$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Yapışık mezenkimal kök hücre veya MSC kültürü ile çok kuyulu bir plaka alın.
Periferik kan mononükleer hücreleri veya PBMC'leri ekleyin ve inkübe edin.
MSC'ler hepatosit büyüme faktörü salgılar, monositlerin immünomodülatör bir fenotip kazanmasına neden olur ve interlökin-10 veya IL-10 üretir.
PBMC içeren süpernatanı bir tüpe aktarın.
Monosit yüzey işaretleyicisi CD14'e bağlanan antikor kaplı manyetik boncuklar ekleyin.
CD14+ monositlerini izole etmek için manyetik bir ayırıcı kullanın ve bunları artan konsantrasyonlarda çok kuyulu plaka kuyularına ekleyin.
Floresan boya CFSE etiketli efektör CD4 + T hücrelerini tanıtın.
Hücreleri aktive ederek özellikle T hücresi yüzey belirteçleri CD3 ve CD28'e bağlanan antikor konjuge mikro boncuklar ekleyin.
Kontrol kuyusu eksik monositlerde, aktive edilmiş T hücreleri çoğalır ve her hücre bölünmesi yavru hücrelerde CFSE floresan yoğunluğunu azaltır.
Bununla birlikte, ko-kültürlerde, MSC ile indüklenen monositler, efektör T hücresi proliferasyonunu baskılayarak IL-10 salgılar.
Akış sitometrisi kullanarak, artan monosit konsantrasyonları ile azalmış CFSE floresan yoğunlukları sergileyen daha az T hücresi gözlemleyin, bu da MSC'nin neden olduğu monositler tarafından efektör T hücresi proliferasyonunun baskılandığını gösterir.
Bir efektör baskılama testi gerçekleştirmek için, alt popülasyon seçimi için yeterli MSC ko-kültürlenmiş PBMC'leri sağlamak için 250.000 MSC ile birlikte kültürlenmiş 2,5 x 106 PBMC ile bir MSC-PBMC ko-kültürü kurarak başlayın.
37 santigrat derecede 48 ila 72 saat sonra, uygun manyetik boncuklarla ilgilenilen MSC'nin neden olduğu immünomodülatör lökositleri seçin. Daha sonra, çeşitli deneysel oranlarda oyuk başına 1 mililitre tam lökosit ortamında CFSE etiketli allojenik CD4 pozitif T hücreleri ekleyin.
Daha sonra, CD4 pozitif T hücrelerini uyarmak için 1'e 1 boncuk-hücre oranında anti-CD3 / 28-konjuge mikro boncuklar ekleyin. Ko-kültürün üçüncü gününde, CFSE etiketli CD4 pozitif T hücrelerinin proliferasyonunu akış sitometrisi ile değerlendirin.