Amigdala Beyin Dilimindeki Nöronal Yolların Görselleştirilmesi ve Haritalanması

Fare beyninde amigdala, medial prefrontal korteks veya mPFC nöronları ile sinaptik bağlantılar oluşturan nöronlar içerir.

mPFC nöronlarının bir floresan proteine kaynaşmış ışığa duyarlı bir kanal rhodopsin eksprese ettiği bir amigdala beyin dilimini alın.

Dilimi bir kayıt odasına yerleştirin ve mPFC nöronlarını bulmak için bir floresan mikroskobu altında görselleştirin.

Parlak alan görünümüne geçin ve dahili bir çözelti içeren bir yama pipeti kullanın.

Pipeti bir amigdala nöronuna doğru ilerletmek için pozitif basınç uygulayın.

Nöronal temas üzerine bir çukur oluşur.

Sıkı bir sızdırmazlık oluşturmak için emme uygulayın.

Hücrenin iç kısmı ile temas kurarak zarı yırtmak için emmeye devam edin.

Pozitif iyon akışını, aksiyon potansiyeli oluşumunu ve nörotransmitter salınımını tetikleyen mPFC nöronal channelrhodopsin'i aktive etmek için dilimi aydınlatın.

Nörotransmiterler postsinaptik amigdala nöron reseptörlerine bağlanarak iyon akışına ve akım oluşumuna neden olur.

mPFC-amigdala bağlantısını analiz etmek için postsinaptik nöronal akımı kaydedin.

Yama mikroskobunu liflerin ve hücrelerin optogenetik aktivasyonu için hazırlamak için, monte edilmiş ışık yayan diyotu veya LED'i ışık dağıtım yolu üzerine ortalayın. Arka odak düzlemindeki LED ışık yoğunluğunu ve her bir hedefin çıkışını 470 nanometre dalga boyunda ölçmek için bir güç ölçer kullanın. Işık yoğunluğunu milimetre kare başına miliwatt cinsinden hesaplamak için bir elektronik tablo kullanın ve her hedef için bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.

Daha sonra, arayüz odasından bir akut amigdala dilimi alın ve mikroskoba monte edilmiş dilim odasına yerleştirin. Dilimi, arabirim bölmesinde yukarı bakan dilim yüzeyi kayıt odasında da yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Dilimi dakikada 1 ila 2 mililitre oranında taze, oksijenli ACSF ile perfüze edin. Sıcaklık yaklaşık 31 santigrat derece olmalıdır. Floresan lambayı açın ve ifade edilen spesifik floresan proteini için uygun filtre setlerini seçin. Genel bir bakış elde etmek için 5x reklam verme amacını kullanın.

Ardından, deney için gerektiği gibi mikroskop ışık yolundaki açıklığı açın veya kısıtlayın. Bir yama kaydı elde etmek için, bir yama pipetini dahili solüsyonla doldurun ve elektrot tutucusuna monte edin. Yama pipetine pozitif basınç uygulayın ve yavaşça banyo solüsyonuna indirin. Ardından, görsel kontrol altında, yama pipetini dilime indirmek için mikromanipülatörü kullanın. Yama pipeti ile ilgilenilen nörona yandan ve üstten yaklaşın.

Pipet hücrenin yüzeyine ulaştığında, hücre yüzeyinde görünen bir çukur ile gösterildiği gibi pozitif basıncı serbest bırakın. Bir gigaseal elde etmek için negatif basınç uygulayın. Membran yamasını yırtmak ve tüm hücre kaydını elde etmek için daha fazla emme uygulayın. Ardından, hücreden gelen elektriksel tepkileri kaydederken 470 nanometre dalga boyundaki ışıkla channelrhodopsin'i aktive ederek etiketli lifleri bağlı LED ile uyarın.

Sinaptik stimülasyon için, LED'i tetiklemek için veri toplama yazılımının dijital çıkışlarını kullanın. LED stimülasyon yoğunluğunu manuel olarak ayarlayın. Bir sonraki kaydedilen hücre için gerektiği gibi açık veya kısıtlı bir açıklıkla veya belirli test maddelerinin varlığında stimülasyonu tekrarlayın.