Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Rekombinant DNA ve Protein Kompleksleri Görselleştirme
18 Temmuz 2011
Plazmid DNA, sitoplazmik proteinleri ve DNA-protein kompleksleri görselleştirme dokunarak modu için bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem, biyokimyasal manipülasyon AFM görüntüleme örnekleri hazırlamak için alternatif yaklaşımlar içerir. Spesifik protein etkileşim bölgeleri içeren DNA yakın fizyolojik tampon koşulları görülmektedir.
Bu prosedürün genel amacı, atomik kuvvet mikroskobu kullanarak sulu tamponlarda DNA ve proteinler gibi biyomolekülleri gerçek zamanlı olarak görüntülemektir. Bu, önce görüntülenecek biyomoleküllerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, atomik kuvvet mikroskobu kurulur ve bir FM konsol probu konumlandırılır.
İlgilenilen numune yüzeyi ve biyomoleküller daha sonra görüntülenir ve analiz edilir. Sonuç olarak, atomik kuvvet mikroskobu ile tamponlu koşullarda DNA ve proteinlerin ve heterojen biyomoleküler komplekslerin genel boyutunu, miktarını ve organizasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, şaperonların STO geometrisi ve bir müşteri için cos şaperon kompleksi gibi moleküler şaperon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.
Protein: Bu yöntemin görsel gösterimi faydalıdır, çünkü A FM ve Kent kollu prob hazırlama adımlarının, büyük ölçüde fiziksel manipülasyonlarıyla ilişkili karmaşıklıklar nedeniyle basılı talimatlardan öğrenilmesi zor olabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan iki öğrenci olan Morgan Shannon ve John Gertz olacak Görüntülenecek protein veya DNA moleküllerini izole etmeye başlamak ve bunları sulu bir tamponda askıya almak. Numunenin saflığını onayladıktan sonra, numunenin mika'ya yapışmasını sağlamak için buz üzerinde bir FM absorpsiyon tamponunda inkübe edin.
Protein örnekleri için 10 milimolar yığın tamponu kullanın. Ve 10 milimolar tris, pH 7.5 10 milimolar sodyum klorürden oluşan DNAA magnezyum içeren tampon için, iki milimolar magnezyum klorür A FM probunu monte etmek için uygundur. Sıvı hücre prob tutucusunu ilgili konsol kurulum yerleştirme istasyonuna yerleştirin.
Görüntüleme için kullanılacak keskin nitrür manivela probunun uzun kalın konsolunu bulun. Ucun dik durduğundan emin olarak sıvı hücre prob tutucusuna dikkatlice aktarın. Ardından, sağlam olduğundan ve sıvı hücre prob tutucusuna düzgün şekilde oturduğundan emin olmak için konsolu ışık mikroskobu altında inceleyin.
Ardından, nöral kafa cl'yi sıkarak bir FM kafasını alet kırlangıç kuyruğu tertibatından dikkatlice çıkarın.amp vida. A FM kafasını ters çevirin ve sıvı hücre probu tutucusunu a FM kafasının tabanındaki dört pime sıkıca itin. Son olarak, bir FM kafasını dikkatlice kuyruk tertibatı aletine geri koyun.
Numuneleri görüntülemeden önce bir FM'yi daha fazla hazırlamak için, konsol ucunu bulmak için yerleşik ışık mikroskobunun düğmelerini hareket ettirin, konsol ucunu odaklamak için yazılım üzerindeki optik denetleyicinin yukarı ve aşağı oklarını ayarlayın. Lazeri konsol ucuna hizalamak için lazer ayar düğmelerini kullanın. Bu, protokoldeki teknik olarak en zorlu adımlardan biridir: Konumlandırma manuel olarak yapılır ve hassas düğme ayarı gerektirir.
Lazerin yansıma noktasında ve aydınlatma noktasında dikkatli bir şekilde izlenmesi, başarılı hizalama olasılığını artırır. Ardından, fotoğraf dedektörünü ortalamak için bir FM kafasındaki fotoğraf dedektörü düğmelerini ayarlayın. Metal bir FM numune diskine iliştirilmiş yeni parçalanmış bir MICA® tabakasını, A FM tutucu plakasının üzerindeki manyetize numune tutucuya yerleştirin.
Numune diski ilk görüntüleme için konumlandırılacak şekilde bir FM tutucu plakasını döndürün. Bir FM kafasını MICA® numune diskinin yüzeyine doğru aşağı hareket ettirmek için cihaz yazılımının odak yüzeyi kontrolünü kullanın. MICA® yüzeyindeki belirgin özellikler veya uç yansıması netlenene kadar, enstrüman yazılımından akort simgesini seçin ve konsolu akort edin.
Önerilen MSNL veya SNL problarının rezonans frekansı 20 ila 60 kilohertz'dir. MICA® örneğini görüntülemek için %5'lik bir tepe uzaklığı seçin. İlk olarak, probu MICA® yüzeyine yerleştirin, ilk tarama boyutunu 10 mikrometreye ve tarama hızını bir hertz'e ayarlayın.
10 mikrometre alanının tam tarama görüntülerini yakalayın. Ardından tarama boyutunu beşe, bir ve 0,5 mikrometreye düşürün ve her alanın tam görüntülerini yakalayın. Cihaz yazılımındaki devre dışı bırakma simgesine bir kez tıklayarak probu devre dışı bırakın.
İlgilenilen biyomolekülleri görüntülemek için, hazırlanan numunenin beş mikrolitresini 45 mikrolitre taze absorpsiyon tamponu ile karıştırın. Çözelti içeren çözeltiyi mililitre başına 0.5 mikrogramın 50 mikrolitresini doğrudan MICU'nun yüzeyine dikkatlice ekleyin. Numunedeki biyomoleküllerin Micah yüzeyine yapışmasını sağlamak için beş dakika bekleyin.
Ardından, sıvı hücre probu tutucusuna 50 ila 100 mikrolitre daha absorpsiyon tamponu pipetleyin. Pipet ucuyla proba, FM kafasına veya MICA'ya dokunmamaya dikkat ederek fotoğraf dedektörünü yeniden ayarlayın ve lazeri gerektiği gibi konsola yeniden hizalayın. Ardından, probu yeniden devreye sokmak için cihaz yazılımını kullanın.
İlgilenilen bölgeleri belirlemek için tarama boyutunu artırın. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, probu devre dışı bırakmak için cihaz yazılımındaki çekme simgesini birkaç kez seçin. Son olarak, sıvı hücre prob tutucusunu ve numune diskini iyice durulamak için damıtılmış su kullanın.
Ardından basınçlı hava ile deneyin. Burada bir A FM görüntüsü örneği gösterilmektedir. Mika substratı, DNA ve proteinin emebileceği moleküler olarak düz bir yüzey sağlar.
Biyomolekül örneklerinden önce MICA'nın görüntülenmesi, negatif bir kontrol ve görüntüleme gürültüsünün değerlendirilmesini sağlar. Ayrıca, konsolun uygun şekilde ayarlandığına ve sonraki numune görüntülemenin başarılı olacağına dair bir güvence düzeyi sağlar. Varsayımsal olarak süper sarmal çift sarmallı plazma DNA'sı, asimetrik görünümü ve daha önce dikkat çekmeyen Micah substratı üzerinde düzgün birikinti ile kolayca tanımlanır.
Ayrık parçacık boyutlarına sahip protein kompleksleri de Micah substratından benzersiz bir şekilde ayırt edilebilir. Partikül boyutu farklılıkları, numune heterojenliğini gösterir ve protein, karmaşık stoik geometri veya biyokimyasal aktiviteye yaklaşmak için yararlı olabilir. Gözlemlenen protein parçacıklarının genel diyagonal şekli ve tutarlı oryantasyonu.
Burada, proteinlerin Micah substratına rastgele bir şekilde yönlendirilmesi beklendiği için bir görüntüleme artefaktı var. Gözlenen artefaktın olası nedenleri veya fiziksel bir uç anormalliği veya bir tarama hızının iki hızında bir FM görüntüleme, uç evrişimi mutlak uzunluk ölçümünü önlerken, x ve Y ekseni yükseklik ölçümünde veya Z ekseninde ve bağıl X ve Y ölçümlerinde mutlak uzunluk ölçümü hesaplamaları, görüntülenen biyomoleküllerin biyofiziksel özelliklerini tahmin etmek için yine de yararlı olabilir. Bu prosedürü denerken, konsolu doğru bir şekilde ayarlamayı ve fotoğraf dedektörünü hizalamayı unutmamak önemlidir Bu temel bir FM prosedürünü takiben.
Moleküler şaperonların DNA yanıt elemanlarından steroid reseptörlerinin salınımını etkileme yeteneği gibi ek soruları yanıtlamak için bir tampon değişim sıvısı hücresinin kullanılması da dahil olmak üzere başka adımlar eklenebilir. Bu videoyu izledikten sonra, tamponlu koşullarda atomik kuvvet mikroskobu kullanarak DNA proteinlerinin ve biyomoleküler komplekslerin nasıl görüntüleneceğini daha iyi anlamış olmalısınız.
Genel Bakış
Bu makale, plazmit DNA ve proteinler gibi biyomolekülleri neredeyse fizyolojik tampon koşullarında görselleştirmek için bir tapping modu atomik kuvvet mikroskobu (AFM) yöntemini açıklar. Yöntem, görüntüleme kalitesini ve doğruluğunu artıran numune hazırlama tekniklerini içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyofizik
- Biyokimya
Arka Plan
- Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), biyomolekülleri görüntülemek için güçlü bir araçtır.
- DNA ve proteinler arasındaki etkileşimleri anlamak moleküler biyolojide çok önemlidir.
- Başarılı AFM görüntüleme için numune hazırlaması esastır.
- Tamponlu koşullarda gerçek zamanlı görüntüleme, biyomoleküler yapılar hakkında bilgiler sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- AFM kullanarak sulu tamponlarda DNA ve proteinlerin görüntüleme yöntemi geliştirmek.
- DNA-protein komplekslerini ve bunların organizasyonunu görselleştirmek.
- Moleküler şelafe etkileşimlerinin anlaşılmasını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Biyomoleküllerin uygun tamponlarda hazırlanması.
- AFM cihazının kurulumu ve kalibrasyonu.
- Örneklerin mika yüzeyinde görüntüleme.
- Biyomoleküler boyut, miktar ve organizasyonun analizi.
Ana Sonuçlar
- Çift sarmallı plazmit DNA ve protein komplekslerinin başarılı görüntüleme.
- Parçacık boyutu farklılıkları yoluyla numune heterojenliğinin belirlenmesi.
- Mika yüzeyinde DNA ve protein organizasyonunun görselleştirilmesi.
- Gerçek zamanlı görüntülemede yöntemin etkinliğinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- AFM yöntemi, biyomoleküler etkileşimlere değerli bilgiler sağlar.
- Numune hazırlaması, yüksek kaliteli görüntüleme sonuçları için kritiktir.
- Bu teknik, moleküler şelafe çalışmalarında araştırmayı ilerletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Atomic force microscopy (AFM) enables direct visualization of recombinant DNA, proteins, and their complexes in near-physiologic buffer conditions, supporting early-stage mechanistic de-risking and target validation. This capability provides biopharma R&D teams with high-resolution, label-free structural insights critical for understanding biomolecular interactions and complex assembly. Integrating AFM imaging into discovery workflows enhances predictive confidence and informs portfolio triage decisions at key inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Direct visualization of DNA-protein and protein-protein complexes clarifies molecular assembly and interaction specificity.
- AFM imaging supports functional target validation by revealing complex stoichiometry and heterogeneity.
- Structural mapping of biomolecular complexes reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Label-free imaging in buffered conditions preserves native conformations for accurate hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- AFM provides quantitative topographical data to assess sample homogeneity and complex formation.
- Imaging outputs enable standardization of biomolecule preparations for downstream assays.
- Real-time visualization supports reproducibility and assay readiness for screening campaigns.
- Platform adaptability allows reuse across diverse protein and nucleic acid targets.
Translational & Preclinical Research
- AFM imaging informs preclinical model selection by characterizing disease-relevant biomolecular assemblies.
- Structural insights support translational biomarker alignment when complex formation is linked to functional outcomes.
- Quantitative measurements guide risk-adjusted advancement decisions in preclinical pipelines.
- Mechanistic de-risking is enabled by direct observation of molecular interactions under physiologic conditions.
Pipeline & Workflow Integration
AFM imaging fits within the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, providing a reusable analytical capability for structural interrogation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven mapping of protein-DNA and protein-protein interactions at the single-molecule level.
- Screening: Supplies quantitative, reproducible imaging outputs to benchmark assay performance and sample quality.
- Analytics: Delivers topographical and dimensional data for comparative analysis of biomolecular complexes.
- Translational Research: Supports continuity by linking structural features to functional and disease-relevant endpoints.
- Enterprise Reuse: Adaptable to a wide range of biomolecules, supporting multiple programs and targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation by clarifying complex assembly.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, cantilever tuning, and sample preparation.
- Demands access to high-resolution AFM instrumentation and analytical software.
- Cross-team standardization is essential for reproducible imaging and data interpretation.
- Buffer composition and substrate selection must be optimized for each biomolecule type.
- Tip convolution and scan rate limitations may affect absolute dimensional measurements.
