Yüksek içerik, Open Source Software tarafından desteklenen Evrensel Mikroskop Verilerden Floresan Göstergeler, Bireysel Hücre Niceleme için iş akışı

Bu prosedürün genel amacı, mikroskop görüntülerinden belirli floresan işaretleyici yoğunluklarını ölçerek tek tek hücrelerin tepkilerini objektif olarak ölçmektir. Bu, önce yapışık bir doku kültürü hücrelerinin irna aracılı gen yıkımına tabi tutulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, hücreler floresan olarak boyanır ve daha sonra ilgilenilen birkaç belirteç için görüntülenir.

Son adımda, belirli hücre altı bölgeler içindeki belirteçlerin ifadesi algoritmik olarak tanımlanır, tek tek hücrelerdir. Sonuç olarak, gen yıkımından kaynaklanan biyolojik ipuçlarına hücresel tepkiler, ilgilenilen belirteçlerin floresan ekspresyon seviyeleri ve bunların hücre altı Translokasyonları ölçülerek analiz edilebilir. Bu prosedür, siRNA'lara yanıt olarak G bir hücre döngüsü geçişinin düzenlenmesi hakkında bilgi sağlasa da.

Floresan hücre görüntüleri üreten, nükleer taşınım ve protein homeostazını inceleyen çalışmalara da uygulanabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan Daniel Wek ve Car K HO doktora sonrası arkadaşlar olacak 70 mikrolitre 200 nanomolar irna dağıtarak başlayın, steril bir doku kültürü davlumbazında steril 96 oyuklu bir plakanın uygun kuyucuklarına seyreltilmiş bir irna tamponu. Daha sonra, 40 hacim serum serbest DMEM ortamında seyreltilmiş 105 mikrolitre transfeksiyon lipidini, oda sıcaklığının hafif titreşimi ile plakayı karıştırın ve daha sonra 10 dakika sonra, elde edilen 175 mikrolitreyi, şeffaf bir tabana sahip opak bir doku kültürü ile muamele edilmiş 96 oyuklu plakaya hedef başına üç 50 mikrolitre kopyaya bölün.

Daha sonra,% 10 serum ile 150 mikrolitre DMEM'de kuyu başına 8.000 hücreyi karıştırmadan doğrudan 50 mikrolitre lipid irna komplekslerine dağıtın. Daha sonra plakayı steril bir yapışkan, nefes alabilen membran ile kapatın ve plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. 48 saat sonra medyayı plakalardan aspire edin.

Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında bir davlumbazda 100 mikrolitre% 4 tampon formaldehit içine sabitleyin 10 dakika sonra, fiksatifi aspire edin ve son yıkamadan sonra PBS ile üç adet 100 mikrolitrelik yıkama yapın. PBS'yi çıkarın ve hücreleri, her biri 10 dakikalık 100 mikrolitrelik perme solüsyonu inkübasyonlarından oluşan üç döngü ile çalkalamadan oda sıcaklığında delin. Son inkübasyondan sonra, geçirgenlik çözeltisini çıkarın ve ardından oda sıcaklığında 30 dakika boyunca oyuk başına 100 mikrolitre blok çözeltisi ekleyin.

Daha sonra blok çözeltiyi aspire edin ve hücreleri, DNA boyası GFP'ye karşılık gelen üç kanalda ayrı 16 bit gri ölçekli TIFF görüntüleri almak için 20 x objektifli uc konfokal mikroskobu etiketlemekten sonraki iki hafta içinde ilgilenilen birincil antikorun 50 mikrolitresi ile araştırın ve immüno boyama. Flora fours, kuyu başına yaklaşık 1000 ila 2000 hücreyi görüntülemek için örtüşmeyen birçok görüntü seti veya çerçeve yakalar. Görüntü dosyasını meta veri bilgileriyle sistematik olarak adlandırma, böylece her dosya adı deney adı, kuyu adresi, çerçeve numarası ve kanal tanımlayıcısının benzersiz bir kombinasyonu olur.

Ardından hücre profilleyici yazılımını açın ve dosyala ve işlem hattını içe aktar'a tıklayın. Ardından, dosyadan altında, yazılımın kaydedilen dosya adından görüntü dosyası meta verilerini yorumlaması için gerekli talimatları içeren üç kanallı boru hattı CP boru dosyasını seçin Convention Cell Profiler artık görüntüleri ilişkilendirmek, dosyalardan nükleer DNA ve antikor yoğunluklarını çıkarmak ve nükleer ve sitoplazma yoğunluğunun oranını hesaplamak için GFP kanalını kullanmak için kullanılabilir. Algılanan her hücre için, çıktı ayarlarını görüntüle düğmesine tıklayın ve ardından varsayılan giriş ve varsayılan çıkış klasörlerine tıklayın.

Sırasıyla analiz için görüntü dosyalarının konumunu ve çıkarılan veriler için hedefi seçme. Ardından analiz modülleri penceresinde, analiz sırasında birincil nesneleri ve üçüncül nesneleri tanımla pencerelerini gözlemlemek için uygun göz simgelerine tıklayın ve analiz tamamlandığında görüntüleri analiz et'e tıklayın. Mesaj kutusunda Tamam'a tıklayın ve tüm veri dosyalarının virgülle ayrılmış değer dosyaları olarak kaydedildiği varsayılan çıktı klasörü Konumuna gidin.

Veri çıkarma işlemini gerçekleştirmek için, floresan nükleer antikor yoğunluğu, nükleer DNA yoğunluğu ve GFP CDK iki raportör oranı değerleri için ayrı hücre verilerini içeren hücre profilleyicinin çıktısı arasında yer alan yeni çekirdek CSV dosyasını bulun. Sağlanan darbe komut dosyası dosyasını, yürüyüş sınıflandırıcı PL'ye çekirdek CSV veri dosyasıyla aynı klasöre kopyalayın. Ardından Pearl Script simgesine çift tıklayın.

Ve istendiğinde, veri dosyasının tam adını ve ardından hücrelerin kapılanacağı dosya için bir DOT CSV dosya adını ve antikor floresansı ve G FP CDK iki raportör verisi için kapı değerlerini yazın. Yeni oluşturulan dosyanın, verilerin orijinal hücre profilinden alınan ham bireysel hücre tahlil değerlerini, her bir kuyucuktaki her hücrenin her iki kapıya karşı nasıl performans gösterdiğini gösteren alt popülasyon etiketleriyle birleştirdiğini onaylayın. Şimdi, dosya ve dosya aç'a tıklayarak ve ardından sağlanan analiz nokta r dosyasını seçerek tek tek hücre alt popülasyon etiketlerini kullanarak her deneysel koşul için verileri çizmek üzere R Studio yazılımını açın.

Sürücü harfi ve dosyanın adı da dahil olmak üzere, geçitli verileri içeren klasörün bilgisayar adresini yazın. Ardından, stüdyomuzun sol üst penceresinde birden 17'ye kadar olan çizgileri vurgulayın ve deneysel veri eşik değerlerini ve kuyu konumu ayrıntılarını girmek için çalıştır düğmesine tıklayın. Son olarak, 17. satırın altında kalan kodun tek tek bloklarını vurgulayın ve ilgili grafikleri oluşturmak için çalıştır düğmesine tıklayın.

Stüdyomuzun sağ alt köşesindeki pencerede çizimleri gözlemleyin ve ardından bunları çeşitli formatlarda kaydetmek için dışa aktar düğmesine tıklayın. Burada açıklanan iş akışı, tanımlanan her hücreyi ve karşılık gelen tahlil değerlerini detaylandıran bir liste biçiminde ham veriler üretmek için floresan mikroskop görüntülerini analiz eder. Bu verilerin analizi için birçok seçenek mevcuttur.

Örneğin, bu histogram grafiklerinde, kontrol RNA'ları ile muamele edilen hücreler için tahlil değerleri, her bir tahlili eşiklemek için uygun kapıların tanımlanmasını sağlar. Geçit eşikleri daha sonra ham verilerdeki her hücreyi tahlil sonucuna göre etiketlemek için bir darbe komut dosyası kullanılarak uygulanır. Bu etiketleme yaklaşımı, tedaviler arasındaki ilişkilerin ön görselinin yanı sıra otomatik olarak değerlendirilmesine ve çok büyük bireysel hücre veri kümelerinin bile alt popülasyon dağılımına yardımcı olur.

Örneğin, bu temsili deneyde, üçlü irna nakavt koşulları, hücrelerin kapılara göre zıt dağılımlarıyla sonuçlandı, iki tahlildir. R grafikleri, her kadrandaki hücrelerin yüzde dağılımlarını hesaplamak için etiketleri kullanır. Etiketler ayrıca ek floresan ölçümlerinin tahlil verileriyle çapraz referanslanmasını sağlar.

Bu deneyde, SI CDK altı ile muamele edilen hücrelerin alt popülasyonları, ilgili tahlil etiketlerine göre gruplandırıldı ve nükleer DNA boyama histogramları olarak çizildi. Hücre veri etiketlerinin bu kullanımı, iki hücre tahlili ile hücrelerdeki DNA içeriği arasındaki ilişkiyi ortaya koymaktadır. Bu prosedürü gerçekleştirirken, hücre profilleyici kullanırken görüntü segmentasyon parametrelerini test etmeyi ve ayarlamayı unutmamak her zaman önemlidir.

Bu, özellikle yeni veya test edilmemiş görüntü dosyalarını ilk kez kullanırken önemlidir. Tamam.