bireysel DNA ipliklerini bağlı RNA polimeraz 4 ve onarım enzimi 5, de dahil olmak üzere bireysel enzimler, görselleştirmek için kullanılmıştır. Bu deneyler, protein-protein ve DNA-protein biyofiziksel etkileşimlerin moleküler düzeyde yer alan önemli bir içgörü sağlar. AFM Görüntüleme bireysel makromoleküler parçacıklar, parçacık homojenlik belirlemek için ve görüntülü parçacıkları oluşturan bileşenlerin fiziksel olarak düzenleme belirlemek için yararlı olabilir. Bu yöntem GR bağlayabilirsiniz GR-hastabakıcı protein kompleksleri 1,2 ve DNA ipliklerini görünüm için geliştirilen iken, çeşitli kaynaklardan görüntüleme DNA ve protein örneklerinin geniş uygulanan olabilir.

Plazmid DNA, sitoplazmik proteinleri ve DNA-protein kompleksleri görselleştirme dokunarak modu için bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem, biyokimyasal manipülasyon AFM görüntüleme örnekleri hazırlamak için alternatif yaklaşımlar içerir. Spesifik protein etkileşim bölgeleri içeren DNA yakın fizyolojik tampon koşulları görülmektedir.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Rekombinant DNA ve Protein Kompleksleri Görselleştirme

Atom kuvvet mikroskobu (AFM); tekil proteinlerin, DNA moleküllerinin, protein-protein komplekslerinin ve DNA-protein komplekslerinin görüntülenmesine olanak tanır. ...

Bu prosedürün genel amacı, atomik kuvvet mikroskobu kullanarak sulu tamponlar içindeki DNA ve proteinler gibi biyomoleküllerin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesidir. Bu işlem, öncelikle görüntülenecek biyomoleküllerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, atomik kuvvet mikroskobu kurulur ve bir FM konsol probu konumlandırılır.Ardından, numune yüzeyi ve ilgilenilen biyomoleküller görüntülenir ve analiz edilir. Nihayetinde, atom kuvvet mikroskobisi aracılığıyla tamponlanmış koşullarda DNA ve proteinlerin yanı sıra heterojen biyomoleküler komplekslerin genel boyutunu, miktarını ve organizasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, moleküler şaperon alanındaki, şaperonlar ve ko-şaperon kompleksinin bir istemciye göre STO geometrisinin ne olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu yöntemin görsel demonstrasyonu faydalıdır, çünkü AFM ve Kent kol probu hazırlama adımları, büyük ölçüde fiziksel manipülasyonla ilgili karmaşıklıklar nedeniyle yazılı talimatlardan öğrenilmesi zor olabilir. Prosedürü laboratuvarımdan iki öğrenci olan Morgan Shannon ve John Gertz gösterecektir. Başlangıç olarak, görüntülenecek protein veya DNA moleküllerini izole edin ve bunları sulu bir tampon çözelti içinde süspande edin. Numunenin saflığını onayladıktan sonra, numunenin mikaya yapışmasını kolaylaştırmak için onu buz üzerinde bir AFM adsorpsiyon tamponunda inkübe edin.Protein numuneleri için 10 milimolar HEPES tamponu kullanın. DNA için ise, AFM probunu monte etmek amacıyla 10 milimolar tris (pH 7,5), 10 milimolar sodyum klorür ve iki milimolar magnezyum klorürden oluşan magnezyum içeren bir tampon uygundur. Sıvı hücre prob tutucusunu karşılık gelen kantilever kurulum yerleştirme istasyonuna yerleştirin.Görüntüleme için kullanılacak olan keskin nitrür kaldıraç probunun uzun ve kalın konsolunu belirleyin. Ucun dik kaldığından emin olarak, probu dikkatlice sıvı hücre prob tutucusuna aktarın. Ardından, konsolun sağlam olduğunu ve sıvı hücre prob tutucusuna düzgünce yerleştiğini doğrulamak için ışık mikroskobu altında inceleyin.Ardından, nöral baş sıkıştırma vidasını sıkarak a FM başlığını cihazın kuyruk tertibatından dikkatlice çıkarın. a FM başlığını ters çevirin ve sıvı hücre prob tutucusunu a FM başlığının tabanındaki dört pine sıkıca itin. Son olarak, a FM başlığını cihazın kuyruk tertibatına dikkatlice geri yerleştirin.Numuneleri görüntülemeden önce FM'yi daha fazla hazırlamak için, kantilever ucunu bulmak amacıyla yerleşik ışık mikroskobunun düğmelerini hareket ettirin; kantilever ucunu odak noktasına getirmek için yazılımdaki optik kontrolcünün yukarı ve aşağı oklarını ayarlayın. Lazeri kantilever ucuna hizalamak için lazer ayar düğmelerini kullanın. Bu, protokoldeki teknik açıdan en zorlayıcı adımlardan biridir. Konumlandırma manuel olarak yapılır ve hassas düğme ayarı gerektirir.Yansıma noktasındaki ve aydınlatma noktasındaki lazerin dikkatle izlenmesi, başarılı hizalama olasılığını artırır. Ardından, foto detektörü merkezlemek için AFM başlığındaki foto detektör düğmelerini ayarlayın. Metal bir AFM numune diskine tutturulmuş, yeni koparılmış bir MICA tabakasını AFM tutucu plakanın üzerindeki mıknatıslı numune tutucuya yerleştirin.Örnek diski ilk görüntüleme için konumlandırılacak şekilde a FM tutucu plakayı döndürün. a FM kafasını MICA örnek diskinin yüzeyine doğru aşağı hareket ettirmek için cihaz yazılımının odak yüzey kontrolünü kullanın. MICA yüzeyindeki belirgin özellikler veya uç yansıması odaklanana kadar, cihaz yazılımından tune simgesini seçin ve kantileveri optimize edin.Önerilen MSNL veya SNL problarının rezonans frekansı 20 ila 60 kilohertz arasındadır. MICA örneğini görüntülemek için %5 pik offset seçin. İlk olarak, probu MICA yüzeyine yerleştirin, başlangıç tarama boyutunu 10 micrometers ve tarama hızını bir hertz olarak ayarlayın.10 mikrometrelik alanın tam tarama görüntülerini yakalayın. Ardından tarama boyutunu 5 ve 0,5 mikrometreye düşürerek her bir alanın tam görüntülerini yakalayın. Cihaz yazılımındaki ayırma simgesine bir kez tıklayarak probu ayırın.İlgilenilen biyomoleküllerin görüntülenmesi için, hazırlanan numunenin beş µL'sini 45 µL taze absorbsiyon tamponu ile karıştırın. 0,5 µg/mL biyomolekül içeren çözeltiden 50 µL'yi dikkatlice doğrudan MICU yüzeyine ekleyin. Numunedeki biyomoleküllerin Micah yüzeyine yapışması için beş dakika bekleyin.Ardından, sıvı hücre prob tutucusuna 50 ila 100 µL ek absorbsiyon tamponu pipetleyin. Pipet ucuyla proba, FM kafasına veya MICA'ya dokunmamaya dikkat ederek, gerekirse foto detektörü yeniden ayarlayın ve lazeri kantileverle tekrar hizalayın. Daha sonra, probu yeniden devreye almak için cihaz yazılımını kullanın.İlgi bölgelerini belirlemek için tarama boyutunu artırın. Görüntüleme tamamlandığında, probu ayırmak için cihaz yazılımındaki geri çekme simgesini birkaç kez seçin. Son olarak, sıvı hücre prob tutucusunu ve numune diskinile tamamen durulamak için distile su kullanın.Ardından basınçlı hava ile deneyiniz. Burada bir AFM görüntüsü örneği gösterilmektedir. Mika alt katman, DNA ve proteinlerin absorbe olabileceği moleküler düzeyde düz bir yüzey sağlar.Biyomolekül numunelerinden önce MICA'nın görüntülenmesi, negatif bir kontrol ve görüntüleme gürültüsünün değerlendirilmesini sağlar. Ayrıca, konsolun (cantilever) düzgün şekilde ayarlandığına ve sonraki numune görüntülemesinin başarılı olacağına dair bir güvence sunar. Muhtemelen süper kıvrımlı olan çift sarmallı plazma DNA'sı, asimetrik görünümü ve daha önce dikkat çekici özellikler taşımayan Micah substratı üzerindeki düzenli birikimi ile kolayca tanımlanır.Belirli partikül boyutlarındaki protein kompleksleri, Micah substratından da benzersiz bir şekilde ayırt edilebilmektedir. Partikül boyutu farklılıkları numune heterojenliğini gösterir ve protein, kompleks stokiyometrik geometrisi veya biyokimyasal aktivitesinin yaklaşık olarak belirlenmesinde faydalı olabilir. Protein partiküllerinde genel olarak diyagonal şekil ve tutarlı yönelim gözlemlenmiştir.Proteinlerin Micah substratı üzerinde beklendiği gibi rastgele bir şekilde yönlendirilmiş olmasından kaynaklanan bir görüntüleme artefaktı buradadır. Gözlemlenen artefaktın olası nedenleri; fiziksel bir uç anormalliği veya uc konvolüsyonunun x ve Y eksenindeki yükseklik ölçümü veya Z ekseni ile göreceli X ve Y ölçümlerinde mutlak uzunluk hesaplamalarını engellediği, çok hızlı bir tarama hızında gerçekleştirilen bir FM görüntüleme olabilir; buna rağmen bu ölçümler, görüntülenen biyomoleküllerin biyofiziksel özelliklerini tahmin etmek için yararlı olabilir. Bu prosedürü denerken, bu temel a FM prosedürünü takiben kantileverin doğru şekilde ayarlanması ve foto dedektörün hizalanmasının hatırlanması önemlidir.Moleküler şaperonların, steroid reseptörlerinin DNA yanıt elementlerinden salınımı üzerindeki etkileri gibi ek soruları yanıtlamak için tampon değişim sıvı hücresi kullanımı dahil olmak üzere diğer adımlar eklenebilir. Bu videoyu izledikten sonra, tamponlu koşullar altında atomik kuvvet mikroskopi kullanarak DNA proteinlerinin ve biyomoleküler komplekslerin nasıl görüntüleneceği konusunda daha iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

visualization-recombinant-dna-protein-complexes-using-atomic-force

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Burada izlenir ve sayısal, fonksiyonel moleküler kompleksler tespit sağlamak için canlı bakteri hücreleri tek-molekül floresan mikroskopi gerçekleştirmek için protokolleri göstermektedir.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Protein örneklerinin negatif leke elektron mikroskobu (EM) tarafından görselleştirme popüler bir yapısal analiz yöntemi haline gelmiştir. Ayrıca protein preparatları kalitesi kalitatif olarak incelenmesi için çalışılan moleküllerin 3 boyutlu rekonstrüksiyon hesaplanırken gibi, nicel yapısal analizi için yararlı olur ve. Biz bu makalede, EM ızgaraları hazırlanması, numune boyama ve örnek bir elektron mikroskobu görselleştirmek için ayrıntılı protokoller mevcut. Acemi kullanıcılar, kolayca bu...

Negatif Leke EM, Proteinler ve makromoleküler kompleksler görselleştirme: Izgara Hazırlık Image Acquisition

Kaynak: Bratton, B. P. ve ark., Doğru hücresel temsiller ve hassas protein lokalizasyonu için bakteriyel hücrelerin üç boyutlu görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, tek hücre düzeyinde protein organizasyonunu incelemek için bakteriyel hücrelerin üç boyutlu floresan görüntülerini edinme ve analiz etme yöntemini göstermektedir.

Floresans görüntüleme ile bakteriyel protein dağılımının üç boyutlu görselleştirilmesi

Bu videoda, tek moleküllü görüntüleme kullanarak belirli lokuslarda DNA molekülleri üzerinde füzyon proteini yoğunlaşmalarının montajını görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kondensatlar, RNA polimeraz II'nin işe alınmasına ve gelişmiş gen transkripsiyonuna izin veren LCD-LCD ve LCD-DBD etkileşimleri nedeniyle oluşur.

DNA perdeleri üzerinde füzyon proteini kondensatlarının montajını görselleştirmek için tek moleküllü görüntüleme

Tek molekül izleme ile kombine Fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) verir canlı Escherichia coli hücrelerinde protein-DNA etkileşimleri doğrudan gözlem ve ölçümü.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak bir protein fotoreseptörünün yapısını araştırmak için bir yöntem bu yazıda açıklanmıştır. PeakForce Kantitatif Nanomekanik Özellik Haritalama (PF-QNM), mika yüzeyindeki bozulmamış protein dimerlerini ortaya çıkarır.

PeakForce Kantitatif Nanomekanik Gayrimenkul Eşleme Kullanma Kırmızı Işık fotoreseptör Atomik Kuvvet Mikroskobu

Polietilen glikol (PEG) ve avidin kaplı cam yüzeye bağlanmış ve mikroakışkan kesme akışlarıyla gerilmiş floresan protein DNA bağlayıcı peptit (FP-DBP) ile boyanmış büyük DNA moleküllerini görselleştirmek için bir yaklaşım sunuyoruz.

Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

Biz ayrıntılı yordamlar ve mekanik özellikleri ve mekanik unfolding yollar tek protein moleküllerinin bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanarak ölçmek için stratejileri açıklar. Ayrıca seçim ve bloklama iyi tek protein molekülü kayıtları için bir başvuru olarak temsilcisi sonuçları göster.

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Optik bir tuzakta yerinde tutulan doğrusal DNA molekülleri üzerindeki floresan etiketli, tamamen yeniden yapılandırılmış Cdc45 / Mcm2-7 / GINS (CMG) helikazının hareketini doğrudan görüntülemek ve ölçmek için hibrit bir topluluk ve tek moleküllü bir test sunuyoruz.

Tamamen Yeniden Yapılandırılmış CMG'nin Hareketini Görüntülemek için Hibrit Topluluk ve Tek Moleküllü Test

Keşfedin, atomik kuvvet mikroskobu ile tamponlu ortamda plazmid DNA ve protein komplekslerini gerçek zamanlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, biyomoleküllerin boyut, miktar ve organizasyonunu analiz ederek moleküler şaperon araştırmalarına katkı sağlar.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Rekombinant DNA ve Protein Kompleksleri Görselleştirme

Daha fazla video keşfet