Miktar monosit hicret ve köpük hücre oluşumu kronik inflamatuar koşullara sahip bireylerden
October 17th, 2017
Biz hicret monosit karşısında insan endotel monolayers tarafından ve onların sonraki olgunlaşma köpük hücrelerine ölçmek için bir protokol tanımlamak. Bu farklı hastalık koşullara sahip insanlardan izole monosit aterojenik özelliklerini değerlendirmek için ve bu eğilimi geliştirmek kan faktörleri değerlendirmek için çok yönlü bir yöntem sağlar.
Bu testin genel amacı, insan klinik örneklerinden alınan monositlerin transendotelyal migrasyon ve köpük hücresi oluşumuna uğrama kapasitesini ölçmektir. Bu yöntem, akut koroner arter hastalığı riski taşıyan bireylerden alınan hücrelerin aterojenik potansiyeli gibi kardiyovasküler alandaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, klinik örneklerin hem taze tam kandan hem de depolanmış hasta kohortlarından ölçülebilmesidir.
Ayrıca, köpük hücresi oluşumu hem mikroskopi hem de akış sitometrisi ile ölçülebilir. İlk olarak, polimerize kollajen jellerini taze bir kollajen süspansiyonundan hazırlayın. Beş mililitrelik bir polistiren tüpe sodyum hidroksit, ardından 10 kez M199, ardından asidik asit ekleyin ve son olarak lifli kollajen ekleyin.
Bunu pipetleyerek iyice karıştırın. Daha sonra, steril düz tabanlı 96 oyuklu bir doku kültürü plakasının iç kuyucuklarına 50 mikrolitre alikot edin. Kuyuların dış kenarlarına, kurumayı önlemek için 200 mikrolitre bir kez Dulbecco PBS yükleyin.
37 santigrat derecede iki saatlik inkübasyondan sonra, kollajen polimerize olacaktır. Daha sonra, jelleri 150 mikrolitre bir kez takviye edilmiş M199 ile kaplayın ve beş gün sonra kullanım için ihtiyaç duyulana kadar inkübe edin. Depolanmış insan göbek damarı endotel hücrelerini genişletmek için, bir mililitre fibronektin çözeltisi ile 25 santimetre karelik bir kültür şişesi hazırlayın ve tabağı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
Bu arada, depolanan hücreleri M20'de yeniden süspanse etmek için bir su banyosunda çözün. Hücreler çözüldükten sonra, kalan fibronektin çözeltisini tabaktan aspire edin ve hücreleri plakalayın. Ardından, iki ila üç gün sonra medyanın yerini alarak kültür birleşiyor.
HUVEC'ler, kültürlemenin beşinci gününde birleşmelidir. Kültürün süpernatanını şişeden aspire ederek bunları ayırın ve ardından serum içeren ortamı iki ila üç mililitre PBS kullanarak yıkayın. Daha sonra, beş mililitre seyreltilmiş tripsin ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında kısa bir süre inkübe edin, hücreleri ayrılmış görünene kadar hafifçe sallayın.
Daha sonra, bunları hızlı bir şekilde beş mililitre M20 ile toplayın ve süspansiyonu 10 mililitrelik bir tüpe ve santrifüjlenmiş hücrelere aktarın. Şimdi, M20'deki hücreleri mililitre başına 200.000 hücrede yeniden askıya alın. Ardından, hazırlanan kollajen plakasından M199'u aspire edin ve her jele 100 mikrolitre HUVEC ekleyin.
Üç gün boyunca kültüre devam edin. HUVEC'lerin kültürlenmesinin sekizinci gününde, monositleri eklemeden önce tek katmanları etkinleştirin. Kaplama ortamını aspire ettikten sonra, her oyuğa 100 mikrolitre insan TNF-alfa çözeltisi ekleyin.
Ardından, plakayı dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamı çıkarın ve yıkama başına 100 mikrolitre M199 kullanarak jelleri iki kez yıkayın. Şimdi, HUVEC tek katmanlarına 100 mikrolitre M20 içinde 50.000 yeni izole edilmiş monosit veya saflaştırılmış monosit alt kümesi ekleyin.
Monositleri ekledikten sonra, hücrelerin ileri transmigrasyonuna izin vermek için plakayı bir saat inkübe edin. Bir saat sonra, göç etmemiş hücreleri yıkama solüsyonunda toplayın. Kuyucuk başına 100 mikrolitre kullanarak iki EGTA yıkamasını bir araya getirerek başlayın.
Ardından, kombine yıkama solüsyonlarını 300 G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca döndürün. Süpernatanı atın ve hücreleri 30 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin ve ileri transmigasyon yapan hücrelerin yüzdesini belirlemek için hücreleri sayın. Şimdi, plaka kuyularını M199 ile bir kez yıkayın ve plaka kuyucuklarına 100 mikrolitre taze M20 ekleyin ve plakayı iki gün inkübe edin.
İki gün sonra, ters göç etmiş hücreleri toplamak ve hücrelerin fenotipik analizine devam etmek için EGTA yıkama çözeltisinde göç etmemiş hücrelerin toplanması prosedürünü tekrarlayın. Jile bağlı hücreleri FACS analizi ile fenotipik olarak karakterize etmek için, 100 mikrolitre 37 santigrat derece kollajen D ekleyerek ve 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe ederek hücreleri sindirin. İnkübasyonun ardından, 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak jelleri yumuşatın ve jelleri tamamen sindirmek için 20 dakika daha inkübe edin.
Tamamen sindirildikten sonra, sindirilmiş replikat jelleri 35 mikronluk bir naylon ağdan süzün ve buz üzerindeki bir FACS tüpüne toplayın. Şimdi, filtrelenmiş hücreleri soğuk FACS yıkama solüsyonu ile bir kez yıkayın. Hücreleri santrifüjleyin ve 100 mikrolitre soğuk yıkama solüsyonunda tekrar süspanse edin.
Ardından, metin protokolüne göre FACS boyama ve analizi yapın. Hücreleri mikroskopi ile analiz etmek için, önce hücreleri metin protokolünde açıklandığı gibi boyayın. Lekeli hücreleri ayırmak için, eğim dışa bakacak şekilde 21 gauge bir iğne kullanarak kuyuları kapatın.
Ardından, jelleri monte etmek için slaytlar hazırlayın. Çift taraflı bant şeridine iki küçük delik açın ve ardından bandı sürgüye sabitleyin ve koruyucu kaplamayı çıkarın. Ardından, banttaki her deliğe bir damla su ekleyin.
Ardından, cımbız kullanarak iki jeli iki deliğe nazikçe aktarın ve bandı kapatın. Son olarak, banda dikkatlice bir lamel takın ve hücrelerin görselleştirilmesine devam edin. Transmigrasyonu takiben, transmigrasyon yapmayan hücreler tarif edildiği gibi sayıldı.
Toplam 15.000 transmigrasyon yapılmamış hücre geri kazanıldı ve ileri transmigrasyon yüzdesi% 95 olarak belirlendi. 48 saatlik daha fazla inkübasyonun ardından, 36.000 ters transmigrasyon hücre geri kazanıldı ve bu da %12.6 ters transmigrasyona tekabül etti. Jellerin yağ kırmızısı O ile boyanması, beyaz oklarla gösterilen köpük hücrelerini ve siyah oklarla gösterilen makrofajları ortaya çıkardı. Bu monositler, geleneksel köpük hücresi indüksiyon modellerinde köpük hücresi oluşumunu indüklemek için kullanılan bir madde olan transmigrasyon sırasında oksitlenmiş LDL ile muamele edildi.
12 donörden elde edilen toplam hücre sayımı verileri, monositlerin oksitlenmiş LDL ile inkübasyonunun, monositlerin tek başına doğal LDL veya M199 ortamı ile inkübe edildiği duruma göre daha fazla köpük hücresi oluşumuna neden olduğunu doğruladı. Transmigasyon yapılan hücreler ayrıca akış sitometrisi ile analiz edildi. Ölü hücreler, çiftler ve CD45 negatif HUVEC'ler hariç tutulduktan sonra, göç eden hücrelerin ana popülasyonu seçildi ve ilgilenilen reseptörlerin ortalama floresan yoğunluğu, floresan eksi bir veya izotip kontrol verileri ile karşılaştırıldı.
Bu videoyu izledikten sonra, insan klinik örneklerinden monosit transendotel göçünü ve köpük hücresi oluşumunu ölçmek için bu testin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. İnsan klinik örnekleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve her zaman iyi laboratuvar tekniğinin kullanılması gerektiğini unutmayın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, insan endotelyal monokatlar boyunca monositlerin geçişini ve köpük hücrelerine dönüşümlerini ölçmek için bir protokol sunar. Bu yöntem, çeşitli hastalık durumlarına sahip bireylerden monositlerin aterojenik özelliklerinin değerlendirilmesi için değerlidir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyovasküler araştırmalar
- Hücre biyolojisi
- İmmünoloji
Arka Plan
- Monositler, aterosklerozda kritik bir rol oynar.
- Onların davranışını anlamak, kardiyovasküler hastalıklar hakkında bilgi sağlayabilir.
- Transendotelyal geçiş, monosit fonksiyonunda kilit bir süreçtir.
- Köpük hücre oluşumu, aterojenezde önemli bir olaydır.
Çalışmanın Amacı
- İnsan klinik örneklerinden monositlerin transendotelyal geçişini kantitatif olarak değerlendirmek.
- Aterojenik potansiyelin bir ölçüsü olarak köpük hücre oluşumunu değerlendirmek.
- Kanda çeşitli faktörlerin monosit davranışı üzerindeki etkisini değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Taze kollajen süspansiyonundan polimerize kollajen jellerinin hazırlanması.
- İnsan endotelyal monokatlar kullanarak transmigrasyon analizleri.
- Mikroskopi yoluyla köpük hücre oluşumunun kantitatif analizi.
- Hücresel değişikliklerin detaylı analizi için akış sitometrisi.
Ana Sonuçlar
- Monosit transmigrasyonunu etkili bir şekilde ölçme yetisini gösterdi.
- Klinik örneklerin hem taze kandan hem de saklanmış kohorlardan analiz edilebileceğini gösterdi.
- Monosit davranışı ile aterojenik risk arasında bir korelasyon kuruldu.
- Köpük hücreleri kantitatif olarak değerlendirmek için mikroskopi ve akış sitometrisinin kullanımı doğrulandı.
Sonuçlar
- Bu protokol, kardiyovasküler araştırmalarda monosit davranışı çalışmaları için çok yönlü bir yaklaşım sağlar.
- Akut koroner arter hastalığı riski taşıyan bireyleri tanımlamaya yardımcı olabilir.
- Gelecekteki çalışmalar bu yöntemi terapötik müdahaleleri araştırmak için kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This human in vitro model enables direct assessment of monocyte transmigration and foam cell formation from clinical samples, providing a disease-relevant system for evaluating atherogenic potential in comorbid conditions such as HIV and aging. By capturing key early atherogenic events in a human cellular context, the assay supports mechanistic de-risking in cardiovascular target validation and lead identification efforts. It bridges the gap between murine model limitations and human pathophysiology, offering predictive value for prioritizing therapeutic candidates targeting monocyte-driven inflammation in atherosclerosis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying monocyte transmigration and foam cell formation as functional readouts of atherogenic potential in disease-relevant human cells.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets involved in monocyte-endothelial interactions using primary monocytes from defined clinical cohorts.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating monocyte behavior with known atherogenic stimuli like oxidized LDL, enhancing confidence in target mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, quantitative outputs via microscopy or flow cytometry to assess monocyte migration and lipid-laden macrophage formation under controlled conditions.
- Operational Value: Establishes a reproducible platform for screening serum or plasma factors that modulate monocyte transmigration or foam cell maturation.
- Scalability: Compatible with 96-well format and cryopreserved samples, enabling batch processing of clinical cohorts for biomarker discovery.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant human monocytes from individuals with chronic inflammatory conditions (e.g., HIV, aging) to model human-specific atherogenic mechanisms not fully recapitulated in mice.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase monocyte behavior to preclinical validation by measuring responses to pro-atherogenic ligands like oxidized LDL.
- Risk-Adjusted Decision-Making: Enables evaluation of how comorbid diseases alter monocyte phenotype, informing patient stratification strategies in therapeutic development.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing functional immune cell assays that inform early cardiovascular drug development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on monocyte activation states and endothelial crosstalk in atherosclerosis pathogenesis.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized readouts for evaluating compound effects on monocyte transmigration and foam cell formation.
- Analytics: Generates quantitative metrics (e.g., % transmigration, mean fluorescence intensity) enabling comparison across experimental conditions and donor groups.
- Translational Research: Uses primary human monocytes to enhance clinical relevance of mechanistic findings before preclinical investment.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular platform adaptable to various stimuli (e.g., cytokines, lipids, serum) and readouts across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by measuring functional monocyte behavior in a human disease-relevant system.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility through defined steps for collagen gel preparation, endothelial monolayer formation, and cell isolation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying targets that modulate monocyte-driven atherogenic processes early in discovery.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds based on effects in human monocyte assays from clinically relevant cohorts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cell isolation, endothelial cell culture, and sterile technique for handling clinical blood samples.
- Dependent on consistent sourcing of fibrinolytic collagen, endothelial cells (HUVECs), and endotoxin-free reagents for reproducible gel polymerization.
- Necessitates standardized protocols for monocyte isolation (e.g., PBMC purification) and activation status assessment across donor cohorts.
- Requires access to flow cytometry or fluorescence microscopy platforms for endpoint quantification of transmigrated and foam cells.
- Limited by donor variability and sample availability; necessitates adequate cohort sizing for statistical power in comparative studies.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Culturing HUVEC Monolayer on Collagen Gels
3:38
Activation of HUVEC Monolayer and Isolation/Activation of Monocytes for Transmigration
5:44
Quantification of Foam Cells and Macrophages by Microscopy or Flow Cytometry
7:42
Results: Characterizing the Transmigrating Mice
9:09
Conclusion
