Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Bu protokolün genel amacı, yüksek saflıkta bir mikroglia popülasyonunu kemirgenlerden izole etmektir. Bu yöntem, kök hücrelerin mikroglia üzerindeki immünomodülatör özelliklerinin tanımlanması veya ilaç tarama testlerinin yapılması gibi nöroinformasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kültürde uzun süre ihtiyaç duymadan yüksek saflıkta bir mikroglia popülasyonunun izolasyonudur.

Bu işleme başlamak için, makasın uçlarını omurilik kanalındaki açıklıktan geçirin ve kulak kanalına yanal kesiler yapın. Ardından, kafatasını ortaya çıkarmak için dokuyu yavaşça kürsüye doğru kaydırın. Daha sonra, sagital sütür boyunca bregmaya doğru bir kesi yapın.

Ardından makasın ucunu bregmaya sokun ve yanal kesiler yapın. Daha sonra, beyni ortaya çıkarmak için kafatasını nazikçe soyun. Kavisli forseps kullanarak, çıkarın ve beş mililitrelik steril bir kaba aktarın.

Kanı çıkarmak için yıkama başına beş mililitre buz gibi soğuk yıkama ortamı ile iki ila üç kez yıkayın. Laminer bir hava akımı başlığında, beş mililitrelik kabın içindekileri buz üzerinde duran küçük bir Petri kabına yerleştirin. Steril bir neşter bıçağı veya steril makas kullanarak beyincik ve koku ampulünü çıkarın.

Ardından, iki yarım küreyi ayırmak için bir orta hat kesimi yapın. Daha sonra, meningeal tabakayı, görünür kan damarları ile beynin yüzeyinde kırmızı bir belirti ile çok ince bir hücre tabakası olarak tanımlayın. Kortekslere zarar vermemeye dikkat ederek meninker tabakasını ince forseps ile dikkatlice soyun.

Meningeal tabaka kırılırsa, yırtık parçaları tamamen çıkana kadar soymaya devam edin. Ardından, yarım küreleri buz üzerinde yeni bir küçük Petri kabına aktarın ve yıkama ortamı ile doldurun. Steril neşter bıçağı ile beyni küçük parçalara ayırın.

Bunu takiben, ortama 100 mikrolitre papain ve 150 mikrolitre DNase1 ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Sindirimden sonra, bir P1000 pipeti kullanarak dokuyu ezin. Doku parçaları pipete giremeyecek kadar büyükse, pipet ucunu genişletmek için bir çift steril makas kullanmayı düşünün.

Bu işlem sırasında, hücre canlılığını azaltabileceğinden, ortama kabarcıklar sokmamaya dikkat edin. Laminer akış başlığında, 100 mikrometre hücre süzgeci ile 50 mililitrelik konik bir tüp hazırlayın. Sindirim ortamını ve beyin parçalarını süzgecin üzerine dökün.

Steril üç mililitrelik bir şırınganın pistonunu kullanarak daha fazla doku görünmeyene kadar öğütme hareketiyle beyin parçalarını itin. Bu işlem boyunca filtreyi sürekli olarak yıkama ortamıyla yıkayın. Bu, süzgeçte sıkışmış tüm hücreleri yıkayacaktır.

Bundan sonra, tek hücreli süspansiyonu 500 G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Ardından, 10X steril HBSS'ye dokuza bir oranında yoğunluk gradyan ortamı ekleyerek stok izotonik Percoll'u hazırlayın. Gradyanları DMEM'de %30 SIP ve one-X HBSS'de %70 SIP olarak hazırlayın.

Örneğin, 10 mililitre% 30 SIP hazırlamak için, yedi mililitre DMEM'e üç mililitre SIP ekleyin. Daha sonra, süpernatanı konik tüpten aspire edin ve hücre peletini DMEM'de sekiz mililitre% 30 SIP ile yeniden süspanse edin. Tam hacmi 15 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın.

Daha sonra, bir transfer pipetini %70 SIP ile doldurarak %70'lik SIP solüsyonunun altını alın ve transfer pipetinden dikkatlice konik borunun dibine itin. Uç dibe yaklaştığında, içindekileri yavaşça transfer pipetinden itin. Daha sonra, hücreler de dahil olmak üzere SIP katmanlarını 650 G'de fren sıfırı ve hızlanma dördü ile oda sıcaklığında 25 dakika boyunca santrifüjleyin.

%70 Percoll tabakası büyük bir özenle astarlanmalıdır. Bu arayüzün bozulması, mikroglia'nın hücre katmanında sıkışmasını ciddi şekilde etkileyebilir ve verimi ciddi şekilde azaltabilir. Ardından, bir sonraki adımda mononükleer hücrenin çıkarılmasını kolaylaştırmak için tüpün üstünden hücresel kalıntı içeren dört mililitre ortamı aspire edin.

Ardından, pipet ucunu dikkatlice arayüze doğru indirin ve mononükleer hücreleri 30/70 yoğunluk gradyan ortam arayüzünden izole edin. Bulutlu arayüzden yaklaşık üç mililitre toplayın ve yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Bunu takiben, yoğunluk gradyan ortamının uzaklaştırılmasına yardımcı olmak için karışımı dokuz mililitre HBSS ile seyreltin.

Mononükleer hücreleri içeren seyreltilmiş yoğunluk gradyan ortam arayüzünü 500 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve bir mililitre büyüme ortamı ile yeniden askıya alın. Daha sonra, yeniden süspanse edilmiş hücreleri Tripan mavisi ile boyayın ve bir hemositometre kullanarak hücre sayımı yapın.

Bu adımda, toplanan mononükleer hücreleri 300 G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüjleyin, çünkü bu manyetik izolasyona müdahale edeceğinden büyüme ortamını uzaklaştırın. Daha önce elde edilen aynı hücre sayısını kullanarak,% 2 FBS ve 0.1 ila 2.5 mililitre hacim aralığında bir milimolar EDTA içeren PBS'de mililitre başına 10 ila sekiz çekirdekli hücreyi bir kez yeniden askıya alın. Daha sonra, PBS'deki çekirdekli hücrelerin tam hacmini taze beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe ekleyin.

Ardından, bir mililitre numune başına 50 mikrolitre CD11b PE etiketleme reaktifi ekleyin. Işıktan koruyarak oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Bundan sonra, bir mililitre numune başına 70 mikrolitre seçim kokteyli ekleyin.

Işıktan koruyarak oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, manyetik parçacıkları beş defadan fazla yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Numuneye mililitre başına 50 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında ışıktan korunarak 10 dakika inkübe edin.

Hücre karışımının toplam hacmi 2,5 mililitreden azsa, bu hacme %2 FBS ve bir milimolar EDTA içeren PBS ekleyin ve iki ila üç kez hafifçe pipetleyerek karıştırın. Ardından, tüpü mıknatısın içine yerleştirin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Tek bir sürekli hareketle, süpernatanı dökmek için tüpü içeren mıknatısı iki ila üç saniye boyunca tamamen ters çevirin.

Mıknatısı dik konuma getirin ve tüpü mıknatıstan çıkarın. Bunu takiben, prosedürleri tekrarlayarak kalan hücreleri sütundan yıkayın. Hücreleri istenen bir büyüme ortamında yeniden askıya alın.

Tüpün kenarlarından hücreleri toplamak ve verimi en üst düzeye çıkarmak için toplama kabının yan tarafını durulayın. Bu şekilde görülebileceği gibi, izole edilmiş birincil mikroglia, küresel hücre gövdesini ve farklı dallanmış yapısını korur. İşte izole edilmiş mikroglia'nın temsili gerçekler grafikleri.

Ek V ve propidyum iyodürün kombine boyanması, LPS ile stimülasyondan sonra apoptotik, nekrotik veya canlı hücrelerin sınıflandırılmasına izin verir. hAEC koşullu ortam, kontrollere göre mikroglia apoptozunu önemli ölçüde azalttı ve bu hücre tipi üzerinde bir koruma şekli olduğunu düşündürdü. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik doğru şekilde uygulanırsa altı ila sekiz saat içinde gerçekleştirilebilir.

Bu yöntemi uygularken, verim üzerinde en büyük etkiye sahip olacağından, Percoll'u katmanlamaya büyük özen göstermek önemlidir. Bu tekniği takiben, fagositik fonksiyon testi veya nöronlarla ko-kültür gibi diğer prosedürler, primer mikroglia üzerinde seçtiğiniz hücre tipinin immünomodülatör özellikleri hakkında ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, alandaki araştırmacıların perinatal beyin hasarında primer mikroglianın nasıl modüle edilebileceğini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu tekniğin etkileri, motor ve bilişsel işlev bozukluğuna yol açan nörobilgide yer aldığı bilinen bir primer bağışıklık hücresi tipinin karakterizasyonuna izin verdiği için perinatal beyin hasarının tedavisine ve teşhisine kadar uzanır. Bu yöntem serebral palsi gibi motor bozukluklar hakkında bilgi sağlayabilse de, Alzheimer hastalığı gibi mikroglianın patogenezde rol oynadığı diğer bozukluklara da uygulanabilir. Bu yöntem için ilk olarak, kültürde uzun süre kaldıktan sonra potansiyel epigenetik değişiklikleri atlatmak için mikroglia'nın hızlı karakterizasyonu için bir teknik istediğimizde aklımıza geldi.

Bu videoyu izledikten sonra, aşağı akış karakterizasyonu için yüksek saflıkta mikroglia popülasyonunun nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.