Name: Yüksek içerik, Open Source Software tarafından desteklenen Evrensel Mikroskop Verilerden Floresan Göstergeler, Bireysel Hücre Niceleme için iş akışı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Keşfedin açık kaynak yazılım destekli yüksek içerikli floresan mikroskopi analizi iş akışını. siRNA gen susturması ve hücresel yanıtların nicelemesi için Cell Profiler ve R Studio kullanın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma hibe CRUK 15.043 ve 14.251 CRUK tarafından desteklenmiştir. Biz teknik yardım ve yazının eleştirel okuma Daniel Wetterskog ve Ka Kei Ho teşekkür ederim.

Tepki markerleri 1. Deneysel Perturbation ve Hücre Etiketleme (Ters Transfeksiyon siRNA Ekran) <ol><li> Steril doku kültürü başlık pipet olarak steril, düz 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına 1x siRNA tampon maddesi içinde 200 nM siRNA 70 ul. Serumdan yoksun DMEM ortamı kullanılarak 40 hacim içine transfeksiyon lipid seyreltilir ve her bir oyuğa içeren siRNA içine 105 ul akıtın. Not: serumsuz DMEM 10.5 ml 262.5 ul lipid seyreltilmesi oyuk başına lipit 2.6 ul teslim siRNA bir bütün 96 oyuklu bir plaka için uygun olan bir ana karışımı elde edilir. Bu aşamada 200 nM siRNA başlangıç ​​konsantrasyonunun kullanımı adım 1.3 içinde 20 nM&#39;ye bir çalışma konsantrasyonunu sağlar, ancak prosedürler göre ayarlanır başlangıç ​​konsantrasyonu (yani 50 nM), 5 nM kadar konsantrasyonlarda çalışmak için çalışacaktır. Onlar-hedef yanıt büyüklüğünü azaltabilir, ancak alt çalışma konsantrasyonu üzerinde Kalkanı artmasına yol açan, hedef dışı yanlış pozitif puanları azaltabiliryanlış negatif oranları t. </li><li> Oda sıcaklığında on dakika boyunca hafif bir titreşim plakasına karıştırın. Üç adet 50 ul verecek şekilde 175 ul Alt bölme şeffaf bir baz ile, 96 kuyucuklu plak tedavi opak, doku kültürü üzerine hedef başına çoğaltır. </li><li> 50 ul lipid siRNA kompleksleri doğrudan% 10 serum ihtiva eden 150 | il DMEM içinde oyuk başına 8,000 hücre dağıtarak Arka transfeksiyonu. Kullanım HCT116 insan kolorektal hücreleri stabil CDK2 aktivitesinin 5,8 raporlama GFP-etiketli işaretleyici ifade. Daha başka bir karıştırma gereklidir. Nem kontrol etmek ve plakanın &#39;kenar etkileri önleyerek ve 48 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör içine plaka yerleştirmek için steril, yapışkan nefes alabilen membran ile plaka kapatın. </li><li> Ortam küçük bir artık miktarı kuyu kalmasını ortamı, aspire. Her çukuruna% 4 tamponlu formaldehid 100 ul ekleyerek hücreleri saptamak ve oda t, 10 dakika boyunca, bir çeker ocak içinde inkübeemperature. </li><li> Plaka aspire sabitleme çözüm çıkarın. Ya da bu noktada, plaka daha sonra 100 ul fosfat tamponlu tuz (PBS) ile üç kez yıkanarak deney durdurma bir haftaya kadar 4 ° C&#39;de karanlıkta 100 ul PBS altında sızdırmaz kılınmış ya da devam depolamak hücre permeabilizasyon. NOT: Biz tespit sonrasında kısa sürede işleme tabak tavsiye ve genellikle tam işlenmiş plakalar depolama tercih. Örneğin timerosal, sodyum azit ya da ticari alternatif olarak biyosidal koruyucu micoroganismal büyümesini önlemek için eklenebilir. Fosfataz inhibitörleri ilave edilmesi, fosfo-epitoplar korumak için yardımcı olur, ve diğer yollarla ilgili deney bağlamlarda yararlı olabilir protein modifikasyonu durumlarını muhafaza </li><li> Plaka PBS çıkarın ve permeabilizasyon çözeltisi 100 ul ekleyerek hücreleri geçirgenliği. Çalkalamadan oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Bir MultiCH kullanarak permeabilizasyon çözüm aspirefrekanslarını pipet. Bu adımı üç kez tekrarlayın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca oyuk başına 100 ul blok çözeltisi eklenerek hücrelerin bloke eder. Daha sonra, oda sıcaklığında karanlıkta 2 saat süre ile blok çözeltisi içinde 500 kat sulandırılmış anti-p-S780 RB1 antikorun 50 ul prob, plaka aspire blok çözeltisini çıkarın. </li><li> 5 dakika her plaka üzerinde bir solüsyon, 100 ul plaka yıkama çözeltisi ile plaka üç kez yıkayın. Kromatin spesifik DNA boyası bisbenzimid 2 uM ile takviye edilmiş blok çözeltisi içinde 50 ul floresan etiketli ikincil antikor seyreltildi 1000 kat ile 4 ° C&#39;de bir gece boyunca karanlıkta plaka kontrol edin. 4 ° C&#39;de karanlıkta 100 ul PBS altında, önce ve mağaza sızdırmaz olarak plaka üç kez yıkayın. Görüntü iki hafta içinde plaka. </li></ol> 2. Görüntüleme ve Görüntü Segmentasyon <ol><li> Ayrı almak için 20X amacı ile bir konfokal veya eğirme disk floresan mikroskop kullanın 16-bit, DNA boya, GFP ve bağışıklık boyama floroforlar karşılık gelen üç kanalda gri tonlama TIFF görüntüleri. Örtüşmeyen görüntü setleri birçok oyuk başına görüntü, çerçeveler gibi burada yaklaşık 1,000-2,000 hücreleri sevk yakalayın. </li><li> Her dosya adı &#39;deney adı&#39;, &#39;iyi adresi&#39;, bu sırada &#39;çerçeve sayısı&#39; ve &#39;kanal tanımlayıcı&#39;, (Şekil 3) eşsiz bir birleşimi olduğunu, böylece sistematik görüntü dosyaları adlandırın. örnek veri seti &quot;Mavi&quot; (kromatin, DNA boyama) ya da &quot;Yeşil&quot; (GFP) ya da &quot;Kırmızı&quot; kanal belirleyicileri olarak (immün lekeli fluorofor) kullanır. kuyu adresi, çerçeve sayısı ve kanal tanımlayıcı ayrıca üzerinde görüntü meta olarak adlandırılır. Kafa karıştırıcı kuyu ve çerçeve meta önlemek için çizgi sembolünü kullanın. </li><li> Belirtilen sırayla bu meta elemanları ile dosyaları adlandırın. Bu sonraki yazılım adımları CORRE sağlamak için gereklianaliz için görüntülerin ctly grup setleri. </li><li> Ücretsiz Hücre Profiler indirin ve yükleyin, Aktif Perl Community Edition, R istatistik programlama ortamı ve RStudio. Kurulum sırasında tüm varsayılan seçenekleri kabul; Aktif Perl yükleme PC kullanıcıları istendiğinde nerede PATH, dosya uzantısı dernek ve komut dosyası eşlemesi ile ilgili tüm seçenekleri etkinleştirmeniz gerekir. Aktif Perl Mac kullanıcıları için isteğe bağlıdır, ama onlar başka türlü Terminal komut satırından adım 3.2 yerine simge tıklayarak kullanarak Perl komut dosyasını çalıştırmak gerekir. </li><li> &#39;Dosyasından&#39; &#39;Dosya&#39; sonra, &#39;İthalat Boru Hattı&#39; tıklayın, Hücre Profiler yazılımı açın ve dosya 3_channels_pipeline.cppipe (Şekil S1A &amp; S1B) seçin. Dosya açıklanan dosya adı kongre görüntü dosyası meta yorumlamak yazılımı için gerekli talimatları içerir. Hücre Profiler artık inci nükleer DNA ve antikor yoğunlukları ayıklar, görüntüleri ilgilidirese ve her hücrenin tespit (Şekil 4 ve 5) sitoplazma yoğunluğu karşı nükleer oranını hesaplamak için GFP kanalını kullanır. </li><li> Hücre Profiler penceresinin sol alt köşesindeki düğme &#39;isimli çıkış ayarlarını tıklayın. Yeni Ekranın üst kısmında &#39;Varsayılan Giriş Dosya&#39; ve &#39;Varsayılan Çıktı Klasörü&#39; etiketli metin kutuları vardır. Bir kerede, bu kutuların sağındaki klasör-simgeleri tıklatın ve (S1C Şekil) sırasıyla ekstre veriler, analiz için görüntü dosyalarının konumunu ve hedefi seçin. </li><li> Hücre Profiler sol alt köşesindeki &#39;Analiz Görüntüler&#39; düğmesine basarak görüntü analizi başlayın. Ekranın alt kısmında veri çıkarma, &#39;Dur Analizi&#39; ve &#39;Pause&#39; düğmeleri için kalan zaman gözlemlemek. Gerekirse yararlı herhangi bir zamanda, en &#39;Pause&#39; düğmesine seçerek analiz duraklatmakGörüntüleri izlerken analiz edilirken (adım 2.8 tarif). </li><li> İsteğe bağlı olarak, program penceresinin (Şekil s1d) sol uç panelde göz simgeleri tıklayarak görüntü analiz herhangi bir aşaması için pencereleri açın. Hücre Profiler geçerli ayarlar görüntü segmentasyonu uygundur gerçekleştirmek (bu ayarlarını değiştirerek tavsiye için Şekil 1 ve Tartışma bakınız) kontrol etmek için &#39;IdentifyPrimaryObjects&#39; penceresini ve &#39;Ortaöğretim&#39; ve &#39;Tersiyer Nesneler&#39; için bu gözlemleyin. </li><li> Analiz tamamlandığında görünen ileti kutusunda &#39;Tamam&#39; ı tıklatın. Sonuçları ile tüm veri dosyaları virgülle ayrılmış değer (.csv) dosyaları (Şekil S2A) olarak kaydedilir yerin &#39;Varsayılan Çıktı Klasörü&#39; gidin. </li></ol> 3. Veri çıkarımı <ol><li> Arasında yer almaktadır yeni bir dosya &#39;Nuclei.csv&#39;, bulHücre Profiler çıkışı. Bu dosya floresan nükleer antikor yoğunluğu, nükleer DNA yoğunluğu ve GFP-CDK2 muhabiri oranı değerleri (Şekil 6A ve S2A) için ayrı ayrı hücre verileri içerir. NOT: Farklı laboratuvarlar kendi testlerin doğasını uygun veri bu tür işlemek isteyeceksiniz. Antikor verileri ve sağlanan Perl betiği &#39;2_gate_classifier.pl&#39; kullanarak GFP-CDK2 muhabiri değerlerine göre her tedavi durumundan hücrelerin yolluk güncel veriler için Önerilen. </li><li> &#39;Nuclei.csv&#39; veri dosyası (Şekil S2A) aynı klasöre verilen Perl komut dosyasını &#39;2_gate_classifier.pl&#39; kopyalayın. Çift tıklatın Perl komut simgesini ve istendiğinde, hücreler antikor nihayet kapı değerleri kapı ve edilecek olan dosya için bir &#39;.csv&#39; dosya adından sonra veri dosyasının tam adını yazınfloresans ve GFP-CDK2 raportör verileri. NOT: esas kapı ayarlarını belirlemek ve verilerin analizi için bu uygulama nasıl Temsilcisi Veri bölümünde ve Şekil 6 aşağıda açıklanmıştır (veri sağlanan kullanım &#39;0.004&#39; ve sırasıyla &#39;1.5&#39;, analiz). Mac kullanıcıları yazarak Terminal komut satırından Perl komut dosyasını çalıştırmak gerekir: &#39;perl 2_gate_classifier.pl&#39;. </li><li> Her kuyudan her hücre hem kapıları (Şekil 6C) karşı nasıl performans gösterir alt-nüfus etiketleri ile orijinal Hücre Profiler verilerinden ham bireysel hücre deneyi değerleri birleştiren yeni oluşturulan dosyayı gözlemleyin. </li><li> RStudio yazılımını açarak bireysel hücre ICSI&#39;nin etiketleri kullanarak her deneysel koşul için veri çizilir. &#39;Dosya&#39; ve &#39;Dosya Aç&#39; ı tıklatın sonra verilen &#39;analysis.r&#39; dosyasını seçin. Şekil 6B çizmek için komutları uyun, <sRStudio (Şekil S2B) sol üst pencerede trong&gt; 7 ve 8. Sol üst pencerede, çizgiler 5 ve 6 çift tırnak sembolleri arasında, Geçitli verileri içeren klasörün bilgisayar adresini yazın. (&quot;: / Analiz klasör / analiz çıkışı C&quot; ve &quot;nuclei_gated.csv&quot; örneğin,) sürücü harfini ve sırasıyla dosyanın kendisi, adını ekleyin. NOT: RStudio belirli bir bilgisayarda ilk kez kullanılıyorsa, R grafik paketi &#39;ggplot2 ilk yüklü olması gerekmektedir. Bu, adım gereksiz hale bundan sonra RStudio yeni bir kurulum için bir kez tek bir adımdır. &#39;Ggplot2&#39; yüklemek için, RStudio sağ alt köşesindeki pencerenin üzerinde &#39;paketler&#39; olarak adlandırılan sekmesini tıklatın Bu altında görünen &#39;Install paketleri&#39; butonuna tıklayın. Yeni bir pencere açılacaktır. &#39;Paketler&#39; ın içine Tipi &#39;ggplot2&#39; (atlayarak alıntılar)Bu yeni pencerede hızı ve nihayet adım 3.6 devam etmek için, pencereyi kapatmak gerekli ggplot2 fonksiyonları yüklemek ve ana RStudio penceresine dönmek için &quot;Install&quot; butonuna tıklayın. </li><li> RStudio sol üst pencerede 17 üzerinden satırları vurgulama 1, daha sonra &#39;Run&#39; düğmesine tıklayın. Bu R (Şekil S2C) deneysel veriler, eşik değerleri ve iyi konum bilgilerini girecek. R şimdi geçici olarak komplo için ilgili verileri yapacak. </li><li> Hat 17 altında kalan kod bireysel blokları vurgulayın ve daha önce olduğu gibi &#39;Çalıştır&#39; düğmesine tıklayarak gelen araziler oluşturmak. RStudio sağ alt köşesindeki pencerede araziler gözlemleyin ve &#39;İhracat&#39; düğmesine (Şekil S2D) tıklatarak biçimlerinin numarasını kaydetmek. </li><li> RStudio kapanış yaparken, istendiğinde &#39;Kaydet etmeyin&#39; tıklayın. Bu aksi takdirde veri yapacak RStudio sonraki kullanımı, karışıklığı önlerBir önceki oturumdan. </li></ol>

<ol><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), 100(2006).</li>
<li>Khan, A., Eldaly, H., Rajpoot, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gamma-gaussian+mixture+model+for+detection+of+mitotic+cells+in+breast+cancer+histopathology+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Inform%22%5BJournal%5D)">A gamma-gaussian mixture model for detection of mitotic cells in breast cancer histopathology images.</a> J Pathol Inform. 4, 11(2013).</li>
<li>Selzer, P., Beibel, M., Gubler, H., Parker, C. N., Gabriel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multivariate+data+analysis+strategies+for+high-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Comparison of multivariate data analysis strategies for high-content screening.</a> J Biomol Screen. 16 (3), 338-347 (2011).</li>
<li>Lyman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content%2C+high-throughput+analysis+of+cell+cycle+perturbations+induced+by+the+HSP90+inhibitor+XL888%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High content, high-throughput analysis of cell cycle perturbations induced by the HSP90 inhibitor XL888.</a> PLoS One. 6 (3), e17692(2011).</li>
<li>Richardson, E., Stockwell, S. R., Li, H., Aherne, W., Cuomo, M. E., Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism-based+screen+establishes+signalling+framework+for+DNA+damage-associated+G1+checkpoint+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mechanism-based screen establishes signalling framework for DNA damage-associated G1 checkpoint response.</a> PLoS One. 7 (2), e17692(2012).</li>
<li>Heynen-Genel, S., Pache, L., Chanda, S. K., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+and+high-content+screening+for+target+discovery+and+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Functional genomic and high-content screening for target discovery and deconvolution.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (10), 955-968 (2012).</li>
<li>Krausz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+siRNA+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">High-content siRNA screening.</a> Mol Biosyst. 3 (4), 232-240 (2007).</li>
<li>Gu, J., Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Cycle-dependent+Regulation+of+a+Human+DNA+Helicase+That+Localizes+in%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Damage+Foci.+Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Cycle-dependent Regulation of a Human DNA Helicase That Localizes in.</a> DNA Damage Foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).</li>
<li>Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pRB+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of pRB phosphorylation.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (1), 21-27 (1998).</li>
<li>Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein--from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein--from bench to bedside.</a> Eur J Cell Biol. 84 (2-3), 97-107 (2005).</li>
<li>Nybo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+imaging+in+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">GFP imaging in fixed cells.</a> BioTechniques. 52 (6), 359-360 (2012).</li>
<li>Schwartz, R. L., Foy, B. D., Phoenix, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchwartz%2C+RL+%22Learning+Perl+-+Making+Easy+Things+Easy+and+Hard+Things+Possible%22">Learning Perl - Making Easy Things Easy and Hard Things Possible</a>. , 6th ed, O'Reilly Media. 1-363 (2011).</li>
<li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWickham%2C+H+%22ggplot2%3A+Elegant+Graphics+for+Data+Analysis%22">ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis</a>. , Springer. New York. 978-970 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok

tarif akışı siRNA, daha sonra etiket algılama kullanarak hücrelerin çukurlu bir perturbance için bir yöntem teşkil eder ve son olarak elde edilen floresan mikroskobu görüntülerinden sayısal verilerin çıkarılmasını kolaylaştırmak için yazılım destekli bir dizi aşama kullanımı. yaklaşım, birçok hücre tabanlı uygulamalarda geniş pratik uygulama vardır tek tek hücrelerin nükleer ve sitoplazmik yoğunluk değerlerinin teslim, odaklanmıştır. Burada kullanılan örnek, veri G1 fazındaki hücre döngüsü geçiş için iki floresan deneyleri test edilmiş ve geri nükleer DNA içeriğinin daha doğrudan bir biyofiziksel ölçüye ilişkili olan bir siRNA ekran ortamda elde edilmiştir. bireysel hücrelerin belirlenmesini sağlar ve ortaya çıkan &#39;Çekirdekler maske&#39; ilgili cytoplasmi tanımlamak için başlangıç ​​noktası olarak hizmet gibi görüntü nükleer DNA&#39;ya bir floresan DNA leke kullanımı, görüntü segmentasyonu sürecinde vazgeçilmez bir adımdırC bölgeleri. Kararlı biçimde hücrelerde ifade edilir GFP etiketli CDK2 raportör, ancak bu bölme tarif edilebilir tarafından sitoplazma içerisinde arka plan sinyali sürekli olarak daha yüksek bir değişken verir. Aynı analiz boru hattı için diğer uygun floresan bağlanmış habercilerin ve perturbance tepkilerini kullanılarak protein translokasyon olayların analizi için geçerli olmalıdır. Ayrıca, sitoplazma özel floresan boyalar ile GFP-CDK2 muhabiri ikame bu algoritmanın alternatif kullanım sitoplazmasında boyutlarını ve görüntüleri hücrelerin göreceli boyutlarını ölçmek için izin verecek. Burada anlatılan görüntü segmentasyonu stratejisi başka tasarım dikkate DNA ölçümü için entegre yoğunluk değerlerini sunmak için Hücre Profiler kullanılmasıdır. Yoğunluk Entegrasyon boyama verileri nukleus boyutunda olası varyasyonlar için izin nükleer DNA için değerleri ve görülen miktar profilleri için yakın bir maç temsiliçin, propidyum iyodür lekeli FACS verileri. Bununla birlikte, Entegre edilen yoğunluk, antijen floresans ortalama yoğunluğu ile örneklenen ortalama konsantrasyon, daha fazla biyolojik olarak, bir hücre bölmesi içinde protein (ve ilgili floresan) entegre toplam miktarına göre uygun olduğu proteinin fonksiyonunu değerlendirmek için uygun bir araç sağlar olmayabilir. Bu nedenle yoğunluk değerleri P-S780 RB1 ve GFP verileri kullanılmıştır anlamına gelir. seçeneği Hücre Profiler yazılımı &#39;ExportToSpreadsheet&#39; panelinde bulunan iki mod (ortalama veya entegre) veri değerlendirme arasında değiştirmek için. 3_channels_pipeline.cppipe dosyasındaki analiz ayarları örnek veri setinde görüntüler için optimize edilmiştir. Bu protokol ile yeni görüntüler setleri analizi dosya adları adlandırma kuralı yukarıda (Şekil 3) tarif kabul gerektirecektir. Ayrıca, duyarlılık arka nükleer DNA boyama ve eşik parlaklığını uygun değerleriYeni görüntü setleri şiddetler Hücre Profiler ayarları içinde ayarlanması gerekebilir. DNA boyama çeşitli görüntü segmentasyonu maskeleri oluşturmak için geçerlidir kilit rolü göz önüne alındığında, bu kanal için doğru hassasiyet ayarları uygulama Hücre Profiler yazılımı ile yeni görüntü verilerinin analizine başarılı anahtarıdır. sağlanan Hücre Profiler ayarları dosyası (3_channels_pipeline.cppipe) yeni verilere analizi uyarlanması için en sık yararlı parametreler üzerine notlar içermektedir. Bu notlar Hücre Profiler ana penceresinde ekranın üst kısmındaki metin kutusuna ve hassasiyet ayarlarını değiştirme ve kanal sayısı analiz edilecek ayarlama konusunda rehberlik dahildir. Yeni görüntü verileri ayarlarını test etmek Protokol bölümünde 2.8, olarak suçlanan gibi (Şekil s1d &#39;... belirleyin Nesneler&#39; her biri için &#39;göz&#39; simgeleri açık tıklayarak protokol adımlarını görüntü analizi sırasında görüntü segmentasyonu gözlemlemek için gerekli olabilir </strong&gt;). Çekirdekler maske doğru bir DNA boyama görüntülerden tespit edilirse, özellikle, &#39;IdentifyPrimaryOjects&#39; üzerinden görüntü veri görselleştirme gösterir. &#39;IdentifyPrimaryOjects&#39; modülü için Hücre Profiler yazılımı sayfasında eşik düzeltme faktörüdür. Bu değerin Deneme ve hata düzeltmesi en nükleer tanıma hataları düzeltmek olacaktır. değerleri her görüntü için arka plan yoğunluğu karşı DNA kanalı denge. Eşik düzeltme faktörü değerleri bu daha büyük daha (net görüntüler için iyi) sıkı ve az 1 hoşgörülü (boyama ve arka plan arasındaki kontrast daha az olan görüntülere uygun) olduğunu 1, etrafında menteşe. Hücre Profiler bireysel hücre veri ham çıktı, diğer çalışmaların ihtiyaçlarını karşılamak için çeşitli şekillerde analiz edilebilir. Burada gösterilen veriler biyolojik eğilimleri ayıklanması yardımcı olmak amacıyla hücre başına ölçülen parametrelerin iki kapılarını uygulamak için bir Perl script kullanımıEk ölçümlerle belirlenen alt popülasyonlar d izni çapraz referans. O Hücre Profiler çerçevesinde yolluk unsurları içerir eşit mümkün olsa da, burada kullanılan alternatif rota büyük veri setleri değerlendirilmesi gerekir, özellikle eğer, daha fazla esneklik ve hız sağlar. Mevcut protokol sonrası görüntü elde etme aşamalarında yavaş sahne Hücre Profiler yazılımı çalışan olduğunu. Gerekirse Hücre profil burada farklı kapı değerleri ile iteratif, daha hızlı sonraki Perl script ile tekrar analiz edilebilir bir un-kapılı ham veri seti üretmek için kapıları empoze olmadan çalıştırmak ve. Tüm çalışmalar bu gibi uygun kapı değerleri potansiyel zamanla herhangi bir veri kümesi verilen üzerinde reaktif ile değişebilir önceden bilecek. Dolayısıyla, uygun bir kapı valu belirlemek için pozitif bir kontrol ve sahte tedirgin hücreleri için hücre Profiler elde edilen ham veri dağılımı gösteren histogramlar oluşturmak için önerilirilgi parametrelerinin es. Perl script Hücre Profiler veri değişmez bir sütun yapısını kabul yazılır ve bir kullanıcı &#39;ExportToSpreadsheet&#39; ayarlarını kullanarak Hücre Profiler ile parametreler çıkış sayısını değiştirir eğer durmasına olabilir. Notlar Perl komut dosyaları içinde yer alan ayarları değişiklik uygulamak yardımcı olmak. Bu bir metin editörü komut görüntülemek görmek için, tercihen bir programcı metin editörü (örneğin, http://www.activestate.com/komodo-edit) renk kodu Perl elemanları ayarlanır. Veri formatında değişikliklere uyum için komut dosyası ayarlamak için nereye Bu notlar gösterir. Perl script benzer, görüntü analiz verilerinden rakamlar komplo için talimatlar içeren sağlanan Ar-kod dosyası (analysis.r), kullanım ve adaptasyon ek notlar görmek için bir metin editörü veya RStudio yazılımında okunabilir. Bu notlar düzenli ifadeler ve Perl &lt;ayrıntıları ile takviye edilebilirsup&gt; 12 ve veri okuma açıklamalı ve sırasıyla, çizilen nasıl temelini oluşturan her ikisi de R için ggplot2 13 paket. Floresan mikroskobu kullanarak yeni çalışmalar yanı sıra açık kaynak yayınlar tevdi ham veriler, burada tarif edilen analiz yöntemleri ile tedavi edilebilir. yüksek içerik verilerinin doğası herhangi bir gözlemci araştırma çıkarlarına bağlı olarak farklı analitik vurguları ile özyinelemeli analiz için oldukça rahat. Veri istenebilir sorular başlangıçta kullanılan prob ile sınırlı olmasına rağmen, görüntü verileri genellikle anlamlı onları üretilen çalışmaların kapsamı dışında tekrar analiz edilebilir.

Burada sunulan çalışma tek tek hücreler ve belirlenen hücre içi bölgeleri belirlemek için yapışık hücreler floresan mikroskop görüntüleri algoritma güdümlü dökümü yapmak için serbestçe ulaşılabilen yazılımın Celi Profiler kullanımını tarif eder. Bölütlemesi olarak adlandırılır bu yaklaşım, her bir hücre ya da (haliyle bölümlere ayrılmış nesneler adlandırılır) hücre içi bölgesinde lokalize floresan işaretli belirteçleri miktarının tarafından görüntüsü hücrelerin daha sonra çok parametre analizi sağlar. Bu iş akışı, yüksek içerik analizi sağlamak için bir temel oluşturur ve daha gelişmiş ve çok parametrik uyacak şekilde modifiye, bireysel hücre özel yüksek-içerik araçların veya tescilli yazılım erişimi olmayan laboratuvarlarda analizleri edilebilir bir araç olarak hizmet etmek amaçlanmıştır. Bu yazının birlikte verilen dosyalar açıklanan analiz oluşturmak için ilgili ham görüntü verileri, algoritma ayarları ve destekleyici komut bir deney seti bulunmaktadır. verilen algoritma ayarları fveya Hücre Profiler ayarlamak örnek veriler ve ayarlar diğer çalışmalardan görüntü verilerinin kullanılmasını sağlamak için gerekli olabilir ne Tartışma bölümünde detayları için optimize edilmiştir. Nicel veri Hücre Profiler kullanarak ekstre edildikten sonra, farklı laboratuvarlar ham veri bireysel hücre değerleri tarafından sunulan bilgilerin nasıl kullanılacağı için farklı gereksinimleri olabileceğini; Burada gösterilen girişler her bir deney için ham verilere uygulanan geldiği bir yaklaşımdır. Bu kapıları kullanarak, veri kapıları tarafından tanımlanan yanıtı geçiren hücrelerin alt popülasyonlar farklı tedaviler bağlayan eğilimlerin görselleştirme izin yanıt ikili açısından dönüşür. kapıları ilgili her ölçüm için uygun negatif ve pozitif kontroller için elde edilen verilerin dağılımlarının gözlemlerine dayalı ayarlanır. kapıları kullanımı, ham, hücre bazlı ölçümler yönetmek için nasıl sadece bir örnektir. Ayrıca burada gösterilen nükleer DNA yoğunluğu kullanımı benikapılı veriler ile bir arada değerleri sürekli bir dizi olarak, ham formunda asurements. Görüntü analiz verileri yönetmek Diğer yaklaşımlar çalışmanın niteliğine bağlı olarak, dikkate alınmalıdır; alt popülasyonlar hücreleri atanması için kapılarını kullanarak istatistiksel alternatifler parametrelerin çok sayıda 3 bildirilmiştir genelinde yüksek içerik verileri özetlemek için stratejiler 2 ve sistematik karşılaştırmalar bildirilmiştir. 6 - Görüntü verilerinin yüksek içerik analizleri ilaç yanıtının hücresel çalışmalarda kullanılmasını bulduk, genetik ve çevresel stres sinyalizasyon 4 ters. yüksek içerik analizi hak floresan mikroskop verilerinin analizi algoritmik nicel ve mekansal parametreler tek tek hücrelerin 7 genelinde eş zamanlı olarak dikkate alınması izin vermesinden kaynaklanıyor. Bu şekilde, birçok tahlil için hücresel sonuçları analiz: d çapraz referans diferansiyel davranış olabilirefined hücre alt popülasyonlar morfolojik değişkenlerin dikkate içerebilir deneysel koşullar ve tahlillerde izlenebilir. stratejileri ve analiz iş akışı diğer yüksek-içerik yaklaşımlar gibi, bireysel hücrelere çapraz başvurulan çoğaltılmış veri sunma yeteneğine sahiptir, burada ele. Floresan mikroskop görüntüleri oluşturmak ve binlerce görüntü kadar düşük kapasiteli geleneksel floresan tabanlı mikroskopi üretilen görüntülerin onlarca arasında değişen verilerin analizi için geçerli olan Yüksek içerik yöntemleri takım çalışmalar otomatik yüksek içerik tarama platformları kullanarak üretti. akışı ayrı deneyler nükleer floresan markörü şiddet ya da sırasıyla, bir flüoresan raportör proteininin çekirdek / sitoplazmik translokasyon ya bakımından ölçüldüğü, örnek veri ile burada gösterilmiştir. iş akışı, bu deneyler, ayrı ayrı olarak ya da kombinasyon halinde EAC bağlı olması ile esnekh farklı araştırmacılar tarafından araştırma sorusunu verilen. örnek, veri RNA interferans (RNAi), deney (Şekil 1) bir parçası olarak üretilmektedir. Susturucu RNA oligonükleotidleri (siRNA), sikline bağımlı kinaz (CDK) aktivitesinin iki floresan haberci için değişikliklere neden HCT116 insan kolorektal karsinom hücrelerinde spesifik proteinlerin demonte etmek için kullanılır. Serin nükleer retinoblastoma 780 (p-S780 RB1) olarak CDK6-bağımlı fosfatlamanın antikor lekelemesi yoluyla değerlendirilir. Aynı hücrelerde, CDK2 aktivitesi (GFP CDK2 raportör) yeşil floresan protein etiketli raportör CDK2 etkinliğinin olmaması raportör çekirdekten sitoplazmaya ve CDK2 aktivasyon servisleri üzerinde bulunan sitoplazmik oranı nükleer değerlendirilir 8. Buna ek olarak, her bir hücrenin nükleer DNA, bir DNA-ara boya kullanılarak lekelenmektedir, görüntüler çekirdek sınırları hücreleri belirlenmesi ve tanımlanması için bir araç olarak hizmet eder bisbenzimid, hem de birDNA, bolluk hücrenin hücre döngüsü durumuyla ilgili bilgileri sağlayan (Şekil 2) sa ölçer. CDK6 ve CDK2 faaliyetleri hücre döngüsünün 5 S fazına G1 hücre geçiş tespit edilebilir ve bu, tek tek hücrelerin iki muhabir arasında yakın bir uyum beklendiği gibi, birbirine 9,10 başarılı ve. Burada kullanılan gösterim veri kümesi siRNA etkisi CDK6, retinoblastom proteini (RB1) ve bir hedefleme negatif kontrol (Tablo 1) hedef bir örnek olarak analiz eder. CDK6 demonte p-S780 RB1 epitopunun bir azalmaya ve hücre döngüsünün G1 fazında hücrelerin birikmesi hem ortaya çıkarmak gerekir. RB1 Knockdown fosfo-S780 antikorunun özgünlük için bir reaktif kontrolü olarak hizmet vermektedir. Formalin floresan mikroskop görüntüleri floresan lekeli HCT116 doku kültürü hücreleri, algoritmik görüntü analizi için kullanılan, 11 sabit. Elde edilen sayısal veriler için kullanılançapraz-referans muhabirleri ve farklı demonte devletlerin etkisini ölçmek. Bu tür bir analiz tarafından üretilen verilerin potansiyel büyüklüğü normal analiz araçları bir meydan okuma sunabilir. Örneğin, bireysel hücre veri bazı elektronik tablo yazılımı karşılayacak daha büyük olabilir. Büyük veri setleri analizi yardımcı veri basit, yüksek tekrarlayıcı, denetimli işleme gerçekleştirmek Perl scriptleri dahildir. Perl script Belirli bir dosya adlandırma kuralı (Şekil 3) ile görüntü dosyalarını işlerken Hücre Profiler tarafından üretilen çıktı dosyaları için özel olarak yazılmış, ve analiz kullanılmak üzere kuyu başına alanların değişken numaralar için izin verir. Bu hücre alt 5 trendleri izlemek için kapı bireysel hücre deneyi verilerine sık önemlidir ve burada gösterilen her tahlil türü için önceden belirlenmiş bir dizi kapısı dayalı her hücre bayrak bir Perl script kullanımıdır. Da dahil isteğe Perl komut vardırhangi bireysel kuyuların (veya koşullar) veri sonuçlarını özetlemek, teslim: set kapısı içindeki hücrelerin ve ham tahlil puanları ortalama değerlerin yüzdesi. yanıtları tamamını veya bir kuyu içindeki hücrelerin çoğunluğunu etkileyen durumlarda veri görüntüleme ikinci, daha homojen şekilde geçerlidir. Yukarıda ele alındığı gibi, bu gibi değerlendirme yanıt olarak bir popülasyon içindeki hücrelerinin bir alt kümesi ile sınırlı tek tek hücre veri gating ile elde daha az kullanışlıdır. açıklanan iş akışı programı siRNA veya tarif işaretleyici deneyleri ile pertürbasyondan sınırlı değildir. Çalışmalar siRNA kombinasyonu, kimyasal inhibitörleri ve radyasyon tedavisi ile doku kültürü deneyleri ve CDK6 dışındaki belirteçler ve CDK2 aktivitesi 5 değerlendirilmesi için yanıtları analiz etmek için, bu yaklaşımı kullanmışlardır. Kavramsal olarak, deneysel strateji biyolojik kullanışlı hücre içi bölgelerde çeşitli otomatik kayıt sağlarfloresan mikroskop görüntüleri mevcut olan tek tek hücrelerde. Gibi, bu yaklaşım nüfus ziyade bireysel hücreler üzerinde odaklanmak teknikleri ile atlanabilir nicel, çoğaltılmış veri ortaya biyolojik bilgiyi elde edebilirsiniz. Küçük modifikasyonlar ile tarif edilen bir yaklaşım ve analiz akışı bir floresans bazlı deney çıkışları ve hücre-biyolojik yanıtlar, kantitatif, tek tek hücre veriler sağlayabilir burada DNA içeriğinin nicel değerlendirme, çekirdek ya da sitoplazmik floresan ölçümü ya da bunların arasındaki belirteçlerin mekik İki bölme, ya tek tek ya da bir çok katlı bir şekilde ilgi çekmektedir. Yayınlama gereksinimleri artan bir şekilde yayınlanmış verileri yeniden analiz isteyen laboratuvarlar da doğrudan ilgilendiren olacak burada anlatılanlar gibi açıkça erişilebilir ham verilere erişimi ve mikroskopi görüntü analizi için ücretsiz araçlarımızdan ile aşinalık sunulması doğru eğilimi gibi.

<table><tbody><tr><td>AllStars negatif kontrol siRNA</td><td>Qiagen</td><td>1027280</td><td>Negatif kontrol siRNA.</td></tr><tr><td>CDK6 siRNA</td><td>Dharmacon/ Özel sentez</td><td>NA</td><td>Antisens dizisi: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUU</td></tr><tr><td>RB1 siRNA</td><td>Dharmacon/ Özel sentez</td><td>NA</td><td>Antisens dizisi: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT</td></tr><tr><td>5x siRNA tamponu</td><td>Thermo Scientific</td><td>B-002000-UB-100</td><td>Nükleaz içermeyen, DEPC ile arıtılmamış su ile seyreltilmelidir.</td></tr><tr><td>Kesintisiz su (DEPC olmayan)</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM9937</td><td>siRNA tamponunun seyreltilmesi için.</td></tr><tr><td>Hiperfect</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td>Transfeksiyon lipid.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>41966052</td><td>Piruvat ve yüksek glukoz takviyeli doku kültürü ortamıdır.</td></tr><tr><td>Transfeksiyon komplekslerinin paralel, bölümlere ayrılmış karışımı için 96 kuyulu doku kültürü plakası Falcon 3072 Düz, 96 kuyulu doku kültürü plakası.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Packard Viewplate</td><td>Perkin Elmer LAS</td><td>6005182</td><td>Hücrelerin transfekte edildiği, büyütüldüğü, sabitlendiği ve sonunda görüntülendiği optik tabanlı 96 kuyulu TC plakası. Kullanılmış plakaların depolanması sırasında kullanılan opak, yapışkan plaka contaları ile birlikte verilir.</td></tr><tr><td>Nefes alabilen membran</td><td>Alpha Labs</td><td>LW2783</td><td>Steril, gaz geçirgen, yapışkan membran.</td></tr><tr><td>Nötr tamponlu formalin,% 10</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5012-1CS</td>% <td>10 Formalin (% 4 formaldehit) fiksatif protokolde saf olarak kullanılır.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100PC</td><td>İyonik olmayan deterjan</td></tr><tr><td colspan="4">[başlık]</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Trizma bazı (tris (hidroksimetil) aminometan)</td></tr> <tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Plaka yıkama çözeltisi için.</td></tr><tr><td>Anti-P-S780 RB1 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab32513</td><td>Tavşan monoklonal</td></tr><tr><td>AlexaFluor647 Anti-tavşan</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>Yüksek çapraz adsorbe edilmiş, floresan etiketli ikincil antikor.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (Bisbenzimid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Floresan, kromatin birleştirici, DNA boyası.</td></tr><tr><td>Geçirgenleştirme çözeltisi</td><td>NA</td><td>NA</td><td>% 0.1 Triton X-100, 50 mM Tris tamponlu salin, pH 8.0 içinde.</td></tr><tr><td>%</td><td></td><td>0.1 Tween-20 içeren plaka yıkama çözeltisi NA NA Tris tamponlu salin.</td><td></td></tr><tr><td>Blok çözelti</td><td>NA</td><td>NA</td><td>%5 Tris tamponlu tuzlu su içinde süt tozu ve %0.1 Tween-20. İmmüno-boyama ve antikorların seyreltilmesinden önce plakayı bloke etmek için.</td></tr><tr><td>Cell Profiler 2.1</td><td>Broad Institute</td><td></td><td>http://www.cellprofiler.org/download.shtml</td></tr><tr><td>Active Perl Community</td><td>Edition ActiveState</td><td></td><td>http://www.activestate.com/activeperl/downloads</td></tr><tr><td>R programlama ortamı</td><td>The R Foundation</td><td></td><td>http://www.r-project.org</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>Rstudio</td><td></td><td>http://www.rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

yüksek içerik, open source software tarafından desteklenen evrensel mikroskop verilerden floresan göstergeler, bireysel hücre niceleme için iş akışı

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Yapışık memeli doku kültürü modelleri hücrelerin davranışını yöneten kontrol mekanizmalarının anlaşılması gelişmeler tek hücreli analizi modları giderek daha bağımlı hale gelmektedir. Hücre popülasyonlarının gelen biyomarkerların ortalama değerleri yansıtan kompozit verileri teslim Yöntemleri çalışılan biyolojik sistemin heterojen yansıtan ICSI&#39;nin dinamiklerini kaybetme riski. Bu doğrultuda, geleneksel yaklaşımlar yerini ediliyor, ya da yüksek içerik mikroskobu ile değerlendirmesini sağlamak için geliştirilmiştir hücresel tahlil, daha karmaşık formlar ile destekledi. Bu deneyler potansiyel özel yazılım paketleri eşlik tarafından etkin floresan belirteçler, görüntüleri çok sayıda oluşturmak hücre başına çok parametrik ölçümler için izin verir. Bununla birlikte, nispeten yüksek yatırım maliyetleri ve bu cihazların çoğunun aşırı uzmanlaşma birçok araştırmacı için erişilebilir önlemiştir. Burada tarif a,floresan mikroskobu görüntüleri ile kullanım için uygun olan tek tek hücrelerin özel hücre içi bölgelerde birden fazla floresan markör yoğunluklarının ölçülmesi için evrensel olarak geçerli bir iş akışı. Bu iş akışı Key floresan işaretleyici yoğunluğunu bu görüntüler tek tek hücrelerin, hücre içi tanımlanan bölgelere bölüm ayırt ve teslim serbestçe kullanılabilir Hücre Profiler yazılımı 1 uygulanması bu bölgelere özgü değerler olduğunu. görüntü verileri tek tek hücre yoğunluğu değerlerinin ekstraksiyon bu iş akışının merkezi amacı ve yapışık insan hücrelerinde G1 kontrol noktası düzenleyiciler için bir siRNA ekranından kontrol verilerinin analizi ile izah edilecektir. Bununla birlikte, burada sunulan akışı hücre pertürbasyon diğer araçlarla sağlanan verilerin analizi uygulanabilir (örneğin, bileşik, ekranlar) bu ve floresan bazlı hücresel belirteçlerinin diğer formları ve laboratuarlar arasında geniş bir aralığı için yararlı olacaktır.

Floresan işaretli hücrelerin çoğaltılmış görüntü tabanlı analiz sağlayan esnek bir bilişim iş akışı sundu. iş akışı nükleer ve sitoplazmik belirteçleri rakamlarla ve bu bölmeleri arasındaki işaretleyici translokasyonu hesaplar. Prosedürler 96 oyuklu formatta indirek immunofloresan ile işaret tespiti için siRNA ve güvenilir bir yöntem kullanarak hücrelerin pertürbasyon verilmiştir.

Yüksek içerik, Open Source Software tarafından desteklenen Evrensel Mikroskop Verilerden Floresan Göstergeler, Bireysel Hücre Niceleme için iş akışı

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Bu prosedürün genel amacı, mikroskop görüntülerinden belirli floresan işaretleyici yoğunluklarını ölçerek tek tek hücrelerin tepkilerini objektif olarak ölçmektir. Bu, önce yapışık bir doku kültürü hücrelerinin irna aracılı gen yıkımına tabi tutulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, hücreler floresan olarak boyanır ve daha sonra ilgilenilen birkaç belirteç için görüntülenir.Son adımda, belirli hücre altı bölgeler içindeki belirteçlerin ifadesi algoritmik olarak tanımlanır, tek tek hücrelerdir. Sonuç olarak, gen yıkımından kaynaklanan biyolojik ipuçlarına hücresel tepkiler, ilgilenilen belirteçlerin floresan ekspresyon seviyeleri ve bunların hücre altı Translokasyonları ölçülerek analiz edilebilir. Bu prosedür, siRNA'lara yanıt olarak G bir hücre döngüsü geçişinin düzenlenmesi hakkında bilgi sağlasa da.Floresan hücre görüntüleri üreten, nükleer taşınım ve protein homeostazını inceleyen çalışmalara da uygulanabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan Daniel Wek ve Car K HO doktora sonrası arkadaşlar olacak 70 mikrolitre 200 nanomolar irna dağıtarak başlayın, steril bir doku kültürü davlumbazında steril 96 oyuklu bir plakanın uygun kuyucuklarına seyreltilmiş bir irna tamponu. Daha sonra, 40 hacim serum serbest DMEM ortamında seyreltilmiş 105 mikrolitre transfeksiyon lipidini, oda sıcaklığının hafif titreşimi ile plakayı karıştırın ve daha sonra 10 dakika sonra, elde edilen 175 mikrolitreyi, şeffaf bir tabana sahip opak bir doku kültürü ile muamele edilmiş 96 oyuklu plakaya hedef başına üç 50 mikrolitre kopyaya bölün.Daha sonra,% 10 serum ile 150 mikrolitre DMEM'de kuyu başına 8.000 hücreyi karıştırmadan doğrudan 50 mikrolitre lipid irna komplekslerine dağıtın. Daha sonra plakayı steril bir yapışkan, nefes alabilen membran ile kapatın ve plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. 48 saat sonra medyayı plakalardan aspire edin.Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında bir davlumbazda 100 mikrolitre% 4 tampon formaldehit içine sabitleyin 10 dakika sonra, fiksatifi aspire edin ve son yıkamadan sonra PBS ile üç adet 100 mikrolitrelik yıkama yapın. PBS'yi çıkarın ve hücreleri, her biri 10 dakikalık 100 mikrolitrelik perme solüsyonu inkübasyonlarından oluşan üç döngü ile çalkalamadan oda sıcaklığında delin. Son inkübasyondan sonra, geçirgenlik çözeltisini çıkarın ve ardından oda sıcaklığında 30 dakika boyunca oyuk başına 100 mikrolitre blok çözeltisi ekleyin.Daha sonra blok çözeltiyi aspire edin ve hücreleri, DNA boyası GFP'ye karşılık gelen üç kanalda ayrı 16 bit gri ölçekli TIFF görüntüleri almak için 20 x objektifli uc konfokal mikroskobu etiketlemekten sonraki iki hafta içinde ilgilenilen birincil antikorun 50 mikrolitresi ile araştırın ve immüno boyama. Flora fours, kuyu başına yaklaşık 1000 ila 2000 hücreyi görüntülemek için örtüşmeyen birçok görüntü seti veya çerçeve yakalar. Görüntü dosyasını meta veri bilgileriyle sistematik olarak adlandırma, böylece her dosya adı deney adı, kuyu adresi, çerçeve numarası ve kanal tanımlayıcısının benzersiz bir kombinasyonu olur.Ardından hücre profilleyici yazılımını açın ve dosyala ve işlem hattını içe aktar'a tıklayın. Ardından, dosyadan altında, yazılımın kaydedilen dosya adından görüntü dosyası meta verilerini yorumlaması için gerekli talimatları içeren üç kanallı boru hattı CP boru dosyasını seçin Convention Cell Profiler artık görüntüleri ilişkilendirmek, dosyalardan nükleer DNA ve antikor yoğunluklarını çıkarmak ve nükleer ve sitoplazma yoğunluğunun oranını hesaplamak için GFP kanalını kullanmak için kullanılabilir. Algılanan her hücre için, çıktı ayarlarını görüntüle düğmesine tıklayın ve ardından varsayılan giriş ve varsayılan çıkış klasörlerine tıklayın.Sırasıyla analiz için görüntü dosyalarının konumunu ve çıkarılan veriler için hedefi seçme. Ardından analiz modülleri penceresinde, analiz sırasında birincil nesneleri ve üçüncül nesneleri tanımla pencerelerini gözlemlemek için uygun göz simgelerine tıklayın ve analiz tamamlandığında görüntüleri analiz et'e tıklayın. Mesaj kutusunda Tamam'a tıklayın ve tüm veri dosyalarının virgülle ayrılmış değer dosyaları olarak kaydedildiği varsayılan çıktı klasörü Konumuna gidin.Veri çıkarma işlemini gerçekleştirmek için, floresan nükleer antikor yoğunluğu, nükleer DNA yoğunluğu ve GFP CDK iki raportör oranı değerleri için ayrı hücre verilerini içeren hücre profilleyicinin çıktısı arasında yer alan yeni çekirdek CSV dosyasını bulun. Sağlanan darbe komut dosyası dosyasını, yürüyüş sınıflandırıcı PL'ye çekirdek CSV veri dosyasıyla aynı klasöre kopyalayın. Ardından Pearl Script simgesine çift tıklayın.Ve istendiğinde, veri dosyasının tam adını ve ardından hücrelerin kapılanacağı dosya için bir DOT CSV dosya adını ve antikor floresansı ve G FP CDK iki raportör verisi için kapı değerlerini yazın. Yeni oluşturulan dosyanın, verilerin orijinal hücre profilinden alınan ham bireysel hücre tahlil değerlerini, her bir kuyucuktaki her hücrenin her iki kapıya karşı nasıl performans gösterdiğini gösteren alt popülasyon etiketleriyle birleştirdiğini onaylayın. Şimdi, dosya ve dosya aç'a tıklayarak ve ardından sağlanan analiz nokta r dosyasını seçerek tek tek hücre alt popülasyon etiketlerini kullanarak her deneysel koşul için verileri çizmek üzere R Studio yazılımını açın.Sürücü harfi ve dosyanın adı da dahil olmak üzere, geçitli verileri içeren klasörün bilgisayar adresini yazın. Ardından, stüdyomuzun sol üst penceresinde birden 17'ye kadar olan çizgileri vurgulayın ve deneysel veri eşik değerlerini ve kuyu konumu ayrıntılarını girmek için çalıştır düğmesine tıklayın. Son olarak, 17. satırın altında kalan kodun tek tek bloklarını vurgulayın ve ilgili grafikleri oluşturmak için çalıştır düğmesine tıklayın.Stüdyomuzun sağ alt köşesindeki pencerede çizimleri gözlemleyin ve ardından bunları çeşitli formatlarda kaydetmek için dışa aktar düğmesine tıklayın. Burada açıklanan iş akışı, tanımlanan her hücreyi ve karşılık gelen tahlil değerlerini detaylandıran bir liste biçiminde ham veriler üretmek için floresan mikroskop görüntülerini analiz eder. Bu verilerin analizi için birçok seçenek mevcuttur.Örneğin, bu histogram grafiklerinde, kontrol RNA'ları ile muamele edilen hücreler için tahlil değerleri, her bir tahlili eşiklemek için uygun kapıların tanımlanmasını sağlar. Geçit eşikleri daha sonra ham verilerdeki her hücreyi tahlil sonucuna göre etiketlemek için bir darbe komut dosyası kullanılarak uygulanır. Bu etiketleme yaklaşımı, tedaviler arasındaki ilişkilerin ön görselinin yanı sıra otomatik olarak değerlendirilmesine ve çok büyük bireysel hücre veri kümelerinin bile alt popülasyon dağılımına yardımcı olur.Örneğin, bu temsili deneyde, üçlü irna nakavt koşulları, hücrelerin kapılara göre zıt dağılımlarıyla sonuçlandı, iki tahlildir. R grafikleri, her kadrandaki hücrelerin yüzde dağılımlarını hesaplamak için etiketleri kullanır. Etiketler ayrıca ek floresan ölçümlerinin tahlil verileriyle çapraz referanslanmasını sağlar.Bu deneyde, SI CDK altı ile muamele edilen hücrelerin alt popülasyonları, ilgili tahlil etiketlerine göre gruplandırıldı ve nükleer DNA boyama histogramları olarak çizildi. Hücre veri etiketlerinin bu kullanımı, iki hücre tahlili ile hücrelerdeki DNA içeriği arasındaki ilişkiyi ortaya koymaktadır. Bu prosedürü gerçekleştirirken, hücre profilleyici kullanırken görüntü segmentasyon parametrelerini test etmeyi ve ayarlamayı unutmamak her zaman önemlidir.Bu, özellikle yeni veya test edilmemiş görüntü dosyalarını ilk kez kullanırken önemlidir. Tamam.

workflow-for-high-content-individual-cell-quantification-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu görüntülenmiştir deney canlı konfokal görüntüleme deneyleri için HIV floresan moleküler klon kullanan için bir rehber.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

Otofaji hücreler protein ve organellerin aşağılamak ve geri dönüşüm sağlayan her yerde bulunan bir süreçtir. Biz görselleştirmek ve küçük ölçmek için gelişmiş floresan mikroskop geçerli, ama autolysosomes içine oluşumu ve autophagosomes ve lizozomlar dağılımı, ve füzyon da dahil olmak üzere otofaji indüksiyon ile ilgili temel, fiziksel değişiklikler,.

Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Burada hızla PhenoRipper, son zamanlarda geliştirilmiş görüntü analiz platformu kullanarak floresan mikroskopi görüntülerin koleksiyonları analiz ve keşfetmek için bir iş akışını açıklar.

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Biz Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı readouts kullanarak protein etkileşimleri tahlil için otomatik floresans ömrü görüntüleme (Flim) kullanan açık kaynak kodlu bir yüksek içerik analizi (HCA) aleti sunuyoruz. Bu openFLIM-HCA cihaz için veri toplama yazılımı μManager yazılır ve veri analizi FLIMfit üstlenilmiştir tarafından kontrol edilir.

Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

Değişikliklere tepki olarak heterosellüler popülasyon dinamiklerini incelemek için yeni bir protokol geliştirdik. Bu el yazması heterosellüler popülasyonların çoklu hücresel fenotiplerinin aynı anda karakterize edilmesi için nicel veri kümeleri üreten görüntü tabanlı bir platformu açıklamaktadır.

Kantitatif Görüntüleme Teknikleri Kullanılarak Heterosellüler Popülasyonların Ayrımcılaştırılması ve Karakterizasyonu

Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

Burada bir widefield yüksek-içerik analizi sistemi (WHCAS) kullanarak slaytlarda fluorescently etiketli dokuların otomatik bölümleme için bir protokol açıklayın. Bu iletişim kuralının Nefelometri biyolojik bilimler, tıbbi mühendislik ve Sağlık Bilimleri de dahil olmak üzere biyolojik dokularda floresan işaretleri içeren herhangi bir alanda geniş kapsamlı uygulamalar vardır.

Otomatik slayt tarama ve segmentasyon Fluorescently etiketli dokularda Widefield yüksek-içeriği analiz sistemi kullanılarak

Hayati floresan boyalar modern mantar hücre biyolojisinde canlı hücre görüntüleme analizleri için gerekli araçlardır. Bu yazıda, filamentöz mantarlarda plazma membran dinamiği, endo-/eksositoz ve hücre duvarı morfogenezinin izlenmesi için kurulmuş ve daha az bilinen floresan boyaların uygulanması ayrıntılı olarak anlatılır.

Filamentöz Mantarların Canlı Hücre Görüntülemesi İçin Membran ve Hücre Duvarı Seçici Floresan Boyaların Uygulanması

Bu makalede, bir dizi hücre yoğunluğunda doğrulanmış açık kaynaklı bir yürütülebilir program kullanarak görüntü tabanlı çekirdek nicelemeyi otomatikleştirmek için adım adım yöntemler açıklanmaktadır. Bu program, maliyetle ilgili engelleri, sınırlı teknolojik becerilere sahip kullanıcılar için erişilebilirliği ve mevcut teknolojilerin kullanımını sınırlayabilecek uygulamaya özel doğrulamayı ele alan bir alternatif sunar.

Çekirdek Miktarını Kolaylaştırmak için Bilgisayarla Görme Kitaplıklarını Kullanma

Bu makale, bir roman protokol ve reaktif bileşikler ve tedavilerin yüksek içerik analizi kullanarak nöronlar ve astrositler ortak kültürleri üzerinde nörotoksik etkileri hassas ölçümü için tasarlanmıştır ayarlamak açıklamaktadır. Sonuçlar yüksek bir içerik analizi nörotoksisite değerlendirmesi için heyecan verici yeni bir teknoloji temsil ettiğini göstermektedir.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

Keşfedin açık kaynak yazılım destekli yüksek içerikli floresan mikroskopi analizi iş akışını. siRNA gen susturması ve hücresel yanıtların nicelemesi için Cell Profiler ve R Studio kullanın.

Yüksek içerik, Open Source Software tarafından desteklenen Evrensel Mikroskop Verilerden Floresan Göstergeler, Bireysel Hücre Niceleme için iş akışı (Video) | JoVE Journal

Yüksek içerik, Open Source Software tarafından desteklenen Evrensel Mikroskop Verilerden Floresan Göstergeler, Bireysel Hücre Niceleme için iş akışı

Daha fazla video keşfet