Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi

Bu deneyin genel amacı, Drosophila melanogaster'in geç evre embriyolarındaki motor nöron projeksiyon modellerini analiz etmektir. Bu yöntem, motor akson yönlendirmesi ve nöral subcu oluşumu gibi nöral gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gelişmekte olan embriyolardaki motor aksonların hassas bir şekilde görselleştirilmesini sağlamasıdır; bu da aksonal yol bulma süreçlerinin ve hedefleme kusurlarının güvenilir bir şekilde analiz edilmesine olanak tanır.

Yumurta toplama plakaları kurulduktan bir gün sonra, plakaları taze hazırlanmış maya pastası içeren yeni plakalarla değiştirin. Taze plakalarda üç saat beklettikten sonra, sinekleri yeni besin şişelerine aktarın. Ve yumurta plakalarını 25 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Sabah saatlerinde, plakalara 1.8 milliliters PBT solüsyonu ekleyin. Embriyoları yerinden çıkarmak için bir pamuklu çubuk kullanın. Ardından, 1 milliliter pipet kullanarak embriyoları ve solüsyonu bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Embriyolar dibe çöktüğünde, mümkün olduğunca çok solüsyonu aspire edin. Ardından embriyoları, her durulama için bir mililitre PBT kullanarak iki kez durulayın. Embriyoları dekoreone etmek için, son durulama işlemini bir mililitre %50 çamaşır suyu ile değiştirin ve tüpü oda sıcaklığında üç dakika boyunca sallayın.

Çamaşır suyunu uzaklaştırmak için embriyoları üç kez PBT ile yıkayın. Ardından, son yıkama işleminin yerine yarım mililitre %100 heptan ve yarım mililitre %4 paraformaldehit ekleyin. Şimdi, embriyoları hafifçe sallayarak 15 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, alttaki solüsyon tabakasını uzaklaştırın ve tekrar 500 µL %100 methanol ekleyin. Embriyoları devitellinize etmek için tüpü 30 saniye boyunca kuvvetlice çalkalayın. Ardından, üstteki solüsyonu uzaklaştırın, tekrar 500 µL %100 methanol ekleyin ve tüpü 10 saniye daha çalkalayın.

Tüpü salladıktan sonra, embriyoların çökmesine yardımcı olmak için tüpe hafifçe vurun ve mümkün olduğunca fazla solüsyonu uzaklaştırın. Ardından, embriyoları kısa süreliğine %100 methanol ile yıkayın. Son olarak, embriyoları derhal üç kez PBT ile yıkayın.

Şimdi, embriyoları bir mililitre taze PBT içinde yeniden süspanse edin. Embriyoları LacZ boyamasına hazırlamak için 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Embriyolar inkübe olurken, bir mililitrelik X-gal boyama çözeltisi alikotu hazırlayın.

Alikotu, bulanıklaşana kadar 65 °C'lik bir su banyosunda ısıtın. Ardından 37 °C'lik bir ısıtma bloğuna aktarın. Embriyolar 15 dakika boyunca ısıtıldıktan sonra PBT çözeltisini uzaklaştırın ve yerine 1 mL'lik boyama çözeltisi alikotunu ekleyin.

Ardından 20 µL X-gal substratı ekleyin. Mavi bir çökelek oluşana kadar tüpü 37 °C'de, hafifçe sallayarak yaklaşık iki ila dört saat inkübe edin. Daha sonra boyama solüsyonunu uzaklaştırın ve embriyoları oda sıcaklığındaki PBT ile üç kez durulayın.

Durulama işlemlerinden sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında embriyoları bir iğne probu veya penset kullanarak el ile ayıklayın. İlgilenilen boyanmış embriyoları, bir mililitrelik bir pipet kullanarak yarım milimetrelik bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın. Ardından, seçilen embriyoları 0.4 mL PBT ile yıkayın.

Ardından, PBT'yi 0,3 milliliters bloklama çözeltisi ile değiştirin ve embriyoların hafif ajitasyon altında 15 dakika boyunca inkübe edilmesini sağlayın. 15 dakika sonra, 75 microliters primer antikor ekleyin ve inkübasyona gece boyunca devam edin. Ertesi sabah, yıkama çözeltisini yaklaşık her 30 dakikada bir değiştirerek embriyoları yaklaşık iki saat boyunca PBT ile yıkayın.

Yıkama işleminden sonra, sekonder antikor içeren 0.3 mililitre bloklama çözeltisi ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında, gece boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin. Ertesi sabah, embriyoları yaklaşık üç saat boyunca PBT ile yıkayın. Yıkama süresince PBT'yi en az beş kez değiştirin.

Yıkama işleminden sonra, embriyoları 0,3 mililitre dab çözeltisi içinde yeniden süspande edin ve iki mikrolitre %3 hidrojen peroksit ekleyin. Ardından, yeterli çökelek oluşana kadar oda sıcaklığında, hafifçe sallayarak karanlıkta inkübe edin. Bu işlem genellikle 30 ila 60 dakika sürer.

Ardından, embriyoları dört kez PBT ile durulayın ve 0,2 mililitre mount çözeltisi içinde yeniden süspande edin. Şimdi, embriyoların 4 °C'de karanlıkta dengelenmesini sağlayın. Embriyoları filete etmek için onları bir lam üzerine yerleştirin.

Öncelikle onları, ventral tarafı yukarı gelecek şekilde bir gliserol damlasına taşıyın. Ardından, bir diseksiyon mikroskobu altında, ön kısmı ve vücut uzunluğunun 1/4'ünü kesin ve motor aksonların bulunmadığı en arka bölgeyi çıkarın. Şimdi, bir iğne probu kullanarak preparatı gliserolden çıkarın, dorsal tarafı yukarı gelecek şekilde yönlendirin ve görüş alanına yatay olarak yerleştirin.

Bir sonraki adım, bir iğne probunun boşluklu bölgesine yerleştirilmiş ve ardından ucu bükülmüş ince bir tungsten iğne gerektirir. Tungsten iğneyi kullanarak, embriyonun posterior ucunda küçük bir kesi yapın ve dorsal orta hat boyunca kesmeye devam edin. Diseksiyon sırasında tungsten iğnenin ucunun cam lamın yüzeyine değmediğinden emin olun, çünkü iğne cam yüzeye çarptığında kolayca bükülecektir.

Ardından, prob ile örneği gliserol damlasına geri getirip sırt kısmı yukarı gelecek şekilde konumlandırın. Burada, her bir vücut duvarını ventral-lateral yönde açarak bağırsakları vücut duvarından ayırın. İki vücut duvarı birbirinden ayrılmalıdır.

Şimdi probu kullanarak, vücut duvarı fleplerini dikkatlice bir lam üzerine taşıyın. Lam üzerinde, iç organları yanlara doğru iterek uzaklaştırmak için bir tungsten iğne kullanın. Tungsten iğneyi sabitlemek ve zarar görmesini önlemek için, içi boş iğneyi prob durumunda tutun ve tungsten iğne ile işlem yaparken iğneyi cam lamın yüzeyine yaslayarak destekleyin.

Şimdi, preparatları yeni bir lam üzerine sekiz µL mount çözeltisi ile yerleştirin. Bir lamelle kapatın ve kenarları standart oje ile mühürleyin. Ardından, DIC optikleri kullanarak yüksek çözünürlükte görüntüler yakalayın.

Tanımlanan yöntem kullanılarak, 16. evre embriyolar Fas2 antikoru ile boyanmış ve motor nöronlar ile A3 ve A4 abdominal hemi-segmentlerinin görüntülenmesi için hazırlanmıştır. Normalde, en az yedi motor nöron, bir ISNb sinir dalı oluşturmak üzere aksonlarını uzatır ve fasiküle eder. Bu preparasyonda çevredeki birçok sinir demeti de tanımlanabilmiştir. İntersegmental sinir demeti, 6 ve 7. kaslardaki seçim noktasına ulaştığında, iki akson seçici olarak defasiküle olur ve 6 ile 7. kasları innerve eder.

Demet dorsal yönde uzandıkça diğer seçim noktalarında da aynı durum gerçekleşir. Ardından, son seçim noktasında iki akson kas 12'yi innerve eder. Buna karşılık, Sema-1a mutant embriyolarda aynı aksonlar seçim noktalarında defasiküle olamazlar.

Sema-1 aegean ürününün nöral gelişim sırasında motor aksonlar ile hedef kaslar arasında bağlantıların kurulmasına yardımcı olduğu bilindiğinden bu durum beklenmedik değildir. Bu nedenle, açıklanan yöntem mutant fenotiplerini analiz etmek için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, istenen mutant embriyoların nasıl ayrıştırılacağı, motor nöronların aksonal projeksiyon paternlerinin nasıl immünboyanacağı ve düzleştirme preparatı için fikse edilmiş embriyoların nasıl diseke edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.