Morfolojik analiz Drosophila Larvaların Periferik Duyusal Nöron Dendritler ve Aksonlar

Bu prosedürün genel amacı, drosophila, larva, dendritik, arborizasyon nöronlarının ayrıntılı morfolojisini görselleştirmektir. Bu, önce embriyoların toplanması, yaşlandırılması ve ısı şokunun neden olduğu lipaz ekspresyonu ile GFP etiketli genetik klonların üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, floresan nöron klonları olan larvaları seçmek ve dendritik ABA'larının bir görüntüsünü almaktır.

Lavları görüntüledikten sonra, disseke edilir, sabitlenir ve immüno olarak boyanırlar, böylece monte edilebilirler ve dendritik limanları ve aksonal terminal morfolojileri konfokal immünofloresan mikroskobu ile görselleştirilebilir. Bugün, genetik mos kullanarak sula alt periferik sensör OID'lerinin ve ekzonların morfolojik analizi için bir protokol göstereceğim. Bu yöntem, nöral kimliği, dendritik ağız şeklini ve dış kablolamayı kontrol eden genetik programlar nelerdir gibi nörogelişimsel alandaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Bu protokole elma suyu plakalarında embriyoları toplayarak başlayın. Isı şoku, 38 santigrat derecelik bir su banyosunda verilir ve süre embriyo genetiğine ve istenen klon boyutlarına göre değişir. Bu protokol için, pand dendritik arborizasyon nöron sürücüsü ile embriyolardan markum klonları oluşturun Isı şokundan önce, işaretleyici embriyoları iki saat boyunca nemli ve dokularla çevrili 25 santigrat derecede tutun.

Toplama plakalarını boş plakalar ve para dolgu kullanarak suya daldırılabilir hale getirerek ısı şokuna hazırlayın. Daha sonra, küçük klonlar veya tek nöron etiketlemesi oluşturmak için işaretleyici embriyoları bir saat boyunca ısı şoku verin. Klon sayısını artırmak için, banyoda 45 dakika, ardından oda sıcaklığında 30 dakika ve ardından banyoda 30 dakika daha inkübe ederek uzun süreli bir ısı şoku kullanın.

Flipout klonları oluşturmak için, sürekli 24 saat boyunca embriyoları toplayın. Bu protokol, dördüncü sınıfa özgü bir sürücü kullanır. Isı şokundan sonra bir saat boyunca flipout embriyolarına ısı şoku.

Toplama plakalarını nem, doku ve kültürle çevrili 10 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Embriyo kültürleme monitörü sırasında embriyolar 25 santigrat derecedir ve maya macununu gerektiği gibi doldurun. Çünkü beslenme, nöronal gelişimi kritik derecede etkiler.

Yıldız lavlarında dolaşan üçüncü kişi kısa bir süre toplanana kadar kültürü koruyun ve üçüncü instar larvalarını musluk suyunda nazikçe durulayın ve bir agar plakasına aktarın. Şimdi larvaları güçlü bir floresan diseksiyon mikroskobu ve böcek forseps kullanarak inceleyin. Vücut duvarındaki GFP pozitif nöronları olan larvaları tanımlayın ve bunları% 80 gliserol damlası ile bir depresyon slaytına aktarın.

Lavı hareketsiz hale getirmek için kaydırağın üzerine bir kapak fişi yerleştirin. Lav ile kapak kızağı arasında hava kalmadığından emin olun. Lav kütikülü boyunca ilgilenilen nöronları görselleştirmek için standart konfokal mikroskopi kullanın.

Daha iyi bir görüş açısı için lavın konumunu değiştirmek için, lavı yuvarlamak için kapak kızağını hafifçe itin. Bu protokole, böcek forsepsleri kullanarak bir lavı SIL koruma plakasına aktararak başlayın. Daha sonra ön ve arka uçlarından sabitleyin.

Ardından kalsiyum içermeyen HL 3.1 tamponu ekleyin. Şimdi lavın her iki ucunu ön arka eksene dik olarak yarıya kadar kesin. Sonra iki trakea arasındaki orta hat boyunca kesin.

Bağırsağı nazikçe çıkarmadan önce vücut duvarına olan her bir trakeal bağlantıyı dikkatlice kesin. Bu, PNS ve CNS arasında çalışan segmental sinirleri sağlam tutar. Larva hala hücre koruma plakasına sabitlenmiş durumdayken, hafifçe dönen bir çalkalayıcı üzerinde 20 dakikalık oda sıcaklığında PBS'de% 4 Para formaldehit içinde sabitleyin, her diseksiyonu beş dakikadan daha kısa sürede gerçekleştirin.

Aksi takdirde, dendritik yetkilendirme nöronlarının nitleri bozulmaya başlayacaktır. Fiksasyondan sonra fazla larva dokularını çıkarın. Daha sonra filetoları yıkama başına 10 dakika boyunca PBST ile üç kez yıkayın.

Yıkamalardan sonra, larvaları hafifçe çalkalayarak bloke edici solüsyonda 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Blok tamamlandıktan sonra, blokaj solüsyonunu birincil antikor solüsyonu ile değiştirin. Numuneyi nemli ve dokularla çevrili küçük plastik kaba koyun ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin Ertesi gün, inkübasyona oda sıcaklığında bir saat daha devam edin.

Daha sonra lav filetosunu PBST'de yıkama başına 10 dakika boyunca altı kez yıkayın. Şimdi ikincil antikoru ekleyin ve Fluor'un foto-ağartılmasını önlemek için filetoları karanlık bir kaba koyun. Filetoları oda sıcaklığında saatlerce veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin, ardından oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Son olarak, filetoları yıkama başına 10 dakika boyunca PBST'de altı kez yıkayın. Dokular daha sonra monte edilmeye hazır hale gelir. Akson terminalini görselleştirmek için, larva fileto kütikül tarafı aşağı bakacak şekilde %80 gliserol içine bir çöküntü slaytına monte etmeniz yeterlidir.

Dendritlerin daha net görüntülerini elde etmek için, PLL kaplı kapak kızakları ile kalıcı bir montaj yapın. Kapak fişlerini kodlamak için PLL'nin tho ve aliquot'u. 10 mililitre çift damıtılmış suya getirin ve 20 mikrolitre Kodak fotoğraf akışı ekleyin.

Kapak fişlerini 30 dakika boyunca PLL solüsyonuna batırın ve çıkardıktan sonra havayla kurutun. Sonra kısa bir süre su ve hava ile durulayın. Onları tekrar kurutun.

Bu işlemi iki kez tekrarlayın. PLL banyosundan başlayarak, tedavi edilen lameller yaklaşık bir ay sürecektir. Şimdi, parçalanmış bir larva fileto kası tarafı aşağı bakacak şekilde bir PLL kapak kızağı üzerine bir damla PBS'ye monte edin.

Fileto, bir parça kağıt mendil kullanarak kapak fişine hızlı bir şekilde yapışacaktır. Mümkün olduğu kadar fazla sıvıyı çıkarın, ancak tamamen kurumasına izin vermeyin. Daha sonra larva filetolarını kurutun ve %35 etanol ile başlayan 10 dakikalık bir dizi etanol banyosu, ardından %50, ardından %70, ardından %95, ardından %100 ve son olarak ikinci, %100 etanol banyosu.

Etanol banyolarını iki veya üç adet 10 dakikalık ksilen banyosu ile takip edin. Ardından temiz bir slayta bir damla DPX koyun ve kapak fişini dikkatlice DPX'e yerleştirin, tarafı aşağı bakacak şekilde doldurun. Slaytı karanlıkta tutun ve DPX'in ayarlanması için bir gün bekleyin.

İn vivo ve fokal mikroskopi kullanarak dokuyu görüntülemeden önce, bu tür görüntüleri yakalamak mümkündür. Sınıf dört dendritik arborizasyon nöronunun tüm çardağı. Bu, morfolojiyi korumak için doğru bir şekilde sabitlenmiş IHC etiketli üçüncü sınıf bir nörondan alınan dendritik bir çardağın yakın çekimidir.

İç kısım, başarısız bir diseksiyon ve fiksasyondan sonra oluşabilecek bozulmayı gösterir. Bu kaplama, CNS'de tek bir sınıf dört akson terminalini gösterir. Akson, yeşil renkte anti GFP ile etiketlenmiştir ve tüm sınıf dört termit, macenta renginde anti CD iki ile boyanmış bir co'dur.

Bu prosedürü denerken, aksonları çevreden CNS'ye kadar izleyerek numuneleri hızlı bir şekilde incelemeyi ve sabitlemeyi unutmamak önemlidir. Her bir vücuttaki PNS nöronlarının, vent sinir kodunun bilişsel segmentine projeksiyon yapacağını akılda tutmakta fayda var. Ayrıca, sadece dendritleri görselleştirmek istiyorsanız, diseksiyon sırasında CNA'ları çıkarın ve boyama, plakalar yerine tüplerin ekinde gerçekleştirilebilir.

Dendrit görüntüleme için bu filetoları monte ederken, önce kafayı ağız kancalarıyla ve arkasını parıltılarla kesin. Keyifli bir hazırlık için.