Kanser Hücrelerinde Replikasyon Stresini Ölçmek için İmmünofloresan Tabanlı Bir Yöntem

Timidin nükleotidinin sentetik bir ikamesi olan ve zaten DNA'larına entegre edilmiş olan IdU'yu taşıyan kanser hücreleriyle başlayın. Bu hücreler replikasyon stresi ile karşılaştıklarında, DNA sentezleri durur ve açıkta kalan tek sarmallı DNA bölgelerinde IdU'yu ortaya çıkarır.

Hücreleri sabitleyin ve hücre zarını geçirgen hale getirmek için deterjan molekülleri ekleyin.

Hedef olmayan antikor bağlanma bölgelerini bloke etmek için BSA ekleyin.

IdU etiketli tek sarmallı DNA ile etkileşime giren anti-IdU antikorlarını tanıtın.

Anti-IdU antikorlarını hedef alan yeşil florofor işaretli ikincil antikorlar ekleyin. Bağlanmamış antikorları çıkarın.

Lameli mileyi, çekirdeği lekeleyen floresan boya içeren bir montaj ortamı içeren bir slayt üzerine yerleştirin.

Floresan mikroskobu altında mavi çekirdekleri gözlemleyin.

Yeşil floresan odakları, tek sarmallı DNA'ya bağlanan antikorları temsil eder.

Çoğaltma stresi seviyesini ölçmek için odak sayısını sayın.

24 oyuklu bir plakanın oyuklarına yerleştirilen poli-L-lizin lamelleri üzerine 1 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin ve hücreleri standart koşullar altında kültür ortamında büyütün. Bir popülasyon iki katına çıktıktan sonra, mevcut ortamı plakadan aspire edin ve sonraki iki popülasyon ikiye katlaması için hücreleri 10 mikromolar IdU ile nabız atın.

Hücreleri hasat etmek için, ortamı 5 dakika boyunca buz üzerinde buz gibi% 0.5 PBSTx ile değiştirin. Hücrelerin sabitlenmesi için PBSTx'i aspire edin ve hücreleri oda sıcaklığında% 3 paraformaldehit ile 15 dakika inkübe edin. PBS ile 3 ila 4 yıkamadan sonra, sabit hücreleri daha fazla kullanana kadar 4 santigrat derecede tutun.

Fiksasyondan sonra, 5 dakika boyunca buz üzerinde% 0.5 PBSTx kullanarak hücrelere geçirgen hale getirin ve tüm lamel kaplamasını sağlayın. Hücreleri oda sıcaklığında 1 mililitre% 0.2 PBST ile 3 ila 4 kez yıkadıktan sonra, PBST'yi aspire edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS'de yapılan% 5 BSA kullanarak numuneleri bloke edin.

İmmün boyama için, düz tabanlı bir Tupperware üzerine ıslak bir kağıt havlu koyarak nemlendirilmiş bir oda hazırlayın. 24 oyuklu plaka kapağını parafilm ile örtün. Nemlendirilmiş hazneye yerleştirin ve lamelleri tabak kapağının üzerine koyun. Lamelin üstüne 60 mikrolitre seyreltilmiş anti-BrdU birincil fare antikoru ekleyin.

Alternatif olarak, antikorun kurumasını azaltmak ve daha az hacim kullanmak için, parafilm üzerine bir damla seyreltilmiş antikor koyun ve lamel üzerine çevirin. Ardından, 37 santigrat derecede 1 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, birincil antikoru aspire edin.

Lamelleri 24 oyuklu bir plakaya geri koyun ve 4 kez% 0.2 PBST ile yıkayın. Daha önce gösterildiği gibi lamel üzerine seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bir mikroskop lamını etiketleyin ve lamel DAPI montaj ortamı ile lamellerin üzerine monte edin. Montaj ortamının kürlenmesi veya sertleştirilmesi gerekiyorsa, slaytları karanlıkta oda sıcaklığında 24 saat saklayın.