Kanser Hücrelerinde Replikasyon Stresini Ölçmek için İmmünofloresan Tabanlı Bir Yöntem

Timidin nükleotidinin sentetik bir ikamesi olan ve zaten DNA'larına entegre edilmiş olan IdU'yu taşıyan kanser hücreleriyle başlayın. Bu hücreler replikasyon stresi ile karşılaştıklarında, DNA sentezleri durur ve açıkta kalan tek sarmallı DNA bölgelerinde IdU'yu ortaya çıkarır.

Hücreleri sabitleyin ve hücre zarını geçirgen hale getirmek için deterjan molekülleri ekleyin.

Hedef olmayan antikor bağlanma bölgelerini bloke etmek için BSA ekleyin.

IdU etiketli tek sarmallı DNA ile etkileşime giren anti-IdU antikorlarını tanıtın.

Anti-IdU antikorlarını hedef alan yeşil florofor işaretli ikincil antikorlar ekleyin. Bağlanmamış antikorları çıkarın.

Lameli mileyi, çekirdeği lekeleyen floresan boya içeren bir montaj ortamı içeren bir slayt üzerine yerleştirin.

Floresan mikroskobu altında mavi çekirdekleri gözlemleyin.

Yeşil floresan odakları, tek sarmallı DNA'ya bağlanan antikorları temsil eder.

Çoğaltma stresi seviyesini ölçmek için odak sayısını sayın.

24 oyuklu bir plakanın oyuklarına yerleştirilen poli-L-lizin lamelleri üzerine 1 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin ve hücreleri standart koşullar altında kültür ortamında büyütün. Bir popülasyon iki katına çıktıktan sonra, mevcut ortamı p