Name: Morfolojik analiz Drosophila Larvaların Periferik Duyusal Nöron Dendritler ve Aksonlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Öğrenin Drosophila larvalarında dendritik arborizasyon nöronlarının morfolojisini görselleştirmeyi. Bu yöntem konfokal immünofloresan mikroskopi kullanarak genetik mozaiklerle nöron gelişimini incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, finansman için RIKEN teşekkür ederiz. Ayrıca genetik ve immünhistokimya protokolleri ile ilgili tartışmalar için, Çağrı Başel Yalgin, Caroline Delandre ve Jay Parrish teşekkür ederim.

Reaktiflerin, 1.Preparation <ol><li> Ca + + ücretsiz HL3.1 tuzlu su 28 hazırlayın. <ol><li> MM: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 Hepes, 115 sakkaroz ve 5 trehaloz; pH 7,2. Sterilize Filtre ve 4 saklamak ° C Not: Ca + + ücretsiz bir çözüm diseksiyonu sırasında kas kasılması önler. </li></ol></li><li> Poli-L-lisin (PLL) lamelleri olun. <ol><li> 100mg PLL, -20 ° C'de 4.2ml suda çözülür ve 300μl alikotları Eppendorf tüpleri ve dondurma yapmak </li><li> Kaplama lamelleri, ilk çözülme bir kısım, GKD 2 O 10ml getirmek ve Kodak Photo-Flo 20μl eklemek önce son PLL konsantrasyonu 0.7 mg / ml; </li><li> Batmak lamelleri, 30 dakika için PLL çözüm çıkarın ve kuru, kısa bir süre sonra su ve kuru yıkayın. Iki kez tekrarlayın. Arıtılmış lamelleri son yaklaşık bir ay. </li></ol></li></ol> 2. Genetik haçlar <ol><li> To MARCM klonlar oluşturur. İşte bir örnek çapraz bir pan-DA sürücü 11,27 kullanarak: FRT2A x hsFLP Gal4 109 (2) 80, UAS-mCD8: GFP, küvet-Gal80 FRT2A/SM5-TM6B </li><li> Klonlar Flp-out oluşturmak için. Burada bir sınıf IV-özel sürücü 8 kullanarak bir örnek çapraz: PPK-Gal4 x yw, hsFLP UAS-FRT-CD2, y +-stop-FRT-mCD8: GFP </li></ol> 3. Embriyoların toplanması <ol><li> Drosophila haçlar tutun bir koleksiyon şişesi 25 ° C ve maya yapıştırın 30,31 ince bir tabaka ile bir elma suyu agar plaka 29 yayılmasını embriyolar toplamak. </li></ol> 4. Isı şok tedavi embriyoların <ol><li> Embriyoların atılmış, bunun üzerine elma suyu agar plaka muhalefet boş bir tabak yerleştirin. Parafilm (Şekil 2) ile bu iki tabak etrafında Seal. </li><li> Isı şok sırasında, batığın incie su banyosu plaka ve bir metal ağırlık kullanarak basılı tutun. </li><li> MARCM embriyolar <ol><li> 2s için embriyolar toplayın ve çevrili bir 10cm petri inkübe ek bir 2 saat için 25 ° C'de doku nemlendirilmiş. Not: ısı şok protokolü ayarlama klonları oluşturulur hangi frekans değiştirir. </li><li> 38 1s için su banyosu tek izole nöronların, daldırın ve ısı şok amaçlayan bir klon daha az sayıda ° C için </li><li> Klon daha büyük bir sayı için, 45 dakikaya için ısı şoku 38 ° C, ek bir 30 dakika daha sonra RT 30 dakika, ısı çarpması kurtarmak. </li></ol></li><li> 24 saat embriyolar Flp toplamak ve 38 1s için ısı şok ° C </li></ol> 5. Klonlar için tarama <ol><li> Isı şok sonra, su geçirmez bir düzenlemenin kapağını kaldırın ve elma suyu agar plaka 10cm petri nemlendirilmiş dokuları ile çevrili bir yerde. Kültür dolaşmak kadar embriyo ve sonraki larva 25 ° Cing 3. instar. Not: kültür koşulları, beslenme, özellikle DA dendritik çardak morfolojisi 32,33 değiştirmek için ortaya konmuştur. Büyüyen larva, her zaman maya yapıştırmak için erişimi olduğundan emin olun; gerektiği gibi yapıştırın maya izlemek ve yenilemek. </li><li> Bu noktadan itibaren protokol itibaren, larvaları hafifçe böcek forseps kullanarak işleyebilirsiniz. </li><li> Kısaca ve yavaşça, musluk suyunda larvaların yıkayın ve sonra agar bir tabağa koyun. Not: Bu adım, arka planda otomatik floresan larva yüzeyinde yiyecek veya kirden azaltır. </li><li> Güçlü bir floresan diseksiyon mikroskobu altında larvaları inceleyin. Larvaların vücut duvarı GFP pozitif nöronlar / hücreleri ile tanımlayın. </li></ol> Dendritler 6 in vivo görüntüleme <ol><li> Larva küçük bir damla% 80 gliserol ile depresyon slayt bardağın içine yerleştirin. Larva hareketsiz bir slayt lamel yerleştirin. Herhangi bir hava larva ve coversli arasında kalmasını sağlamaks. </li><li> Ilgi nöron görselleştirme izin vermek için larva rulo lamel yavaşça itin. MCD8: konfokal mikroskobi ile GFP etiketli dendritik mili. </li></ol> 7. Larvaların diseksiyonu Başlamadan önce Not: DA nöron dendritler diseksiyon başladıktan sonra hızla zayıflar. Iyi dendrit morfolojisi sağlamak için daha az 5dk her bireyin larva parçalara ayır. <ol><li> 3. instar larvaları dolaşıp, aşağıdaki değişiklikler ile daha önce 34 açıklandığı gibi bir Sylgard plaka üzerinde teşrih : <ol><li> DA nöron akson Termini görüntüleme için, merkezi sinir sistemi sağlam ve segmental sinirler kırık olmadığını garanti eder. Larvaların açtıktan sonra, ilk önce vücut duvarı dikkatle trakeal bağlantıları kesmek ve daha sonra yavaşça tüm bağırsak kaldırmak. </li><li> Eğer dendritler yalnız görüntüleme, düz bir montaj sağlamak için MSS çıkarın. </li></ol></li></ol> 8. Fixatlarva filetosu iyon ve engelleme <ol><li> Hala Sylgard plaka tutturulmuş larva ile yavaşça dönen çalkalayıcı RT 20mins için PBS içinde% 4 PFA sabitleyin. </li><li> Fiksasyon sonra larva dokularının izleri (yağ vücut, trakea, vb.) Çıkarın. </li><li> Sylgard plaka ve çalkalayıcı üzerinde 3x 10mins (% 0.1 Triton X-100 ile PBS) PBST yıkayın. Akson terminallerini inceleyerek varsa fileto, Sylgard plaka üzerinde tutun. (Boyama dendritler Eğer bu adımı 34 larva filetosu 0.5 ml tüp aktarmak mümkün) </li><li> RT 20mins larvaları çalkalamalı PBST% 5 normal eşek serum (NDS) engelleyin. </li></ol> 9 - Larva filetosu boyanması <ol><li> Primer antikor engelleme çözümü ve inkübe çevrili küçük bir Tupperware konteyner ° C dokuların nemlendirilmiş 4 geceleme (NDS / PBST% 5) çıkarın. </li><li> 4 ° C tüpler çıkartın ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. </li><li> PBST 6x 10mins yıkayın. Ikincil antib ekleody (NDS / PBST% 5) ve kapak fluorofor fotoğraf beyazlatma 34 engellemek için. </li><li> Ya iki saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin, ya da bir gecede 4 ° C oda sıcaklığında bir saat izledi. </li><li> PBST larvaları 6x 10mins yıkayın ve montaj devam. </li></ol> 10. Dendrit çardak muayene için larva filetosu montajı <ol><li> Mount diseksiyon makas veya baş (ağız kanca da dahil olmak üzere) ve 34 (spiracles dahil) posterior kesmek için bir neşter kullanılarak mümkün olduğu kadar düz, her larva fileto. </li><li> % 80 gliserol monte slayt aşağı manikür-yan larva fileto yerleştirin ve 'hızlı' mount 34 oje ile lamel iki mühür. </li><li> Kalıcı bir montaj ve daha net bir görüntü için <ol><li> PLL lamel PBS bir damla üzerine disseke larva fileto kas tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin, hızla lamel uyacaktır. </li><li> Howeve, monte edildikten sonra mümkün olduğunca fazla sıvı olarak Kaldırr tamamen kurumasına izin vermeyin. </li><li> % 35 etanol,% 50,% 70,% 95, ve her biri 10 dakika (2.% 100 EtOH çözüm sık değiştirilmesi olmalıdır nihayet 2x% 100 etanol: etanol bir dizi lamel (ekli larva fileto) atın ); nihayet, 2-3x Ksilen 10mins yıkayın. </li><li> DPX mountant (Distyrene Plastifiyan Ksilen) temiz bir slayt üzerinde bir damla koyun ve üstüne dikkatlice lamel fileto tarafı aşağı yatıyordu. Karanlıkta tutun ve görüntüleme önce ayarlamak için DPX için bir gün bekleyin. </li></ol></li></ol> 11. Akson Termini muayene için larva filetosu montajı <ol><li> Segmental sinirler diseksiyonu, fiksasyon sırasında sağlam PNS ve MSS arasında çalışan ve periferik duyusal nöron hücre gövdesi VNC aksonlar izleme izin boyama tutun. </li><li> Bir depresyon slayt% 80 gliserol her larva fileto manikür tarafı yere monte edin. DA hücre gövdesi aksonlar İzKonfokal mikroskop altında VNC. Not: VNC cognate segmentine her vücut duvarı segmentinde projesi PNS nöronlar. </li></ol> 12. Temsilcisi Sonuçlar: Temsilcisi sonuçları rakamlar 3-5 gösterilmiştir. Şekil 3 konfokal mikroskop altında in vivo olarak yakalanan bir sınıf IV da nöron, tüm mili gösterir. Şekil 4 doğru morfolojisi korumak için sabit olmuştur immünohistokimyasal etiketli bir sınıf III nöron dendrit çardak bir parçası kadar yakın gösterir. Ilişkili içerlek (anti-GFP antikor ile hem boyanmış), başarısız bir diseksiyon ve fiksasyon sonra oluşabilir bozulma gösterir. Şekil 5 MSS tek bir sınıf IV akson terminus (anti-GFP, yeşil), tüm sınıf IV Termini anti-CD2 (kırmızı) ile birlikte lekeli. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig1.jpg"> Şekil 1 Protokolü genel bakış. a) toplayın ve sonra ısı-şok embriyolar. b) Canlı larva sonra bir GFP pozitif DA nöron klon ile larva, ve görüntü GFP etiketli dendrit çardak seçin. c) larva ayır ve sonra immünohistokimyasal fileto leke. d) Mount lekeli fileto ve ardından görüntü, dendritik mili ve aksonal projeksiyonlar DA nöron klonlar. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig2.jpg"> Şekil 2 elma suyu agar plaka ısı şok Hazırlık. Plaka (beyaz ok, ab) (kırmızı ok b) üstüne atın, ikinci bir petri ekleyin ve Parafilm (mavi ok, b) ile mühür. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig3.jpg"> Bir mCD8 dendrit çardak in vivo görüntü Şekil 3: 3. instar larva bir sınıf IV (v'ada) nöron temsil GFP etiketli MARCM klon (2.1 olarak genotip). Ölçek çubuğu 50μm. d/3111/3111fig4.jpg "/&gt; Şekil 4 mCD8: başarılı diseksiyon ve fiksasyonun (yeşil) sonra iyi morfoloji gösteren anti-GFP antikor ile boyandı sınıf III nöron (ddaA), GFP etiketli MARCM klonu. Başarısız diseksiyonu ve sabitleme (kırmızı) sonra ortaya çıkan içerlek gösterir dendrit bozulması (beyaz ok). Ölçek çubuğu 25μm. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig5.jpg"> Şekil 5 3. instar larva VNC. Tek bir sınıf VI (vdaB) akson terminus (2.2 olarak genotip) bir Flp-out klonu anti-GFP antikor (yeşil) kullanarak tespit edilmiştir. Anti-CD2 tüm sınıf IV Termini (kırmızı) etiket. Ölçek çubuğu 25μm.

<ol><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li>
<li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+multidendritic+neuron+differentiation+in+Drosophila%3A+the+role+of+Collier%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier.</a> Dev Biol. 315, 232-242 (2008).</li>
<li>Hattori, Y., Sugimura, K., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+Knot%2FCollier%2C+a+transcriptional+regulator+of+the+EBF%2FOlf-1+family%2C+endows+the+Drosophila+sensory+system+with+neuronal+class-specific+elaborated+dendritic+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Selective expression of Knot/Collier, a transcriptional regulator of the EBF/Olf-1 family, endows the Drosophila sensory system with neuronal class-specific elaborated dendritic patterns.</a> Genes Cells. 12, 1011-1022 (2007).</li>
<li>Jinushi-Nakao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56, 963-978 (2007).</li>
<li>Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+morphological+diversity+of+dendrites+in+Drosophila+by+the+BTB-zinc+finger+protein+abrupt%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt.</a> Neuron. 43, 809-822 (2004).</li>
<li>Li, W., Wang, F., Menut, L., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BTB%2FPOZ-zinc+finger+protein+abrupt+suppresses+dendritic+branching+in+a+neuronal+subtype-specific+and+dosage-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">BTB/POZ-zinc finger protein abrupt suppresses dendritic branching in a neuronal subtype-specific and dosage-dependent.</a> 43, 823-834 (2004).</li>
<li>Zlatic, M., Landgraf, M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+specification+of+axonal+arbors%3A+atonal+regulates+robo3+to+position+terminal+branches+in+the+Drosophila+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic specification of axonal arbors: atonal regulates robo3 to position terminal branches in the Drosophila nervous system.</a> Neuron. 37, 41-51 (2003).</li>
<li>Grueber, W. B., Ye, B., Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrites+of+distinct+classes+of+Drosophila+sensory+neurons+show+different+capacities+for+homotypic+repulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendrites of distinct classes of Drosophila sensory neurons show different capacities for homotypic repulsion.</a> Curr Biol. 13, 618-626 (2003).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+the+homeodomain+protein+cut+regulate+distinct+dendrite+branching+patterns+of+Drosophila+multidendritic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons.</a> Cell. 112, 805-818 (2003).</li>
<li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hamlet%2C+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li>
<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+mechanisms+to+define+neuron+class-specific+dendrite+arbor+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh.+Migr%22%5BJournal%5D)">Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology.</a> Cell Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).</li>
<li>Hughes, C. L., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensory+feedback+circuit+coordinates+muscle+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila.</a> Mol. Cell. Neurosci. 35, 383-396 (2007).</li>
<li>Nishimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+Behaviors+and+Segmental+Coordination+During+Larval+Locomotion+Is+Disrupted+by+Nuclear+Polyglutamine+Inclusions+in+a+New+Drosophila+Huntington%27s+Disease-Like+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model.</a> J Neurogenet. 24, 194-206 (2010).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li>
<li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li>
<li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+TRP+channel+NompC+in+Drosophila+larval+and+adult+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li>
<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19, 799-806 (2009).</li>
<li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Larval+CNS+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster.</a> J. Vis. Exp. (1), e85-e85 (2006).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Merritt, D. J., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+projections+of+sensory+neurons+in+the+Drosophila+embryo+correlate+with+sensory+modality%2C+soma+position%2C+and+proneural+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Central projections of sensory neurons in the Drosophila embryo correlate with sensory modality, soma position, and proneural gene function.</a> J Neurosci. 15, 1755-1767 (1995).</li>
<li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+techniques+for+studying+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development.</a> Development. 130, 5065-5072 (2003).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Wong, A. M., Wang, J. W., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+representation+of+the+glomerular+map+in+the+Drosophila+protocerebrum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial representation of the glomerular map in the Drosophila protocerebrum.</a> Cell. 109, 229-241 (2002).</li>
<li>Shimono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidendritic+sensory+neurons+in+the+adult+Drosophila+abdomen%3A+origins%2C+dendritic+morphology%2C+and+segment-+and+age-dependent+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death.</a> Neural Dev. 4, 37-37 (2009).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Kaczynski, T. J., Gunawardena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+Embryonic+Nervous+System+in+Whole-mount+Drosophila+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (46), e2150-e2150 (2010).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Medina, P. M., Swick, L. L., Andersen, R., Blalock, Z., Brenman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+forward+genetic+screen+for+identifying+mutations+affecting+larval+neuronal+dendrite+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel forward genetic screen for identifying mutations affecting larval neuronal dendrite development in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 172, 2325-2335 (2006).</li>
<li>Mirouse, V., Swick, L. L., Kazgan, N., St Johnston, D., Brenman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LKB1+and+AMPK+maintain+epithelial+cell+polarity+under+energetic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LKB1 and AMPK maintain epithelial cell polarity under energetic stress.</a> J Cell Biol. 177, 387-392 (2007).</li>
<li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Larval+NMJ+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. 25, e1108-e1108 (2009).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li>
<li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+a+synapse+grow%3A+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li>
<li>Landgraf, M., Sanchez-Soriano, N., Technau, G. M., Urban, J., Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+the+Drosophila+neuropile%3A+a+strategy+for+the+standardised+characterisation+of+genetically+amenable+neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Charting the Drosophila neuropile: a strategy for the standardised characterisation of genetically amenable neurites.</a> Dev Biol. 260, 207-225 (2003).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Drosophila larva DA nöron modeli mekanizmalarının araştırılması için mükemmel bir genetik sistem sağladığı kontrolü nöron morfolojisi ve devre oluşumu. MARCM genel etiketleme ve mutant DA nöron klonları üretmek için kullanılır. MARCM için bir pan-nöral (örneğin Gal4 C155) ya da nöron spesifik bir sürücü kullanır . Bir pan-nöral sürücüsü kullanarak doğrudan kamu stok merkezlerinde yaygın olarak çeşitli stokları kullanmak mümkündür. MSS işaretli klonları oluşturulur ve bu klonların DA ...

<table border="1"><tr><th> Reaktifi Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> SZX16 floresan diseksiyon mikroskobu (GFPHQ filtre ile) </td><td> Olympus </td><td> SZX16 </td><td></td></tr><tr><td> Canlı Böcek Forseps </td><td> FST </td><td> 26030-10 </td><td></td></tr><tr><td> 26mm x 76mm depresyon slayt cam </td><td> Toshinriko Co. </td><td> T8-R004 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 (veya Silpot 184) </td><td> Dow Corning </td><td> 3097358-1004 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-lisin </td><td> Sigma </td><td> P-1524 </td><td> Bu ürün en etkili olduğu kanıtlanmıştır </td></tr><tr><td> DPX montaj orta </td><td> Sigma </td><td> 44581 </td><td></td></tr><tr><td> Tavşan, anti-GFP </td><td> Invitrogen </td><td> A-11122 </td><td> Seyreltme 1:500 </td></tr><tr><td> Sıçan, anti-CD8 </td><td> Caltag </td><td> 5H10 </td><td> Seyreltme 1:200 </td></tr><tr><td> Fare, anti-CD2 </td><td> AbD serotec </td><td> MCA443R </td><td> Seyreltme 1:700 </td></tr><tr><td> Fare, anti-Fasciclin2 </td><td> DSHB </td><td> 1D4 </td><td> Seyreltme 01:10 </td></tr></table>

morfolojik analiz drosophila</emgenetik mozaikler> larvaların periferik duyusal nöron dendritler ve aksonlar

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Sinir sistemi gelişimi doğru nöron sınıfa özel dendritik gelişim ve aksonal kablo takip nöron konumu ve kimliği, doğru özellikleri gerektirir. Son zamanlarda Drosophila larva periferik sinir sistemi (PNS) dendritik arborization (DA) duyusal nöron nöron farklılaşma iki genel ve özel sınıf mekanizmaları aydınlatmak için güçlü bir genetik model haline gelmiştir . Dört ana DA nöron sınıfları (I-IV) 1 vardır. Dendrit çardak karmaşıklığı artan sırasına göre adlandırılır ve kendi farklılaşma 2-10 genetik kontrol özel sınıf farklılıkları vardır. 1) DA nöron dendrit çardak yayılır meyve sineği güçlü genetik araçlar, 2) yararlanmak: Çünkü DA duyusal sistem dendritik morfoloji 11-13 kontrol arkasındaki moleküler mekanizmalarının araştırılması için pratik bir model bir optik cle altında sadece 2 boyutlu olarakar larva manikür) kolay in vivo yüksek çözünürlüklü, 3 görselleştirmek için sınıfa özel çeşitliliğin dendritik morfoloji) basit vs yüksek dallı dendritik ağaçlar oluşumunu kontrol anahtar öğeleri bulmak için karşılaştırmalı bir analizini kolaylaştırır ve 4 basmakalıp dendritik çardak şekilleri farklı DA nöronlarının morfometrik istatistiksel analizler kolaylaştırır. DA nöron aktivitesi, larva lokomosyon merkezi desen jeneratör 14-16 çıkış değiştirir . Farklı DA nöron sınıfları farklı duyusal yöntemleri var ve bunların aktivasyon 14,16-20 farklı davranışsal tepkiler ortaya çıkarır. Ayrıca farklı sınıflar, ventral sinir kablosunu Drosophila larva merkezi sinir sistemi (VNC) 21 basmakalıp aksonal projeksiyonlar gönderir . Bu tahminler, dendritik alanında 7,22 vücut duvarı DA nöron duyusal yöntemidir ve pozisyon hem topografik gösterimleri ile sona erdirme, 23. DA aksonal projeksiyonlar Bu nedenle muayene topografik harita 7,22,23 yanı sıra, basit bir devre modüle larval lokomosyon 14-17 kablolama altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için kullanılabilir . Biz burada MARCM (Mozaik Repressible Hücre Marker Analizi) 1,10,25 ve Flp-22,26,27 teknikleri (Şekil 1 özetlenmiştir) ile 24 işaretleme DA nöronlar oluşturmak ve genetik mozaikler analiz için pratik bir rehber sunuyoruz.

Dendritik arborization duyusal nöronlar<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva periferik sinir sisteminin genel ve nöron nöron farklılaşma sınıfa özel mekanizmaları aydınlatmak için faydalı model vardır. Biz dendritik arborization nöron genetik mozaikleri oluşturmak ve analiz etmek için pratik bir rehber sunuyoruz.

Morfolojik analiz Drosophila</emGenetik Mozaikler> Larvaların Periferik Duyusal Nöron Dendritler ve Aksonlar

Sinir sistemi gelişimi, nöron konumunun ve kimliğinin doğru şekilde belirlenmesini, ardından buna bağlı olarak nöron sınıfına özgü dendritik...

Bu prosedürün genel amacı, drosophila larval dendritik arborizasyon nöronlarının detaylı morfolojisini görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle embriyoların toplanması, yaşlandırılması ve ısı şokuyla indüklenen lipase ekspresyonu yoluyla GFP etiketli genetik klonların oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, floresan nöron klonlarına sahip larvaların seçilmesi ve bu larvaların dendritik ABA'larının görüntüsünün alınmasıdır.Lavalar görüntüledikten sonra, dendritik limanları ve aksonal terminal morfolojileri konfokal immunofloresan mikroskobi ile görselleştirilebilmesi için diseke edilir, fikse edilir ve immün boyanır, ardından lam üzerine monte edilirler. Bugün, genetik mos kullanarak sula alt periferik sensor OID'lerinin ve eksonlarının morfolojik analizi için bir protokol göstereceğim. Bu yöntem, nöral kimliği, dendritik oral şekli ve eksternal bağlantıları kontrol eden genetik programların neler olduğu gibi nörogelişim alanıyla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu protokole, embriyoları elma suyu plaklarında toplayarak başlayın. Isı şoku 38 °C'lik bir su banyosunda uygulanır ve süresi embriyo genetiğine ve istenen klon boyutlarına göre değişiklik göste

morphological-analysis-drosophila-larval-peripheral-sensory-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz sahnelenen hazırlamak için prosedürü...

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

Kaynak: Ting, C., et al., Sütunlarda ve Katmanlarda Dendritik Morfolojiyi Analiz Etme. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, bir Drosophila beyni hazırlama, konfokal bir mikroskop altında GFP etiketli medulla dendritlerinin yatay ve önden görüntü yığınlarını yakalama ve katmanlar ve sütunlar arasındaki morfolojilerini analiz etmek için bir 3D rekonstrüksiyon oluşturma prosedürünü göstermektedir.

Drosophila Medulla Katmanları ve Sütunları Boyunca Dendritik Morfolojinin Analizi

Biz, merkezi sinir sistemi içinde tek nöron etiketlenmesine yönelik bir yöntem (CNS)...

Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila larva dendritik arborization (da) nöronları kullanarak nöronal morfolojilerinden Çalışmaları Immünofloresan nöronal ve epidermal proteinlerin in situ görselleştirme yarar. Larva vücut duvarı kas dokusu kaldırarak da nöronlar ve çevresindeki epidermal hücrelerin immünoflüoresans analizi artıran bir prosedür açıklanmaktadır.

Kaldırılması<em&gt; Drosophila</emDuyu Nöronlar ve Epidermal Hücre İmmünofloresan Analizi Larvaların Fileto dan&gt; Kas Dokusu

İki görüntü analiz algoritmaları, "Drosophila NMJ Morfometri" ve "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" otomatik Drosophila nöromüsküler kavşakta (NMJ) dokuz morfolojik özelliklerini ölçmek için, yaratıldı.

Yüksek throughput ve Çok parametrik Nicelik için iki Algoritmalar<em&gt; Drosophila</em&gt; Nöromusküler Junction Morfoloji

Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya yöntemini ayrıntılarıyla anlatıyor . FasII antikoru ile lekelenmiş sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve sinirsel gelişim sırasında hedef tanıma için gerekli genlerin karakterize edilmesi için güçlü bir araç sağlar.

Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi<em&gt; Drosophila</em

Bu iletişim kuralı diseksiyon ve yetişkin Drosophila melanogaster immunostaining açıklar beyin dokuları. Özellikle, bu iletişim kuralı doğru nöronal gelişim birçok yönlerini temel genel prensipler ortaya çıkarmak için kullanılabilecek örnek nöronal alt kümeleri olarak Drosophila mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanımı vurgulamaktadır.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Bu iletişim kuralı dendritik morfogenez çalışmaları için kullanılan Drosophila, nöronal dendritik arborization karmaşıklık (NDAC) kantitatif analiz üzerinde duruluyor.

Kantitatif analiz Drosophila nöronal dendritik Arborization karmaşıklığı

Burada Drosophila Yetişkin bacaklar fiksasyon, montaj, görüntüleme ve sonrası görüntüleme adımları floresan bir protein ile aksonal hedefleme görselleştirmek için bir protokol açıklayın.

Drosophila bacak Motor Nöron aksonlar yetişkin kütikül aracılığıyla görselleştirmek

Biz lipophilic floresan boyalar kullanarak Drosophila embriyonik motor nöronların retrograd izleme için bir yöntem açıklar.

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

Burada, Drosophila melanogaster'de üç basit yaralanmaya bağlı akson dejenerasyonu (akson ölüm) tahlilleri yaparak kopmuş aksonların ve sinapslarının morfolojik ve fonksiyonel korunmasını değerlendirmek için protokoller salıyoruz.

Drosophila melanogaster'de Akson Ölümü Sırasında Aksonların ve Sinapslarının Morfolojik ve Fonksiyonel Değerlendirilmesi

Öğrenin Drosophila larvalarında dendritik arborizasyon nöronlarının morfolojisini görselleştirmeyi. Bu yöntem konfokal immünofloresan mikroskopi kullanarak genetik mozaiklerle nöron gelişimini incelemeye yardımcı olur.

Morfolojik analiz Drosophila Larvaların Periferik Duyusal Nöron Dendritler ve Aksonlar

Daha fazla video keşfet