Aseptik Laboratuvar Teknikleri: Kaplama Yöntemleri

[Anlatıcı] Bu protokol, bakteri ve faj gibi mikroorganizmaları izole etmek, çoğaltmak veya numaralandırmak için kullanılan kaplama yöntemlerinde aseptik tekniği içerir. Prosedürler, tek kolonileri izole etmek için çizgi kaplama bakteri kültürlerini içerir. Bakteri konsantrasyonunu belirlemek için kaplama dökün. Ve canlı bakteri kolonilerini numaralandırmak için kaplamayı yayın. Yumuşak agar kaplamaları, fajı izole etmek ve plakları numaralandırmak için kullanılırken, replika kaplama hücreleri aynı uzamsal modelde bir plakadan diğerine aktarır. Sonuç olarak, bu tekniklerin mikroorganizmaları kültürlemek için pratik uygulamaları, ortamlardaki bakterilerin tanımlanmasından moleküler genetiğindeki teknolojik gelişmelere ve yüksek verimli biyo-tahlillere kadar uzanmaktadır.

- Genel olarak, bu kaplama yöntemlerine yeni olan kişiler, manipülasyonların steril olmayan yüzeylerle temastan kaçınan dikkatli ve koordineli hareketler gerektirmesi nedeniyle mücadele edebilir. Bu rutin prosedürleri öğrenmek, eğitim ve pratik gerektirir. Prosedürleri göstermek için laboratuvar koordinatörüm Dr. Kris Reddi olacak.

- [Anlatıcı] Biyolojik tehlike sınıflandırması, atık dekontaminasyonu ve bertarafı dahil olmak üzere laboratuvar kurallarını ve güvenlik önlemlerini öğrenerek mikroorganizmalarla çalışmaya başlayın. Kaplama prosedürleri için tüm aletlerin, çözeltilerin ve ortamların steril olduğunu onaylayın. Ayrıca net bir çalışma alanı oluşturun. Dezenfektan ile temizleyin. Bir gaz hattına bağlı bir tüp ile bir Bunsen brülörü kurun, gerekli malzemeleri uygun şekilde etiketlenmiş malzemelerle düzenleyin. Ellerinizi antiseptik sabun ve ılık suyla iyice yıkamaya devam edin. Önce ellerinizi ılık, akan suyla ıslatın, ardından sabun uygulayın ve iyice dağıtın. Başparmaklar, parmak sırtları, ellerin arkası ve tırnakların altı dahil olmak üzere tüm yüzeylerde sürtünme oluşturarak ellerinizi kuvvetlice ovalayın. Daha sonra kalan sabunu çıkarmak için iyice durulayın ve bir tutucudan dağıtılan kağıt havlu kullanarak kurulayın. Son olarak, yeni bir kağıt havluyla musluğu kapatın. Çizgi Plakası Prosedürü, saf bakteri veya koloni kültürlerini basit mekanik ayırma yoluyla karışık popülasyonlardan izole etmek için tasarlanmıştır. Dört santigrat derece soğuk kutudan bir agar plakasını çıkarın ve oda sıcaklığına önceden ısıtın. Plakayı çizmek için aletler dizisinden bir alet seçin. Kapakta yoğuşma olmadan plakanın kuru olduğundan emin olun. Bir agar plakasının altını kenarın etrafına etiketleyin. Yeterli olduğunda, birden fazla numune için tek bir plaka kullanın. Ardından metal halkayı alevlendirmek için bir Bunsen brülörü yakın. Bunsen brülör alevinin en sıcak kısmı olan mavi koninin ucundaki tel ile metal halkadan üç ila dört inç başlayın. Metal kırmızı ısındığında, teli alev ilmeğe yaklaşacak şekilde hareket ettirin. Döngüyü soğutmak için, cızırtılı bir ses çıkaran agar ortamının kenarına dokunun. Döngüdeki aşıyı almaya devam edin. Plakanın alt yarısını kaldırın. Halkayı, plakanın ilk çeyreğinde janttan merkeze doğru ileri geri hareket ettirin. Ters çevrilmiş plakayı tekrar kapağa yerleştirin. Metal halkayı yeniden alevlendirin. Petri kabını 90 derece çevirin. İleri geri deseni kullanarak son çizginin sonuna yakın döngüye dokunun, ilk çeyrekte çizgilerin son yarısını çaprazlayın, ardından boş ikinci çeyreğe geçin. İkinci kadran dolduktan sonra plakayı yere koyun. Birinci kadran ile temastan kaçınırken üçüncü ve dördüncü kadranlar için çizgi prosedürünü tekrarlayın. Steril, düz bir kürdan ile çizgi oluşturmak için, dar ucu başparmak ve yüzük parmağı arasında ortama 10 ila 20 derecelik bir açıyla nazikçe tutun, kadranları çizmek için geniş ucu kullanın. Plakayı kadranlar arasındaki kapağa geri ters çevirin ve kürdanı uygun şekilde atın. Çizgili plakaları baş aşağı inkübe etmeye devam edin. Dökme Plakası Prosedürü, tek bir plakanın yüzeyindeki ve agar içindeki koloni oluşturan birimlerin toplam sayısını numaralandırır. 10 dakikalık bir zamanlayıcı ayarlayın, ardından 18 mililitre erimiş agar ortamını 55 santigrat derece su banyosundan 48 santigrat derece ısı bloğuna aktarın ve 10 dakika dengeleyin. Steril bir petri kabının altını etiketleyin. Varsa, seyreltme faktörünü dahil edin. Şimdi petri kabının ortasına bir mililitre numune dağıtın. Kapağı kapatın. Erimiş agar tüpünün kapağını çıkarın ve açık tüpün kenarını bir alevden geçirin. Agarı dikkatlice petri kabına dökün. Kapağı kapatın ve ardından plakayı hafifçe döndürerek numuneyi agar ile karıştırın. Agarın katılaşması için 30 dakika bekleyin. Agar katılaştıktan sonra, plakayı ters çevirin ve ılık bir odaya yerleştirin. Yayılmış kaplama, küçük bir numune hacmi içinde bulunan mikroorganizmaları ayırmayı ve elde edilen kolonileri agar yüzeyine eşit olarak dağıtmayı amaçlar. Bir tabağı oda sıcaklığına dengeleyin ve uygun şekilde etiketleyin. Plakayı döner tablanın üzerine yerleştirin. Agarın ortasına 0,1 mililitre numune pipetleyin ve kapağı kapatın. Ucu bir atık kabına atın. Metal çubuğu, yayıcının tüm alt kısmını ve gövdenin ilk inçini kaplayan %70 etanol içeren bir behere batırın ve ardından süzün. Bir Bunsen brülörünün alevinden geçerek fazla etanolü tutuşturun. Ardından, agar plakasının kapağını açın ve yayıcıyı, kenarın yakınındaki kenar boyunca agar'a dokundurarak soğutun. Döner tablayı yavaşça döndürün. Yayıcıyı agarın yüzeyinde nazikçe tutarak, döner tabla dönerken ileri geri hareket ederek numuneyi tüm plakaya kademeli olarak eşit şekilde yayın. Kapağı kapatın ve numunenin en az beş dakika boyunca iyice emilmesine izin verin. Ardından, ters çevrilmiş plakayı inkübe edin. İlk olarak, agar plakasını uygun şekilde etiketleyin. Agar plakasının kapağını açın. Ardından önceden sterilize edilmiş cam boncuk kabını açın ve kenarı alevlendirin. 10 ila 12 steril cam boncuğu dikkatlice bir agar plakasına dağıtın. Kapağı değiştirmeden önce plakanın kapağını kapatın ve cam boncuk kabının kenarını alevlendirin. Şimdi, numuneyi agarın ortasına pipetleyin. Yatay hareketlerle, boncukları agarın yüzeyi boyunca yedi kez hafifçe sallayın. Düzgün yapılırsa, prosedür marakas sallamak gibi ses çıkarır. Plakayı 60 derece döndürün ve yatay olarak yedi kez tekrar sallayın. Tekrar plakayı 60 derece döndürün ve sallamayı tekrarlayın. Numunenin emildiğini doğrulayın. Ardından, kontamine boncukları %10 klorlu ağartıcı içeren işaretli bir toplama kabına dökün. Ters çevrilmiş plakayı inkübe edin. Plak testi, bakteri fajını tespit etmek ve miktarını belirlemek için yaygın olarak kullanılır. İndikatör bakterileri üstel faza kadar kültürleyin ve buz üzerinde saklayın. Daha sonra, iki steril mikrosantrifüj tüpünü faj olarak etiketleyin ve kontrol edin ve her birine sırasıyla 50 mikrolitre faj örneği veya tampon ekleyin. Daha sonra, bakteri kültürünü şişede döndürün, daha sonra bir bakteri alikotunu steril bir tüpe aktarın ve indikatör bakterileri nazikçe girdaplayın, ardından her bir emme tüpüne 500 mikrolitre bakteri ekleyin. Tüpleri hafifçe vurarak karıştırın. Faj örneklerini asla girdaplamayın veya kuvvetlice pipetlemeyin. Faj bakteri karışımını, indikatör suş için uygun bir sıcaklıkta 20 dakika inkübe edin. Bu arada, iki yumuşak agar tüpünü 55 santigrat derece su banyosundan 48 santigrat derece ısıtma bloğuna aktarın. 10 dakika dengeleyin. Oda sıcaklığına önceden dengelenmiş, yoğuşma içermeyen iki besleyici sert agar plakasını etiketleyin. Isı bloğundan yumuşak bir agar tüpünü çıkarın ve içeriğin dokunulamayacak kadar sıcak olmadığını kontrol edin. Daha sonra, karışımı aseptik olarak faj absorpsiyon tüpünden yumuşak agar tüpüne aktarın. Ardından, içeriği karıştırmak için avuç içi arasında hızla döndürün. Bir elinizdeki tüp ile diğer elinizle sert agar plağının kapağını açın. Tüpün tüm içeriğini hemen sert bir agar plakasının yüzeyine dökün. Plakayı hızlı ve nazikçe sallayın. Kapağı kapatın ve yumuşak agar katılaşana kadar plakayı 30 dakika boyunca düz bir seviyeye yerleştirin. Ardından, kontrol karışımını yumuşak bir agar tüpüne aktararak kontrol absorpsiyon tüpü için prosedürü tekrarlayın. Karıştırın, içindekileri sert bir agar plakasına dökün, sallayın ve yumuşak agarın 30 dakika katılaşmasına izin verin. Plakaları plak oluşumu açısından inceleyin. Bir plağı heterojen bir karışımdan izole etmek için, merkezi steril bir kürdan ile dikkatlice delin ve inokulumu 100 mikrolitre faj tamponu içeren steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Plak testini gerektiği gibi seri seyreltmelerle üç ila altı kez tekrarlayarak bu lizatı saflaştırmaya devam edin. Replika kaplama, birincil plakadaki hücre büyümesinin ikincil plakalarla karşılaştırılmasına izin vererek seçilebilir bir fenotipten yararlanır. Plakanın altında bir ızgara işaretleyin, birincil plakayı etiketleyin ve elde edilen kareleri numaralandırın. Şimdi, önceden sterilize edilmiş bir kürdanı beherden çıkarmak için aseptik teknik kullanın, her karenin ortasına bir hücre örneği ile vurun ve kürdanı uygun bir atık kabına atın. Birincil plakayı inkübe edin. Birincil plakayı ve tüm ikincil plakaları istifleyin. Plakaların alt yarısının yan tarafına bir yönlendirme işareti yerleştirin. Şimdi steril bir kadife bezi ambalajından çıkarın ve silindirik bloğun üzerine yerleştirin. Ardından, tutucuyu tutucu üzerindeki işaretleri bloktakilerle hizalayarak yerleştirin. Blok ve tutucu üzerindeki yönlendirme işaretine dikkat edin. Ardından, kapağı birincil plakadan çıkarın. Plaka ve blok üzerindeki yönlendirme işaretlerini hizalayın. Plakayı, agarın yüzeyi kadife kumaşa temas edecek şekilde indirin. Parmak uçlarınızı kullanarak, birincil plakanın arkasına hafifçe ama eşit bir şekilde bastırın ve ardından dikkatlice bloktan kaldırın. Hücrelerin baskısının kadife üzerinde görülebildiğini onaylayın. Plakanın kapağını yerine takın. Şimdi, ikincil plakaların her biri ile kadife kumaş üzerindeki protokolü sırayla tekrarlayın. En az ila en uygun alt tabakaya doğru sıralanan sekiz adede kadar ikincil plakayı aşılamak için birincil plakadan hücrelerin kadife izlenimini kullanın. Son olarak, pozitif bir kontrol olarak, serideki son plaka için, test edilen tüm suşların büyümesi gereken agar ortamını kullanın. Ters çevrilmiş plakaları birbirine bantlayın ve inkübe edin. İkincil plakaları büyüme açısından inceleyin. Bunsen brülörünü kapatın ve ardından tüm malzemeleri kaldırın. Kirlenmiş laboratuvar aşınmasını, cam eşyaları ve tehlikeli atıkları uygun atık kutusuna koyun. Çalışma alanını dezenfektan ile temizleyin. Son olarak, ellerinizi antiseptik sabun ve ılık suyla iyice yıkayın. Serratia Marcescens, prodigiosin adı verilen kırmızımsı bir pigment üreten gram negatif, çubuk şeklinde bir proteobakteridir. Genellikle banyolarda ve duş perdelerinde yetişir. Bu örnekte, çizgi plakası tekniği dördüncü kadranda tek koloniler oluşturur. Halka açık bir içme çeşmesinden toplanan bir su örneğinde bulunan bakterilerin bu analizi, Dökme Plakası tekniğini kullanır. Kolonilerin görünümündeki farka dikkat edin. Yüzey kolonileri büyük ve dairesel şekilliyken, bazı yüzey kolonileri çok küçük ve düzensiz şekillidir. Yayılmış Plaka tekniği, zenginleştirme, seçme ve eleme deneylerinde önemli bir bileşendir. Örneğin, copacabana yöntemi, rekombinant DNA teknolojisinde klasik mavi-beyaz ekranda farklılaştırıcı bir araçtır. Faj T4, döl fajını parçalamak ve serbest bırakmak için konakçısını Escherichia coli olarak enfekte eden virülan çift sarmallı bir DNA fajıdır. EHA agar üzerindeki bu plak testi, çapı yaklaşık bir milimetre olan temizleme bölgelerinde fajı gösterir. Enfekte edici faj parçacıklarının yokluğunda, bakteri üremesi, ayrı kolonilerin görünmediği yumuşak agarda bulanık bir hücre süspansiyonu ile sonuçlanır. Yumuşak agar kaplama tekniğinde plak morfolojileri farklılık gösterir. Örneğin, burada aynı mikobakteri konak suşu, mikobakteri faj MSSS'ye karşı mikrobakteri faj yok edicilerinin varlığında farklı plak morfolojileri üretir. Replika kaplamanın gücü, çok sayıda mikroorganizmanın aynı anda taranmasıdır. Bu durumda, dört pseudomonas suşu, üç farklı karbon kaynağında büyüme için iki kez test edildi. Asetamide, laktoz ve glisin. Burada, birincil plaka, belirtildiği gibi dört suş ile aşılanmış tam bir YTA ortamıdır. Suşlar, tek bir karbon kaynağı asetamid, laktoz veya glisin ile takviye edilmiş minimal MSA ortamının replika plakaları üzerinde değişken büyüme modelleri gösterir. Tüm suşlar, hücrelerin bu serideki tüm ikincil plakalara aktarıldığını doğrulayan son pozitif kontrol plakasında büyür. Bu replika plaka sonuçlarının tablolanması, karakteristik büyüme gereksinimleri için farklı yabani tip suşların aynı anda taranmasını detaylandırır.

- Bu videoyu izledikten sonra, ortamı veya kültürleri kirletmeden kaplama prosedürlerinin nasıl gerçekleştirileceğini ve ayrıca laboratuvarda herhangi bir deneysel görev için uygun kaplama yönteminin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu tekniklerle uzmanlaşmak pratik gerektirir. Bununla birlikte, uygun eğitimle, bu videoda açıklanan kaplama prosedürleri, laboratuvar tezgahında çalışırken ikinci doğa haline gelecektir.