Fare Beyninden Mononükleer Hücre İzolasyonu: Beyinde Yerleşik Mononükleer Hücreleri İzole Etmek İçin Bir Yoğunluk Gradyanlı Santrifüj Tekniği

Beyindeki lenfositleri ve monositleri içeren mononükleer hücreler, beyin fonksiyonunun ve homeostazın korunmasında çok önemli roller oynar.

Bu mononükleer hücreleri izole etmek için önce tuzlu su ile perfüze edilmiş yeni hasat edilmiş bir fare beyni alın.

Perfüzyon, kanın ve bileşenlerinin kan damarlarından uzaklaştırılmasına izin vererek, sonraki adımlarda beyinde yerleşik bağışıklık hücrelerinin izolasyonunu sağlar.

Şimdi, yapışan kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için beyni uygun ortamla durulayın. Küçük doku parçaları elde etmek için durulamayı kıyma ile takip edin.

Tek hücrelerin ve hücre parçalarının bir süspansiyonunu elde etmek için doku parçalarını homojenize edin.

Bu süspansiyona, daha sonra düşük yoğunluklu bir gradyan ortamı oluşturmak için uygun hacimlerde soğutulmuş ortam ve uygun yoğunluk gradyan ortamı ekleyin.

Daha sonra, yüksek yoğunluklu bir gradyan ortamının belirli bir hacmini ekleyin; yüksek yoğunluklu gradyan ortamı, süreksiz bir yoğunluk gradyanı oluşturarak altta ayrı bir katman oluşturur.

Süspansiyonu yüksek hız ve düşük sıcaklık koşullarında santrifüjleyin. Mononükleer hücreler, iki yoğunluk gradyan ortam katmanı arasındaki arayüzü işgal eder.

Sinir hücresi aksonlarını çevreleyen yağ dokusu kılıfı olan hücresel kalıntı ve miyelin içeren üst tabakayı atın.

Arayüz katmanını uygun bir ortam ve santrifüj içeren yeni bir tüpe aktarın.

Saflaştırılmış mononükleer hücreler pelet olarak çökelir ve daha fazla analiz için tamponda yeniden süspanse edilebilir.

Kafatasını burundan boynuna dikkatlice kesin ve her hayvanın beynini kafatası kutusundan 10 mililitre RPMI ortamı içeren 50 mililitrelik tüplere aktarın.

Yapışan kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için tüpleri iyice karıştırın ve ortamı aspirasyon ile çıkarın. Her tüpe 10 mililitre taze ortam ekleyin ve beyinleri ayrı ayrı 100 milimetrelik tabaklara aktarın.

Her beyni bir usturayla ince bir şekilde doğrayın ve plastik bir pipet kullanarak bir tabaktan 6 mililitre ortamda buz gibi 7 mililitrelik sinterlenmiş cam homojenizatöre mümkün olduğunca fazla doku aktarın.

Süspansiyon homojen olana kadar dokuyu getirmek için "sıkı" pistonu kullanmadan önce havaneli "gevşek" pistonunu kullanarak beyni öğütün. Daha sonra, elde edilen doku bulamacını buz üzerinde önceden soğutulmuş 15 mililitrelik konik bir tüpe dökün.

Tüm numuneler homojenize edildiğinde, her bir doku süspansiyonunu tüp başına 3 mililitre %100 bazal membran matrisi içeren yeni soğutulmuş 15 mililitrelik bir tüpe eklemeden önce her tüpteki hacmi taze ortamla 7 mililitreye ayarlayın.

Birkaç kez ters çevirerek karıştırın ve her doku çözeltisi örneğinin altına 1 mililitre% 70 yoğunluk gradyan çözeltisi dikkatlice ve yavaşça eklemek için 3 mililitrelik bir pipet kullanın.

Hücreleri yoğunluk gradyan santrifüjleme ile ayırın ve tüm miyelini tamamen çıkarmaya özen göstererek üst tabakanın neredeyse tamamını çıkarın.

Arayüzü 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve hacmi taze ortamla 10 mililitreye ayarlayın. Ardından, numuneleri tekrar santrifüjleyin ve peletleri tüp başına yaklaşık 100 mikrolitre ortamda yeniden süspanse etmeden önce süpernatanı çıkarın.

• Centrifuge Isolators - Devices used to separate components of a (e.g., cell) mixture.
• Sucrose Gradient Media - Medium used to separate components based on their density.
• Density Gradient Centrifugation - Method to separate cellular components using density.
• Density Gradient Medium - Medium in which components are separated in gradient centrifugation.
• Resident Immune Cells - Immune cells that permanently inhabit tissues (e.g., brain).

• Introduce Centrifuge Isolators - Tools used in separating mixed (e.g., cellular) components.
• Key Concepts - Principles of density gradient centrifugation (e.g., using density).
• Underlying Mechanisms - The nature of separation by density, e.g., gradient centrifugation.
• Connect to Experiment - Use of centrifugation to isolate resident immune cells from brain tissue.

• What are centrifuge isolators and how do they help in cellular separation?
• What is the concept behind density gradient centrifugation?
• What role does the density gradient medium play in the separation process?

• Practical Applications - Centrifugation used in scientific and medical labs (e.g., diagnostics).
• Industry Impact - Fields like neuroscience and immunology benefit (e.g., studying brain diseases).
• Societal Importance - Advances in understanding innate immunity (e.g., resident immune cells).
• Link to Scientific Advancements - Enhanced precision in cell separation techniques.