Aynı Konak Türlerden Primer Antikorların Kullanıldığı Bir Multipleks İmmün Boyama Yöntemi

Bir korteks ve bir medulla içeren sabit ve geçirgen bir adrenal bölüm alın. Antijenin maskelenmesinin kaldırılması için fiksasyonun neden olduğu çapraz bağları kırarak kaynar asidik bir tampon ile muamele edin.

Spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke edin ve kortekse özgü belirteçlere bağlanan primer antikorları tanıtın.

Primer antikorları hedefleyen biyotinile ikincil antikorları ve biotine bağlanan streptavidin konjuge peroksidazları ekleyin.

Florofor etiketli bir tiramid ve hidrojen peroksit tanıtın.

İmmobilize peroksidazlar, yakındaki proteinlere bağlanan ve korteksi etiketleyen tiramidi aktive etmek için hidrojen peroksit kullanır.

Daha sonra, bağlı antikorları çıkarmak için bölümü kaynatma tamponu ile muamele edin.

Medullaya özgü belirteçleri ve biyotinile edilmiş ikincil antikorları hedefleyen aynı konakçı tür tarafından oluşturulan birincil antikorları tanıtın.

Medullayı etiketlemek için streptavidin ile konjuge peroksidazları ve farklı bir florofor konjuge tiramid ekleyin.

Kortekse özgü primer antikorların sıyrılması, onları bağlayan yeniden sokulan sekonder antikorun inhibe edilerek çapraz reaktiviteyi önler.

Nükleer bir leke uygulayın ve belirgin şekilde boyanmış korteks ve medullayı görselleştirmek için görüntüleme yapın, antikor çapraz reaktivitesi olmadığını doğrulayın.

Boyamadan önce, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü slaytları, belirtildiği gibi her bir çözeltiye beş dakikalık daldırmalarla mumdan arındırın ve yeniden sulandırın. İkinci damıtılmış suya daldırıldıktan sonra, slaytları kapaklı bir pipet ucu kutusunun dibine 275 mililitre kaynar sodyum-sitrat çözeltisine yerleştirin ve kutuyu sekiz dakika boyunca% 70 güçte 700 watt'lık bir mikrodalgaya yerleştirin.

İşlemin sonunda, kapağı açın ve slaytları bir Coplin kavanozunda beş dakikalık üç adet taze PBST yıkaması ile yıkamadan önce çözeltinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmek için, son yıkamadan sonra, her slayttan fazla PBST'yi sallayın ve slaytları yeterli hacimde uygun bir engelleme solüsyonu ile örtün.

Nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 30 dakika sonra, her slayttan fazla bloke edici çözeltiyi çalkalayın ve her numuneye ilgilenilen ilk primer antikorun 250 mikrolitre ekleyin. Numunelerin kurumasını önlemek için, slaytlar bir parça parafin filmi ile kaplanabilir.

Nemlendirilmiş haznede dört santigrat derecede bir gece inkübasyondan sonra, slaytları yıkama başına beş dakika boyunca taze PBST ile üç kez yıkayın. Fazla PBST'yi silkeleyin, ardından nemlendirilmiş odada oda sıcaklığında bir saatlik bir inkübasyon için her slaytı 250 mikrolitre uygun bir ikincil antikor çözeltisi ile hızlı bir şekilde kapatın.

Kuluçka süresinin sonunda, slaytları gösterildiği gibi taze PBST'de üç kez yıkayın ve her slayta 250 mikrolitre taze hazırlanmış streptavidin yaban turpu peroksidaz ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, slaytları taze PBST'de üç kez yıkayın, ardından fazla PBST'yi silkeleyin ve her slaytı 250 mikrolitre taze hazırlanmış florofor tiramid çözeltisi ile kaplayın.

Bir dakika sonra, slaytları taze PBST'ye batırın, ardından taze PBST'de iki dakikalık üç yıkama yapın. Son yıkamadan sonra, bölümlere PBS çözeltisine birkaç damla 1'e 1 gliserol uygulayın ve floresan mikroskobu ile bir floresan sinyalinin varlığını kontrol edin.

İlk antikor kompleksini çıkarmak için, antikor etiketli slaytları gösterildiği gibi en az sekiz dakika boyunca 275 mililitre kaynar sodyum-sitrat çözeltisine yerleştirin. İşlemin sonunda, kapağı açın ve slaytları yıkama başına beş dakika boyunca PBST ile üç kez yıkamadan önce çözeltiyi oda sıcaklığına soğumaya bırakın.

İlgilenilen ikinci hedef proteini boyamak için, spesifik olmayan bağlanma için blokaj gösterildikten sonra, her numuneyi gece boyunca dört santigrat derecede 250 mikrolitre ikinci primer antikor ile etiketleyin. Ertesi sabah, oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyon için her bir slaytı 250 mikrolitre uygun bir ikincil antikor çözeltisi ile kaplamadan önce, slaytları yıkama başına beş dakika boyunca taze PBST'de üç kez yıkayın.

Kuluçka süresinin sonunda, slaytları gösterildiği gibi taze PBST'de üç kez yıkayın ve her slayta 250 mikrolitre taze hazırlanmış streptavidin yaban turpu peroksidaz ekleyin. Üç PBST yıkamasından sonra ilgilenilen ikinci hedef protein için sinyali geliştirmek için, slaytları farklı bir floresan spektrumunda florofor konjuge bir tiramid ile muamele edin.

Tiramid sinyal gelişimini durdurmak için, slaytları PBST'ye batırın ve ardından numuneleri uygun bir nükleer boya ile boyayın.