Mekanik Homojenizasyon ile Bir Fare Beyninden Birden Fazla Hücre Tipinin İzolasyonu

Doku öğütücü bileşenlerini buzun üzerine yerleştirerek başlayın. Bu cihaz bir harç ve farklı çaplarda iki havaneli içerir.

Harcın içine soğutulmuş bir tuz tamponu dökün ve ardından fare beyin dokusunu ekleyin.

Tampon, hücre yapısını ve işlevini koruyarak ozmotik dengeyi korur.

Dokuyu mekanik olarak daha küçük parçalara ayıran daha küçük çaplı havaneli kullanarak dokuyu birden fazla yumuşak vuruşla öğütün.

Daha sonra, daha büyük çaplı havaneli ile vurun, dokunun bileşen hücrelerine daha fazla parçalanmasını kolaylaştırır.

Karışımı bir tüpe aktarın ve santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarın.

Soğutulmuş tuz tamponu ekleyin ve hücre kümelerini ve miyelini kırmak için girdap yapın.

Ardından, bir yoğunluk gradyan ortamı ve santrifüj ekleyin.

Şekil ve kütle farklılıkları nedeniyle, hücreler alt tabakaya yerleşirken, döküntü ve miyelin üst tabakada birikir.

Süpernatanı atın.

Daha fazla kullanım için çok hücreli bir süspansiyon elde etmek için uygun bir çözelti ekleyin.

Doku homojenizasyonu için, bir Dounce doku öğütücünün önceden soğutulmuş cam harcına 3 mililitre önceden soğutulmuş HBSS ekleyin ve hasat edilen beynin yarısını harca aktarın. Dokuyu 10 vuruş havaneli A, ardından 10 vuruş havaneli B ile nazikçe yumuşatın ve homojenize karışımı 15 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın.

Tüpü santrifüjleme için önceden soğutulmuş HBSS ile 10 mililitrelik son hacme kadar doldurun ve numuneyi buz üzerinde tutmadan önce peleti 7 mililitre taze HBSS girdaplı olarak yeniden süspanse edin. Kalıntıların giderilmesi için, sindirilmiş veya homojenize edilmiş her numuneye 3 mililitre önceden soğutulmuş izotonik solüsyon ekleyin ve homojen bir şekilde karıştıklarından emin olmak için numuneleri hafifçe girdaplayın.

Daha sonra, numuneleri santrifüjleyin ve çözeltinin yüzeyinde yüzen beyazımsı döküntü ve miyelin diskini dikkatlice çıkarın. Kalıntı atıldığında, peletleri rahatsız etmeden her tüpten süpernatantın son 100 mikrolitresi hariç tümünü toplayın. Her peleti, ayrı ayrı 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine transfer için 1 mililitre FACS/BL çözeltisinde yeniden süspanse edin.

Partikül çözeltisi ile santrifüjlemeden sonra, numune kaybını önlemek için kalıntı diskini ve süpernatanı, hücre peletini yerinden çıkarmadan çok dikkatli bir şekilde çıkarmak önemlidir.

Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı her tüpten dikkatlice aspire edin ve peletleri tüp başına 350 mikrolitre taze FACS/BL içinde yeniden süspanse edin.