Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

Bu prosedürün genel amacı, oph ve melanogaster embriyolarını sinir sisteminin bütün montaj görüntülemesi (whole mount visualization) için hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle ilgili sinek suşundan embriyoların toplanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise korionun çamaşır suyu ile uzaklaştırılmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı, vilin membranını uzaklaştırmak için heptan ve metanol uygulamaktır. Prosedürün son adımı ise embriyolara antikorların uygulanmasıdır. Nihayetinde, immunofloresans mikroskobu aracılığıyla drosophila embriyosu sinir sistemi yapısını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, mutasyonların gelişmekte olan sinir sisteminde nasıl bir rol oynayabileceği gibi nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genellikle, bu yönteme yeni başlayan kişiler, embriyoları yanlışlıkla şişeden dışarı püskürtebildikleri için zorluk yaşayabilirler. Bu protokole P-E-M-F-A, %0,01 sodyum azid içeren %5 BSA'lı PBC tamponu tuz çözeltisi ve formaldehit fiksatifi dahil olmak üzere ihtiyaç duyulacak reaktifleri hazırlayarak başlayın.

Sinekleri karbondioksit ile bayıltarak ve ardından en az 100 sineği, elma suyu agar besleme plakalı bir adaptör içeren plastik bir şişeye aktararak ilgili drosophila suşu için bir kafes hazırlayın. Sinek kafesini oda sıcaklığında, karanlıkta 72 saat boyunca bekletin. Sineklerin kafese alışmaları ve deney için yumurtalarını tutmamaları amacıyla, elma suyu agar besleme plakalarını her sekiz ila 12 saatte bir değiştirin.

72 saatlik aklimasyon süresinin ardından, elma suyu agar besleme plağındaki son değişimden 12 saat sonra embriyoları toplayın. Elma suyu agar besleme plağını yumurtlama kafesinden çıkarın ve salin solüsyonu kullanarak değiştirin. Elma suyu agar besleme plağını durulayın.

Embriyoları ince bir süzgeçle toplayın. Plakaya yapışık kalan embriyoları yerinden çıkarmak için temiz bir resim fırçası kullanın. Süzgeçteki embriyoları salin ile durulayın; fazla mayayı uzaklaştırmak için bir spatula yardımıyla embriyoları nazikçe alın ve küçük bir cam şişeye yerleştirin.

Yaklaşık bir mililitre salin çözeltisi ekleyin. Ardından, embriyoları yıkamak için flakonu kapatın ve beş dakika inkübe edin. Embriyoların toplanmasının ardından.

%50 heptan ve %50 fiksatifi birleştirerek heptan fiksasyon çözeltisini hazırlayın. Çözelti, üstte heptan ve altta fiksatif olacak şekilde tabakalanacaktır. Beş dakika geçtikten sonra, embriyoların bulunduğu cam şişedeki fazla salini uzaklaştırmak için bir pasta pipeti kullanın.

Embriyoların bulunduğu cam tüpe yaklaşık bir mililitre deiyonize su ekleyerek embriyoları durulayın. Suyu %50'lik çamaşır suyu çözeltisi ile uzaklaştırmadan önce embriyoları bir dakika bekletin. Tüpü elinizle birkaç kez çalkalayın ve ardından embriyoların kaplanması için üç dakika inkübe edin.

İşlem görmüş embriyolar tüpün dibine çökecektir. Embriyonik COR'lar ise yüzeyde kalacaktır. Üç dakikalık inkübasyonun ardından çamaşır suyunu ve COR'ları uzaklaştırın.

Dekorasyon işleminin ardından, embriyoların bulunduğu cam şişeye yaklaşık bir mililitre deiyonize su ekleyerek embriyoları deiyonize su ile iyice durulayın. Suyu uzaklaştırmadan önce embriyoları bir dakika boyunca bekletin; geri kalan COR'lar yüzeye çıkacaktır ve bunlar uzaklaştırılmalıdır. Embriyolara heptan tespit çözeltisini ekleyin ve tespit işlemini gerçekleştirmek için hafifçe çalkalayarak 30 dakika inkübe edin.

Alt tabaka olan tespit ediciyi uzaklaştırmak için bir pasta pipeti kullanın ve heptanı tüpün içinde bırakın. Ardından, tespit edicinin yerine tüpün altına metanol ekleyin, tüpü kapatın ve vitellin membranını uzaklaştırmak için elinizle kuvvetlice çalkalayın. Bu adımın ardından, çözünmüş embriyolar tüpün dibine çökecektir.

Bir pasta pipeti kullanarak metanolu ve kalıntıları flakondan uzaklaştırın ve deinize embriyoları geride bırakın. Ardından embriyoları beş kez metanol ile durulayın ve her durulama arasında metanolu bir pasta pipetiyle çekerek uzaklaştırın. Her durulama işlemi için embriyoları beş dakika boyunca inkübe edin.

Embriyoları rehidre etmek için beş dakika boyunca %50 PBT çözeltisi ve %50 metanol karışımına yerleştirin. Ardından, embriyoları beş dakika boyunca %100 PBT çözeltisine aktararak rehidrasyon işlemine devam edin. Son olarak, embriyoları 4 °C'de bir saat boyunca %0,01 sodyum azid içeren %5 BSA çözeltisinde inkübe ederek bloklama işlemini gerçekleştirin.

Ardından, primer antikoru %0,01 Sodyum azid içeren %5 BSA çözeltisi kullanarak uygun konsantrasyona seyrelterek embriyo boyama için hazırlayın. Burada kullanılan antikorlar, veziküler sistein string proteinine ve anti HRP antikoruna yöneliktir. Anti HRP, yüzey glikoproteinlerinde bulunan ve tüm nöronları işaretleyen nöronal spesifik bir karbonhidrat kısmını tanır.

Embriyoları bir gece boyunca dört °C'de primer antikor çözeltisi içerisinde inkübe edin. Embriyoları bir saat boyunca 10 kez PBT ile yıkayın. Embriyoları içeren cam şişeye yaklaşık bir mL PBT ekleyerek, PBT'yi uzaklaştırmadan önce embriyoların altı dakika boyunca beklemesini sağlayın.

PBT uygulama, inkübasyon ve PBT'nin uzaklaştırılması işlemini 10 kez tekrarlayın. Işığa duyarlı olduğu için sekonder antikor çözeltisini uygun konsantrasyona seyrelterek karanlıkta hazırlayın. Alexa sekonder antikorlarını 1/200 konsantrasyonda kullanıyoruz.

Embriyoları, sekonder antikor solüsyonu içerisinde dört derece Celsius'ta iki saat boyunca inkübe edin. Işığa maruz kalmasını önlemek için embriyoların ve sekonder antikor solüsyonunun bulunduğu cam şişeyi alüminyum folyo ile sarın. Embriyoları bir saatlik süre boyunca PBT ile 10 kez yıkayın.

Embriyoları sabitlemek için üzerlerine vector shield montaj medyumu ekleyin ve dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Embriyoları, bir miktar montaj medyumu ile birlikte çekmek için pastör pipeti kullanın. Embriyoları ve medyumu bir lam üzerine uygulayın.

Embriyoların üzerine bir lamella yerleştirin ve lamellayı oje ile mühürleyin. Embriyoları burada bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Embriyonik MSS, 16 ila 17. evrede gösterilmiştir.

Sistin dizisi proteini kırmızı renkle gösterilmiştir. HRP nöronları yeşil renkle gösterilmiştir. Bu temsili görüntüde komissürün belirgin boyanmasına dikkat edin.

Embriyonik PNS, 16 ile 17. evrelerde gösterilmiştir. Yine, sistin string proteini kırmızıyla, nöronlar ise yeşille gösterilmiştir. Periferik nöronların tekrarlayan modellerine dikkat edin.

Bu prosedür uygulanırken, embriyoların yanlışlıkla tüpten çıkarılmaması için onlara karşı dikkatli olmak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, sinir sisteminin bütün mount görselleştirmesi için oph fla embriyolarının nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.