Morfolojik analiz Drosophila Larvaların Periferik Duyusal Nöron Dendritler ve Aksonlar

Bu prosedürün genel amacı, drosophila larval dendritik arborizasyon nöronlarının detaylı morfolojisini görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle embriyoların toplanması, yaşlandırılması ve ısı şokuyla indüklenen lipase ekspresyonu yoluyla GFP etiketli genetik klonların oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, floresan nöron klonlarına sahip larvaların seçilmesi ve bu larvaların dendritik ABA'larının görüntüsünün alınmasıdır.

Lavalar görüntüledikten sonra, dendritik limanları ve aksonal terminal morfolojileri konfokal immunofloresan mikroskobi ile görselleştirilebilmesi için diseke edilir, fikse edilir ve immün boyanır, ardından lam üzerine monte edilirler. Bugün, genetik mos kullanarak sula alt periferik sensor OID'lerinin ve eksonlarının morfolojik analizi için bir protokol göstereceğim. Bu yöntem, nöral kimliği, dendritik oral şekli ve eksternal bağlantıları kontrol eden genetik programların neler olduğu gibi nörogelişim alanıyla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu protokole, embriyoları elma suyu plaklarında toplayarak başlayın. Isı şoku 38 °C'lik bir su banyosunda uygulanır ve süresi embriyo genetiğine ve istenen klon boyutlarına göre değişiklik gösterir. Bu protokol için, pand dendritik arborizasyon nöron sürücüsüne sahip embriyolardan markum klonları oluşturun. Isı şokundan önce, marker embriyoları iki saat boyunca nemli dokularla çevrili şekilde 25 °C'de tutun.

Boş plakalar ve para film kullanarak toplama plakalarını daldırılabilir hale getirip ısı şokuna hazırlayın. Ardından, küçük klonlar veya tek nöron etiketlemesi oluşturmak için marker embriyolarına bir saat boyunca ısı şoku uygulayın. Klon sayısını artırmak için, banyoda 45 dakika inkübasyonu, ardından oda sıcaklığında 30 dakika ve tekrar banyoda 30 dakika olacak şekilde uzatılmış bir ısı şoku uygulayın.

Flipout klonları oluşturmak için 24 saat boyunca kesintisiz olarak embriyo toplayın. Bu protokol, sınıf dört spesifik bir sürücü (driver) kullanmaktadır. Isı şokuna maruz bırakılan flipout embriyolarına, ısı şokundan bir saat sonra işlem uygulayın.

Toplama plakalarını, etrafı nemli dokular ve kültürle çevrili 10 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Embriyo kültürü sırasında embriyolar 25 °C'de tutulur; maya pastasını izleyin ve gerektiğinde yenileyin. Çünkü beslenme, nöronal gelişimi kritik düzeyde etkiler.

Kültürü, üçüncü dönem larvalar toplanana kadar sürdürün; ardından üçüncü dönem larvaları musluk suyu ile kısaca ve nazikçe durulayarak bir agar plakasına aktarın. Şimdi larvaları, güçlü bir floresan diseksiyon mikroskobu ve ensekt pensi kullanarak inceleyin. Vücut duvarında GFP pozitif nöronlar bulunan larvaları belirleyin ve bunları bir damla %80 gliserol içeren bir konkav lam üzerine aktarın.

Larvayı sabitlemek için lam üzerine bir lamel yerleştirin. Larva ile lamel arasında hava kalmadığından emin olun. Larva kütikülü üzerinden ilgilenilen nöronları görüntülemek için standart konfokal mikroskopi kullanın.

Daha iyi bir görüntüleme açısı için lavanın konumunu değiştirmek amacıyla, lavayı yuvarlamak için lameline hafifçe bastırın. Bu protokole, bir lavayı böcek pensi kullanarak SIL koruma plakasına transfer ederek başlayın. Ardından, lavayı ön ve arka uçlarından iğneleyerek sabitleyin.

Ardından kalsiyumsuz HL 3.1 tamponu ekleyin. Şimdi lavanın her iki ucunu anterior posterior eksene dik olacak şekilde yarıya kadar kesin. Sonra iki trakea arasındaki orta hat boyunca kesin.

Bağırsakları nazikçe çıkarmadan önce, her bir trake bağlantısını gövde duvarından dikkatlice kesin. Bu işlem, PNS ile CNS arasında uzanan segmental sinirlerin sağlam kalmasını sağlar. Larva hala hücre koruma plakasına iğnelenmiş haldeyken, onu oda sıcaklığında, hafifçe dönen bir çalkalayıcıda 20 dakika boyunca PBS içinde %4 Paraformaldehit ile sabitleyin; her bir diseksiyonu beş dakikadan kısa sürede gerçekleştirin.

Aksi takdirde, dendritik yetkilendirme nöronlarının nitleri degrade olmaya başlayacaktır. Tesbit işleminin ardından, fazla larval dokuları uzaklaştırın. Ardından, filetleri her yıkama için 10 dakika boyunca üç kez PBST ile yıkayın.

Yıkama işlemlerinin ardından, larvaları oda sıcaklığında, hafif sallama eşliğinde bloklama solüsyonu içerisinde 20 dakika inkübe edin. Bloklama tamamlandıktan sonra, bloklama solüsyonunu primer antikor solüsyonu ile değiştirin. Örneği nemli dokularla çevrili küçük plastik kaba yerleştirin ve dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, inkübasyona oda sıcaklığında bir saat daha devam edin.

Ardından lava filetosunu, her yıkama 10 dakika sürecek şekilde altı kez PBST ile yıkayın. Şimdi sekonder antikoru ekleyin ve floroforun fotobeyazlamasını önlemek için filetoları karanlık bir kaba yerleştirin. Filetoları oda sıcaklığında birkaç saat veya 4 °C'de gece boyunca inkübe edin ve ardından oda sıcaklığında bir saat bekletin.

Son olarak filetleri, her yıkama 10 dakika sürecek şekilde altı kez PBST ile yıkayın. Dokular artık mount edilmeye hazırdır. Akson terminallerini görüntülemek için, larva filetini kutikula tarafı aşağı gelecek şekilde bir çukur lam içinde %80 glycerol içine yerleştirin.

Dendritlerin daha net görüntülerini elde etmek için PLL kaplı lamellerle kalıcı preparat hazırlayın. Lamelleri kaplamak için PLL'den bir alikot alın. Bunu 10 milliliters çift distile su ile tamamlayın ve 20 microliters Kodak photo flow ekleyin.

Lamelleri PLL çözeltisi içinde 30 dakika boyunca bekletin ve çıkardıktan sonra havada kurumaya bırakın. Ardından su ve hava ile kısa sürede durulayın. Tekrar kurutun.

Bu işlemi iki kez tekrarlayın. PLL banyosu ile başlayan işlemden sonra, işlem görmüş lameller yaklaşık bir ay boyunca dayanacaktır. Şimdi, diseke edilmiş bir larva filetosunu, PLL kaplı bir lamel üzerindeki bir damla PBS'ye kas tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin.

Bir parça kağıt havlu yardımıyla filet hızla lamel üzerine yapışacaktır. Mümkün olduğunca fazla sıvıyı uzaklaştırın ancak tamamen kurumasını önleyin. Ardından, önce %35 etanol ile başlayıp, ardından %50, sonra %70, sonra %95, sonra %100 ve son olarak ikinci bir %100 etanol banyosu şeklinde devam eden bir dizi 10 dakikalık etanol banyosu ile larva filetlerinidehidre edin.

Etanol banyolarını, ksilende yapılan iki veya üç adet 10 dakikalık banyo ile takip edin. Ardından, temiz bir lama bir damla DPX damlatın ve lamellenin DPX üzerine dikkatlice yerleştirerek ters şekilde doldurulmasını sağlayın. Lamı karanlıkta tutun ve DPX'in donması için bir gün bekleyin.

Dokuyu in vivo ve fokal mikroskopi kullanarak görüntülemeden önce, buna benzer görüntüler elde etmek mümkündür. Dördüncü sınıf bir dendritik arborizasyon nöronun tüm dallanması. Bu görüntü, morfolojiyi korumak için doğru şekilde fikse edilmiş, IHC ile işaretlenmiş üçüncü sınıf bir nörona ait dendritik arborun yakın çekimidir.

Ek görsel, başarısız bir diseksiyon ve fiksasyon sonrası meydana gelebilen dejenerasyonu göstermektedir. Bu bindirme görüntüsü, MSS'de tek bir sınıf dört akson terminalini göstermektedir. Akson yeşil renkte anti GFP ile, tüm sınıf dört terminalleri ise magenta renkte anti CD two ile eş boyanmıştır.

Bu prosedür uygulanırken, aksonların periferden MSS'ye doğru takip edilerek örneklerin hızlı bir şekilde diseke edilmesi ve tespitlenmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir. Her vücuttaki PNS nöronlarının, vent sinir kodunun kognitif segmentine projeksiyon yapacağını akılda tutmak faydalıdır. Ayrıca, yalnızca dendritleri görüntülemek istiyorsanız, diseksiyon sırasında CNA'ları çıkarın; boyama işlemi plaklar yerine tüpler içinde gerçekleştirilebilir.

Bu filetleri dendrit görüntüleme için monte ederken, önce baş kısmını ağız kancalarıyla, arka kısmı ise sparkles ile kesin. Keyifli bir hazırlık için.