Name: Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Öğrenin Drosophila embriyolarında embriyonik sinir sistemini görselleştirme yöntemini. Bu immünofloresan mikroskopi protokolü, gelişimsel nörobiyoloji araştırmalarında genetik mutasyonların etkilerini incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

SG, Buffalo New York Devlet Üniversitesi ve John R. Oishei Vakfı fonları tarafından desteklenmektedir.

1. Reaktiflerin hazırlanması <ol><li> 100 mM Borular, 2mm EGTA ve 1 mM MgSO 4 PEMFA Tampon kullanarak hazırlayın. Tamponun pH 7.0 'ye ayarlayın. PEMFA tampon filtresi sterilize ve 4 ° C'de saklanan </li><li> 1 ml ekleyerek PBT hazırlayın Triton X-100 100ml 1x PBS (fosfat tamponlu tuz) (pH 7.0). 4 ° C saklayınız </li><li> 1x PBS (pH 7.0)% 0.01 NaAcide ile% 5 BSA (sığır serum albumin) hazırlayın. </li><li> Salin solüsyonu% 0.7 NaCl ve% 0.03 deiyonize su Triton X-100 kullanarak hazırlayın. </li><li> 4 parça PEMFA tampon 1 kısım% 37 formaldehit ile birleştirerek fiksatif hazırlayın. </li></ol> 2. Embriyoların Toplanması <ol><li> &gt; 100 sinekler agar besleme plakası ile bir adaptör içeren bir plastik şişe koyarak ilgi Drosophila suşu için bir kafes hazırlayın. </li><li> Sinekler kafes acclimated olsun ve yumurta tutmayın ki, tabak değişen her 8-12 saat, 72 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta sinek kafes bırakın. </li><li> Deney, 12 saat boyunca embriyolar toplamak için. Konteyner Petri kabı çıkarın ve değiştirin. Çıkarılan Petri kabı alın ve yemeğin tuzlu çözüm ve temiz bir boya fırçası kullanarak kapalı embriyolar yıkayın. </li><li> Ince bir elekten embriyolar toplayın. Herhangi bir aşırı maya kaldırmak için tuzlu su ile durulayın. </li><li> Bir spatula ile yavaşça embriyoların pick up ve bir kap ile küçük cam şişe koyun. Yaklaşık 1 ml serum fizyolojik solüsyonu ekleyin. </li></ol> 3. Koryon ve vitellin Membranlar Kaldırma ve Fiksasyon <ol><li> Embriyo toplanması ardından,% 50 heptan ve% fiksatif 50 bir araya getirerek Heptan-Fix bir çözüm hazırlayın. Çözüm, üst ve alt kısmında bulunan fiksatif heptan katmanlı olacaktır. </li><li> Cam şişe, 5 dakika boyunca tuzlu bir çözüm onları kuluçka embriyolar yıkayın. Pasteur pipeti kullanarak aşırı tuzlu su çıkarın. </li><li> Embriyolar deiyonize su ile durulayın. </li><li> 3 dakika için% 50 çamaşır kuluçka embriyolar Dechorionate. </li><li> Embriyoların deiyonize su ile iyice durulayın. </li><li> 30 dakika nazik sallayarak Heptan-Fix çözümü için onları kuluçka embriyolar sabitleyin. </li><li> Pasteur pipeti kullanarak, metanol tüp heptan bırakarak sabitleştirici (alt tabaka) değiştirin. Vitellin zar kaldırmak için çalkalanır. Devitellinized embriyoların tüpün dibine batacaktır. </li><li> Pasteur pipeti kullanarak yeni bir cam flakon embriyolar toplayın. Embriyolar metanol ile beş kez çalkalayın, her zaman embriyolar 5 dakika inkübe edin. </li></ol> 4. Antikor Boyama, Montaj ve Görselleştirme <ol><li> % 50 PBT çözüm ve 5 dakika boyunca% 50 metanol karışımı embriyolar rehidrate. Sonra 5 dakika boyunca% 100 PBT çözüm rehidrate. </li><li> 4 1 saat süreyle% 0.01 NaAcide çözümü ° C ile% 5 BSA kuluçka embriyolar Blok </li><li> Embriyolar antikor boyama için hazır. % 0.01 NaAcide çözüm ile% 5 BSA kullanarak uygun konsantrasyona seyreltilmesi ile primer antikor hazırlayın. Biz sistein dize protein (CSP), veziküler sinaptik protein ve yüzey glikoprotein ve etiketleri bütün nöronlar bir nöron spesifik karbonhidrat benzer parçaları tanıyan bir anti-HRP veya at turp peroksidaz antikor, karşı bir antikor kullanın. </li><li> 4 geceleme embriyolar inkübe ° C birincil antikor çözümü. </li><li> Ertesi gün, bir saat boyunca PBT embriyoların 10 kez yıkayın. </li><li> Uygun konsantrasyona seyreltilmesi ikincil antikor çözüm hazırlayın. 1:200 bir konsantrasyon Alexa sekonder antikorlar kullanır. </li><li> Iki saat boyunca embriyolar 4 ° C'de ikincil antikor çözümü. </li><li> Bir saat boyunca embriyolar PBT 10 kez yıkayın. </li><li> Vectashield Montaj Orta geceleme embriyolar inkübe edin. </li><li> Bir bardak slayt Mount embriyoların ve oje ile kapak kayma mühür. Bir floresan mikroskop kullanılarak embriyolar görselleştirin. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1a.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1b.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> HRP-FITC <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1c.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Birleştirilmiş Şekil 1: CSP (kırmızı) ve HRP (yeşil) karşı antikorlar kullanılarak evre 16-17 embriyonik MSS gösteren Temsilcisi görüntüler. Komissür farklı boyama unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2a.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2b.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> HRP-FITC "/&gt; Birleştirilmiş Şekil 2: CSP (kırmızı) ve HRP (yeşil) karşı antikorlar kullanarak aşamada 16-17 embriyonik PNS gösteren bir temsili görüntüler. Periferik nöron tekrar eden desenler Not.

<ol><li>Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+sensory+organs+by+mutations+of+the+cut+locus+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster.</a> Cell. 51, 293-307 (1987).</li>
<li>Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+of+the+peripheral+nervous+system+in+Drosophila+embryos%3A+DNA+replication+patterns+and+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages.</a> Neuron. 3, 21-32 (1989).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer-Verlag. New York. (1985).</li>
<li>Carroll, S. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+fushi+tarazu+protein+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis.</a> Cell. 43, 47-57 (1985).</li>
<li>Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+connections+between+imaginal+discs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle connections between imaginal discs in Drosophila.</a> Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).</li>
</ol>

Drosophila embriyo nöronal gelişim sırasında hücresel ve moleküler değişiklikler araştırmak için güçlü bir sistem. Bu protokolde immünohistokimya için bütün montaj embriyoların nasıl hazırlanacağını göstermiştir. Biz bu protokolü Carroll ve Scott, 1985 yılında açıklanan protokol adapte var. Bu protokol aynı zamanda diğer nöronal antikor testi için adapte olabilir, ancak antikorlar optimizasyonu yapılmalıdır. Ayrıca, embriyonik PNS ve merkezi sinir sistemi gelişim kusurları, farklı mutant hatları embriyolar karş...

<table><tbody><tr><td>%37 formaldehit</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-25</td><td></td></tr><tr><td>CSP</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRP-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>323-095-021</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Keçi Anti-Fare IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Bağlama Ortamı</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

tüm montaj embriyonik sinir sistemi görselleştirme drosophila embriyolar

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Drosophila embriyo sinirsel gelişimi hücresel ve moleküler temelini araştırmak için çekici bir model sistem. Burada nöronal proteinler antikor kullanarak Drosophila Embriyonik sinir sisteminden görünüm için prosedürü açıklar. Tüm embriyonik periferik sinir ve merkezi sinir sistemi, tek tek hücrelerin (; Bodmer ve ark, 1987; Dambly-Chaudiere ve ark, 1986 Bodmer ve ark, 1989) bu yana, bu sistemleri herhangi bir sapmaları farklı nöronal proteinlere karşı antikorlar kullanarak kolayca tanımlanabilir. Gelişmekte olan embriyolar, embriyoların uygun görünüm için gelişim evreleri olduğundan emin olmak için belirli zamanlarda toplanır. Toplandıktan sonra, embriyonun dış katmanları, koryon zarı ve embriyo çevreleyen vitellin zarf, fiksasyon önce kaldırılır. Embriyolar sonra nöronal antikorlar ile inkübe edildi ve floresan etiketli sekonder antikorlar kullanılarak görüntülendi. Aşamada Embriyolar 12-17 Embriyonik sinir sistemine erişmek için görüntülendi. Evre 12 CNS germ bant kısaltılması başlar ve 15 sahne komissür kesin bir model elde edilmiştir. Evre 17 ile MSS sözleşmeleri ve PNS tamamen geliştirilmiştir (Campos-Ortega ve ark, 1985). Böylece PNS ve MSS desen değişiklikleri kolayca bu gelişim evrelerinde görülebilir.

Biz sahnelenen hazırlamak için prosedürü tarif<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyogenez sırasında embriyonik sinir sisteminin görünüm için embriyoların.

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

Drosophila embriyosu, nöronal gelişimin hücresel ve moleküler temellerinin araştırılması için cazip bir model sistemdir. Burada, ...'yı açıklıyoruz.

Bu prosedürün genel amacı, sinir sisteminin bütün mount görüntülemesi için oph ve melanogaster embriyolarını hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle ilgili sinek suşundan embriyoların toplanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, korionun çamaşır suyu ile uzaklaştırılmasıdır.Prosedürün üçüncü adımı, vilin membranını uzaklaştırmak için heptan ve metanol uygulamaktır. Prosedürün son adımı ise embriyolara antikorlar uygulamaktır. Nihayetinde, immunofloresan mikroskopi aracılığıyla drosophila embriyosu sinir sisteminin yapısını gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu yöntem, mutasyonların gelişmekte olan sinir sisteminde nasıl bir rol oynayabileceği gibi nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, embriyoları yanlışlıkla tüpten dışarı püskürtebildikleri için zorluk yaşayabilirler. Bu protokole P-E-M-F-A, %0,01 sodyum azit salin çözeltili %5 BSA içeren PBC tamponu ve formaldehit fiksatif dahil olmak üzere gerekli olan reaktifleri hazırlayarak başlayın.Sinekleri karbondioksit ile bayıltarak ve ardından en az 100 sineği, elma suyu agarlı besleme plakası içeren bir adaptöre sahip plastik bir şişeye aktararak ilgili

visualization-embryonic-nervous-system-whole-mount-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Drosophila melanogaster larvaları larva segmental sinirler içinde aksonal taşıma mekanizmalarının araştırılması için ideal bir model sistem sağlar. Bu yordamı kullanarak, 3. instar larvaları çeşitli mutasyonları taşıyan vahşi tip larva mukayese edilebilir.

3 Larvaların segmental sinirler Görselleştirme Rd Instar Drosophila Larvaların Hazırlıkları

VE Dik Görüntüleme Drosophila Embriyolar

Kaynak: Jeong, S. Drosophila'da embriyonik motor nöronların aksonal projeksiyon modelinin görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm.  (2017)Bu video, Drosophila embriyolarında aksonal projeksiyonların görselleştirilmesini göstermektedir. Motor nöronların immünoetiketlenmesi, nöronal yapıları ortaya çıkarmak için hassas diseksiyon ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu toplu olarak ayrıntılı nöronal mimariyi ortaya çıkararak aksonal projeksiyon paternlerini vurgular.

Drosophila'da Embriyonik Motor Nöronların Aksonal Projeksiyon Modellerinin Görselleştirilmesi

İmmün boyama, dokulardaki belirli hücre tiplerini ve proteinleri görselleştirmek için etkili bir tekniktir. Sonikasyonu kullanarak, burada açıklanan protokol, immünostainingden önce Drosophila melanogaster dokularını geç evre embriyolardan ve larvalardan ayırma ihtiyacını hafifletir. Formaldehitle sabitlenmiş bütün mount larvalarının immün boyaması için etkili bir metodoloji sunuyoruz.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Biz diseksiyon, tespit ve steroid hormon biyosentezi ve düzenleyici mekanizma çalışmaya Drosophila larvaları ve yetişkin kadınlarda Sterpidojenik organların immün için bir protokol açıklar. steroidojenik organlara ek olarak, böyle germ çizgili kök hücreleri gibi steroidojenik organların innervasyon olarak steroidojenik hedef hücreleri görselleştirmek.

Sineği boyanmasına ile steroidogenik organları ve İnteraktif Organlar görselleştirme için Protokoller<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya yöntemini ayrıntılarıyla anlatıyor . FasII antikoru ile lekelenmiş sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve sinirsel gelişim sırasında hedef tanıma için gerekli genlerin karakterize edilmesi için güçlü bir araç sağlar.

Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi<em&gt; Drosophila</em

Bu iletişim kuralı diseksiyon ve yetişkin Drosophila melanogaster immunostaining açıklar beyin dokuları. Özellikle, bu iletişim kuralı doğru nöronal gelişim birçok yönlerini temel genel prensipler ortaya çıkarmak için kullanılabilecek örnek nöronal alt kümeleri olarak Drosophila mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanımı vurgulamaktadır.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Biz lipophilic floresan boyalar kullanarak Drosophila embriyonik motor nöronların retrograd izleme için bir yöntem açıklar.

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

Bu protokol, larva ve yetişkin Drosophila optik loblarını görüntüleme için hazırlamak için üç adımı tanımlar: 1) beyin diseksiyonları, 2) immünohistokimya ve 3) montaj. Belirli optik lob yapılarını görselleştirmek için farklı montaj yönleri gerektiğinden, adım 3'e vurgu yapılır.

Optik lob görselleştirmesi için larva ve erişkin drosophila beyinlerinin diseksiyonu, immünohistokimyası ve montajı

Burada, geç embriyonik Drosophila erkek gonadını canlı olarak görüntülemek için gerekli bir diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu protokol, normal koşullar altında veya transgenik veya farmakolojik manipülasyondan sonra dinamik hücresel süreçlerin gözlemlenmesine izin verecektir.

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

Öğrenin Drosophila embriyolarında embriyonik sinir sistemini görselleştirme yöntemini. Bu immünofloresan mikroskopi protokolü, gelişimsel nörobiyoloji araştırmalarında genetik mutasyonların etkilerini incelemeye yardımcı olur.

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

Daha fazla video keşfet