Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi Drosophila

Bu deneyin genel amacı, Drosophila melanogaster'in geç evre embriyolarında motor nöron projeksiyon modellerini analiz etmektir. Bu yöntem, motor akson rehberliği ve nöral subcu oluşumu gibi nöral gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gelişmekte olan embriyolarda motor aksonun hassas bir şekilde görselleştirilmesini sağlamasıdır, bu da aksonal yol bulmanın güvenilir bir şekilde analiz edilmesine ve durum kusurunun hedeflenmesine olanak tanır.

Kurulduktan bir gün sonra, yumurta toplama plakaları, bir miktar taze yapılmış maya ezmesi içeren plakaları yenileriyle değiştirin. Taze tabaklarda üç saat geçirdikten sonra, sinekleri yeni yiyecek şişelerine aktarın. Ve yumurta plakalarını gece boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin.

Sabahları plakalara 1,8 mililitre PBT çözeltisi ekleyin. Ve embriyoları çıkarmak için pamuklu bir bez kullanın. Daha sonra, 1 mililitrelik bir pipet kullanarak, embriyoları ve çözeltiyi bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Embriyolar dibe çöktüğünde, mümkün olduğunca fazla çözelti aspire edin. Daha sonra durulama başına bir mililitre PBT kullanarak embriyoları iki kez durulayın. Embriyoları decoreonate etmek için, son durulamayı bir mililitre% 50 çamaşır suyu ile değiştirin ve tüpü oda sıcaklığında üç dakika boyunca sallayın.

Ağartıcıyı çıkarmak için embriyoları PBT ile üç kez durulayın. Ardından, son durulamayı yarım mililitre% 100 heptan ve yarım mililitre% 4 paraformaldehit ile değiştirin. Şimdi, embriyoları hafifçe sallayarak 15 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, alttaki çözelti katmanını çıkarın ve 500 mikrolitre %100 metanol geri ekleyin. Şimdi, 30 saniye boyunca, embriyoları devitellinize etmek için tüpü kuvvetlice çalkalayın. Ardından, üstteki çözeltiyi çıkarın, 500 mikrolitre %100 metanol ekleyin ve tüpü 10 saniye daha çalkalayın.

Tüpü çalkaladıktan sonra, embriyoların yerleşmesine ve mümkün olduğunca fazla çözeltiyi çıkarmasına yardımcı olmak için hafifçe vurun. Daha sonra, embriyoları% 100 metanol ile kısaca durulayın. Daha sonra embriyoları hemen PBT ile üç kez durulayın.

Şimdi, embriyoları bir mililitre taze PBT'de yeniden süspanse edin. Ve embriyoları LacZ boyamaya hazırlamak için 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Embriyolar inkübe edilirken, bir mililitrelik X-gal boyama çözeltisi hazırlayın.

Alikotu 65 santigrat derece su banyosunda hava bulanıklaşana kadar ısıtın. Ardından 37 santigrat derecelik bir ısı bloğuna aktarın. Embriyolar 15 dakika ısıtıldıktan sonra, PBT solüsyonunu çıkarın ve bir mililitre alikot boyama solüsyonu ile değiştirin.

Ardından 20 mikrolitre X-gal substrat ekleyin. Yaklaşık iki ila dört saat boyunca, tüpü 37 santigrat derecede mavi bir çökelti oluşana kadar hafifçe sallayarak inkübe edin. Daha sonra boyama solüsyonunu çıkarın ve embriyoları oda sıcaklığında PBT ile üç kez durulayın.

Durulamalardan sonra, embriyoları diseksiyon mikroskobu altında elle sıralamak için bir iğne probu veya forseps kullanın. İlgilenilen lekeli embriyoları bir mililitrelik pipet kullanarak yarım milimetrelik bir mikro santrifüj tüpüne toplayın. Daha sonra, seçilen embriyoları 0.4 mililitre PBT ile yıkayın.

Daha sonra, PBT'yi 0.3 mililitre bloke edici solüsyonla değiştirin ve embriyoların 15 dakika boyunca hafif çalkalama ile inkübe etmesine izin verin. 15 dakika sonra, 75 mikrolitre birincil antikor ekleyin ve gece boyunca inkübasyona devam edin. Ertesi sabah, embriyoları PBT ile yaklaşık iki saat yıkayın ve yıkama solüsyonunu yaklaşık 30 dakikada bir değiştirin.

Yıkamadan sonra, ikincil antikoru içeren 0.3 mililitre bloke edici çözelti ekleyin ve tüpü gece boyunca oda sıcaklığında hafifçe sallayarak inkübe edin. Ertesi sabah, embriyoları PBT ile yaklaşık üç saat yıkayın. Yıkama süresi boyunca PBT'yi en az beş kez değiştirin.

Yıkamadan sonra, embriyoları 0.3 mililitre dab çözeltisinde tekrar süspanse edin ve iki mikrolitre% 3 hidrojen peroksit ekleyin. Ardından, yeterli çökelti oluşana kadar oda sıcaklığında hafifçe sallanarak karanlıkta inkübe edin. Bu genellikle 30 ila 60 dakika sürer.

Daha sonra, embriyoları PBT ile dört kez durulayın ve 0.2 mililitre montaj solüsyonunda tekrar süspanse edin. Şimdi, embriyoların karanlıkta 4 santigrat derecede dengelenmesine izin verin. Embriyoları fileto yapmak için, onları bir cam slayt üzerinde sahneleyin.

Önce onları ventral tarafı yukarı bakacak şekilde bir damla gliserol içine alın. Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında, ön kısmı ve vücut uzunluğunun 1 / 4'ünü kesin ve motor aksonları olmayan en arka bölgeyi çıkarın. Şimdi, bir iğne probu kullanarak, preparasyonu gliserolden çıkarın, sırt tarafı yukarı bakacak şekilde hareket ettirin ve görüş alanında yatay olarak konumlandırın.

Bir sonraki adım, bir iğne probunun içi boş bölgesine yerleştirilmiş ve daha sonra sonunda bükülmüş ince bir tungsten iğnesi gerektirir. Tungsten iğnesini kullanarak, embriyonun arka ucunda küçük bir kesi yapın ve dorsal orta hattı kesmeye devam edin. Diseksiyon sırasında tungsten iğnesinin ucunun cam sürgünün yüzeyine temas etmediğinden emin olun, çünkü iğne cama kolayca bükülecektir.

Daha sonra, prob ile geri dönüş hazırlığı gliserol damlasına geri dönün ve sırt tarafı yukarı gelecek şekilde konumlandırın. Orada, her vücut duvarını ventral-lateral yönde açarak bağırsağı vücut duvarından ayırın. İki vücut duvarı birbirinden ayrılmalıdır.

Şimdi probu kullanarak, gövde duvarı kanatlarını dikkatlice bir cam kızak üzerine hareket ettirin. Slaytta, iç organları yanlamasına iterek çıkarmak için bir tungsten iğnesi kullanın. Tungsten iğnesini stabilize etmek ve hasar görmesini önlemek için, içi boş iğneyi problu tutun ve tungsten iğnesini manipüle ederken tungsten iğnesini cam sürgünün yüzeyine karşı tutun.

Şimdi, hazırlıkları sekiz mikrolitre montaj solüsyonuna yeni bir cam slayt üzerine monte edin. Bir kapak fişi takın ve kenarları normal oje ile kapatın. Ardından, DIC optiklerini kullanarak yüksek çözünürlükte görüntüler yakalayın.

Tarif edilen yöntem kullanılarak, evre 16 embriyolar Fas2 antikoru ile boyandı ve motor nöronların ve abdominal hemi segmentleri A3 ve A4'ün görüntülenmesi için hazırlandı. Normalde, en az yedi motor nöron, bir ISNb sinir dalı oluşturmak için aksonlarını uzatır ve fasiküle eder. Çevredeki birçok sinir demeti de bu preparatta tanımlanabilirdi. Segmentler arası sinir demeti kas 6 ve 7'deki seçim noktasına ulaştığında, iki akson seçici olarak kasları 6 ve 7'yi fasiküle eder ve enerjize eder.

Aynısı, demet dorsal olarak uzanırken diğer seçim noktalarında da meydana gelir. Daha sonra, son seçim noktasında, iki akson kas 12'yi güçlendirir. Buna karşılık, Sema-1a mutant embriyolarında aynı aksonlar seçim noktalarında defasciküle olmazlar.

Sema-1 aegean ürününün nöral gelişim sırasında motor aksonlar ve hedef kaslar arasında bağlantı kurmaya yardımcı olduğu bilindiği için bu beklenmedik bir durum değildir. Bu nedenle, açıklanan yöntem mutant fenotipleri analiz etmek için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, istenen mutant embriyoların nasıl sıralanacağını, motor nöronların aksonal projeksiyon paternlerinin nasıl immün boyayacağını ve düz hazırlık için sabit embriyoların nasıl inceleneceğini iyi anlamış olmalısınız.