Bağışıklık ilaçlarının tanımlanmasında T lenfositlerinde mitojen kaynaklı blastojenez hızlı bir şekilde belirlenmesini

Bu prosedürün genel amacı, T lenfosit blastogenezini veya blast transformasyonunu ölçerek otomatik bir hücre sayacı kullanarak immünomodülatör ilaçların gücünü değerlendirmektir. Bu test, hücre çaplarını ölçmek için donatılmış otomatik bir hücre sayacı kullanarak T lenfosit aktivasyonunu ölçmek için hızlı bir yöntem sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, yaygın T lenfosit proliferasyon testlerinden farklı olarak tek hücrelerden hızlı, basit ve doğrudan ölçüme izin vermesidir.

Lenfositlerin immünomodülatör ilaçlarla tedavi edilmesi, hücresel blastogenezin hızını ve derecesini artıracak veya azaltacaktır. Hücre sayacı tahlili kullanılarak, bu blastogenezin kapsamı numune başına yaklaşık dört dakika içinde ölçülebilir. Kurban edildikten sonraki on dakika içinde, farenin karnına yüzde 70 etanol püskürtün ve hayvanın sol tarafındaki kürk ve deride bir kesi yapmak için makas kullanın.

Peritonu ortaya çıkarmak için cildi ayrı ve geride tutun. Daha sonra insizyon bölgesine yüzde dört klorheksidin uygulayın. İkinci bir makas ve forseps seti kullanarak, peritonu açmak için merkezi karın boyunca iki ila üç santimetrelik bir kesim yapın.

Ardından, dalağı çevreleyen viseral ekleri ve fazla yağı çıkarın ve dokuyu bir DPBS kabına aktarın. Daha sonra, on santimetrelik bir kültür kabına on mililitre tam RPMI 1640 orta ekleyin ve dalakları iki sterilize edilmiş buzlu cam slayt arasında ezin. Doku bulamacını steril bir 40 mikron naylon hücre süzgecinden geçirerek bağ dokularını ve kalıntıları çıkarmak için on santimetrelik yeni bir kültür kabına süzün ve tek hücreli süspansiyonu santrifüjleme için 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.

Peletleri 20 mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Hafifçe sallanarak oda sıcaklığında on dakika sonra, hücreleri başka bir santrifüjleme ile toplayın ve peleti on mililitre taze ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri, iki mililitre 37 santigrat derece tam ortamda yeniden süspansiyon için tekrar santrifüjleyin.

T hücrelerini saflaştırmak için, önce dalak başına bir ila iki naylon yün sütununu beş mililitre tam RPMI ile iki kez yıkayın ve sütunları bir saat boyunca 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksit hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, izole edilmiş splenosit süspansiyonunun iki mililitresini her bir kolonun üstüne yükleyin ve sıvı yünün tepesine ulaşana kadar hücrelerin kolondan geçmesine izin verin. Daha sonra, sütunların tepesine iki mililitre taze 37 santigrat derece tam ortam ekleyin ve ortamın naylon yünden geçmesine izin verin, sütunun tepesindeki sıvı yünün tepesine ulaşana kadar.

Şimdi yünü üç mililitre 37 santigrat derece tam ortamla örtün ve kolonu, yün liflerine yapışması için tüm B hücrelerine, fibroblastlara ve aksesuar hücrelere hücre kültürü inkübatörüne geri döndürün. Bir saat sonra, 50 mililitrelik yeni bir konik tüpte, yapışmayan T hücrelerini elüte etmek için sütunu beş mililitre taze tam ortamla iki kez yıkayın. Daha sonra hücreleri santrifüjleme ile toplayın.

T hücrelerini on mililitre tam ortamla bir kez yıkadıktan sonra, peleti iki mililitre taze tam ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri sayın ve süspansiyonu, deneysel olarak uygun olduğu şekilde altı veya 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasına tohumlamak için taze tam ortamda mililitre başına on ila altı hücre konsantrasyonunda 0.5 çarpı on ila altı hücreye seyreltin. İzolasyonlarından sonraki 24 saat içinde, naylon yün kolonundan izole edilmiş T hücrelerini uygun uyaran ve ilgilenilen deneysel ilaçla aktive edin.

12 ila 72 saat sonra, herhangi bir topaklanmayı gidermek için aktive edilmiş işlenmiş hücreleri nazikçe karıştırmak için bir mililitrelik bir pipet kullanın. Hücre çaplarını otomatik hücre sayacı ile ölçmek için, her bir oyuktan işlenmiş hücrelerin bir mililitresini ayrı numune kaplarına aktarın ve numune kaplarını otomatik hücre sayacının numune karuseline yerleştirin. Örnekleri günlüğe kaydetmek ve örnekleri çalıştırmaya başlamak için örnek kimliğini ve hücre türü bilgilerini girin.

Tripan mavisi hücre süspansiyonu ile karıştırıldıktan sonra, hücreler her numuneden yaklaşık 100 hücre görüntüsü toplanana kadar bir görüntüleme alanı üzerinden geçirilir. Yazılım, hücre çapını belirlemek için tespit edilen her tripan mavisi lekeli ve lekesiz hücrenin etrafına bir daire çizer. Tüm hücreler ölçüldüğünde, veriler, sonuçları ölçülen her çap için toplam ve canlı hücre sayıları olarak gösteren bir elektronik tabloya aktarılır.

Veriler daha sonra histogramlar olarak sunulabilir. PMA ve iyonomisin ile iki günlük stimülasyondan sonra, frekans dağılımının medyanında daha büyük hücre çaplarına doğru önemli bir kayma gözlenir ve buna göre daha küçük çaplara sahip T hücrelerinin sayısı azalır. Sabit bir 250 nanomolar iyonomisin konsantrasyonunda, aktivasyon uyaranının konsantrasyonunu mililitre başına iki ila 250 nanograma yükselterek PMA etkisi önemli ölçüde değişmez.

Gözlenen T hücresi proliferasyonunda da kayda değer bir fark yoktur. Kalsinörin inhibitörü ilaçlar hem T hücre blastogenezini hem de proliferasyonunu kısmen baskılamaktadır. Aktive edilmiş T hücrelerinin kalsinörin nükleer faktörünü hedef alan immünosüpresif bileşiklerle T hücresi tedavisi, blastojenik yanıtı yaklaşık yüzde 72 oranında inhibe eder.

Rapamisin ve FTY720, blastogenez üzerinde orta derecede ancak istatistiksel olarak anlamlı etkiler gösterir. TRAM34, 700 nanomolar konsantrasyonda bile murin T hücresi proliferasyonunu etkilemez. Rapamisin ve siklosporin A birlikte kullanıldığında, blastogenez tamamen inhibe edilir.

Anti-CD3 ve anti-CD28 konjuge manyetik boncuklar ile aktive edilen murin T hücreleri ile benzer sonuçlar gözlenir. Bu test, çeşitli immünomodülatör ilaçların etkilerini başarılı bir şekilde ölçmek için kullanılabilir ve apoptotik ve nekrotik hücrelerden gelen katkıları da içeren tipik proliferasyon testlerine kıyasla ilaç potansiyelinin daha iyi bir değerlendirmesini sağlar. Bu yöntemle, hem blastogenez hem de proliferasyon oranlarının aynı anda ve daha sonra nicelleştirilmesine olanak tanıyan 15 adede kadar numune içeri ve dışarı ölçülebilir.

Bazen hava kabarcıkları akış hücresine girerek ölçümü kullanılamaz hale getirebilir, bu nedenle her denemeden elde edilen veriler analiz için kabul edilmeden önce tüm görüntüler hava kabarcıkları açısından incelenmelidir. Bu prosedürün bir sınırlaması, numunede çok fazla kalıntı varsa, ölçümün kalıntıları canlı hücreler olarak ele alabilmesidir. Uygun modifikasyonlarla, bu tahlil, nötrofiller ve hepatositlerdeki hücre boyutu değişimini incelemek için uyarlanma potansiyeline sahiptir.