Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

Bu prosedürün genel amacı, sinir sisteminin tüm mount görselleştirmesi için oph ve melanogaster embriyolarını hazırlamaktır. Bu, ilk önce ilgilenilen sinek suşundan embriyoların toplanmasıyla gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, corium'u çamaşır suyu ile çıkarmaktır.

Prosedürün üçüncü adımı, vilin zarını çıkarmak için heptan ve metanol uygulamaktır. İşlemin son adımı, embriyolara antikor uygulamaktır. Sonuçta, immünofloresan mikroskobu ile drosophila embriyo sinir sisteminin yapısını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, gelişmekte olan sinir sisteminde mutasyonların nasıl bir rol oynayabileceği gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, yanlışlıkla embriyoları flakondan çıkarabilecekleri için mücadele edeceklerdir. Bu protokole, P-E-M-F-A, tampon PBC %5 BSA, %0.01 sodyum azid salin çözeltisi ve formaldehit fiksatif dahil olmak üzere ihtiyaç duyulacak reaktifleri hazırlayarak başlayın.

Sinekleri karbondioksit ile bayıltarak ve ardından en az 100 sineği elma suyu agar besleme plakalı bir adaptör içeren plastik bir şişeye aktararak ilgilenilen drosophila türü için bir kafes hazırlayın. Sinek kafesini karanlıkta 72 saat oda sıcaklığında bekletin. Elma suyu agar besleme plakalarını her sekiz ila 12 saatte bir değiştirin, böylece sinekler kafese alışır ve deney için yumurtalarını tutmazlar.

72 saatlik alışma süresinden sonra, elma suyu agar besleme plakasındaki son değişiklikten 12 saat sonra embriyoları toplayın. Elma suyu agar besleme plakasını döşeme kafesinden çıkarın ve tuzlu su çözeltisi kullanarak değiştirin. Elma suyu agar besleme plakasını durulayın.

Embriyoları ince bir elek içinde toplayın. Plakaya yapışmış kalan embriyoları çıkarmak için temiz bir boya fırçası kullanın. Bir spatula kullanarak fazla mayayı çıkarmak için elekteki embriyoları tuzlu su ile durulayın, embriyoları nazikçe alın ve küçük bir cam şişeye yerleştirin.

Yaklaşık bir mililitre tuzlu su çözeltisi ekleyin. Daha sonra şişeyi kapatın ve embriyoları yıkamak için beş dakika inkübe edin. Embriyoların toplanmasını takiben.

% 50 heptan ve% 50 fiksatifi birleştirerek heptan sabit çözeltisini hazırlayın. Çözelti üstte heptan ve altta fiksatif ile katmanlanacaktır. Beş dakika geçtikten sonra, embriyoların cam şişesinden fazla salini çıkarmak için bir makarna pipeti kullanın.

Embriyoların bulunduğu cam şişeye yaklaşık bir mililitre deiyonize su uygulayarak embriyoları deiyonize su ile durulayın. Suyu %50 ağartma solüsyonunda çıkarmadan önce embriyoların bir dakika oturmasına izin verin. Şişeyi elinizle birkaç kez çalkalayın ve ardından embriyoları kaplamak için üç dakika inkübe edin.

Elde edilen embriyolar flakonun dibine çökecektir. Embriyonik COR'lar yüzecek. Üç dakikalık inkübasyondan sonra ağartıcıyı ve COR'ları çıkarın.

Süslemeyi takiben, embriyoları içeren cam şişeye yaklaşık bir mililitre deiyonize su uygulayarak embriyoları deiyonize su ile iyice durulayın. Suyu çıkarmadan önce embriyoların bir dakika oturmasına izin verin, artık COR'lar yüzer ve çıkarılmalıdır. Heptan fiks solüsyonunu embriyolara ekleyin ve fiksasyondan sonra sabitlemek için hafifçe sallayarak 30 dakika inkübe edin.

Alt tabaka olan fiksatifi çıkarmak için bir makarna pipeti kullanın ve heptanı tüpte bırakın. Daha sonra, fiksatif yerine tüpün dibine tekrar metanol ekleyin ve vitellin membranını çıkarmak için tüpü elle kuvvetlice sallayarak kapatın. Bu aşamayı takiben, üretilen embriyolar tüpün dibine kadar batacaktır.

Bir makarna pipeti kullanarak, deiyonize embriyoları geride bırakarak metanolü ve hets'i şişeden çıkarın. Daha sonra embriyoları beş kez metanol ile durulayın, her durulama arasında metanolü bir makarna pipeti ile çıkarın. Her durulama için embriyoları beş dakika inkübe edin.

Embriyoları yeniden sulandırmak için beş dakika boyunca %50 PBT çözeltisi ve %50 metanol karışımına yerleştirin. Ardından, bunları beş dakika boyunca% 100 PBT çözeltisine aktararak rehidrasyon işlemine devam edin. Daha sonra, embriyoları dört santigrat derecede bir saat boyunca% 0.01 sodyum azid çözeltisi ile% 5 BSA içinde inkübe ederek bloke edin.

Daha sonra, embriyo boyama için birincil antikoru, %0.01 Sodyum azid çözeltisi ile% 5 BSA kullanarak uygun konsantrasyona seyrelterek hazırlayın. Burada kullanılan antikorlar veziküler sistein string proteinine ve anti HRP antikoruna yöneliktir. Anti HRP, tüm nöronları etiketleyen yüzey glikoproteinlerinde bulunan nöral spesifik bir karbonhidrat parçasını tanır.

Embriyoları gece boyunca birincil antikor çözeltisinde dört santigrat derecede inkübe edin. Embriyoları bir saat boyunca PBT ile 10 kez yıkayın. Embriyoları içeren cam şişeye yaklaşık bir mililitre PBT uygulayarak, PBT'yi çıkarmadan önce embriyoların altı dakika oturmasına izin verin.

PBT uygulama, inkübe etme ve PBT'yi çıkarma işlemini 10 kez tekrarlayın. İkincil antikor çözeltisini karanlıkta hazırlayın çünkü uygun konsantrasyona seyreltilerek ışığa duyarlıdır. Alexa ikincil antikorlarını bir ila 200 konsantrasyonda kullanıyoruz.

Embriyoları ikincil antikor çözeltisinde dört santigrat derecede iki saat boyunca inkübe edin. Işığa maruz kalmayı önlemek için embriyoların cam şişesini ve ikincil antikor solüsyonunu alüminyum folyoya sarın. Embriyoları bir saat boyunca PBT ile 10 kez yıkayın.

Embriyolara vektör kalkanı montaj ortamı ekleyin ve monte etmek için gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Embriyoları montaj ortamının bir kısmı ile birlikte emmek için pastel bir pipet kullanın. Embriyoları ve ortamı bir cam slayta uygulayın.

Embriyoların üzerine bir kapak fişi uygulayın ve kapak fişini oje ile kapatın. Burada bir Floresan mikroskobu kullanarak embriyoları görselleştirin. Embriyonik CNS evre 16 ila 17'de gösterilir.

Sistin sicim proteini kırmızı ile gösterilmiştir. HRP nöronları yeşil renkle gösterilmiştir. Bu temsili görüntüdeki komisyonun belirgin şekilde boyanmasına dikkat edin.

Embriyonik PNS, evre 16 ila 17'de gösterilir. Yine sistin sicim proteini kırmızı renkle, nöronlar ise yeşil renkle gösterilmiştir. Periferik nöronların tekrarlanan modellerine dikkat edin.

Bu prosedürü denerken, yanlışlıkla flakondan çıkarmamak için embriyolara dikkat etmek önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, sinir sisteminin tüm montaj görselleştirmesi için oph fla embriyolarının nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.