Sıçan Beyninin Farklı Hücre Altı Bölmelerinde Proteazom Aktivitesinin Ölçülmesi

Hem kontrol hem de korku şartlandırılmış sıçanların beyinlerinin lateral amigdalasından toplanan hücre altı nükleer ve sinaptik fraksiyonlarla başlayın.

Her hücre altı fraksiyon, istenmeyen hücresel proteinleri parçalamaktan sorumlu proteazom kompleksinin katalitik çekirdeği olan 20S proteazomlarının değişen konsantrasyonlarını içerir.

Numunelere ATP ve florojenik bir peptit substratı içeren bir tahlil tamponu ekleyin ve inkübe edin.

ATP'nin varlığında, proteazom florojenik peptidi parçalayarak serbest florojenik molekülleri serbest bırakır.

Bir plaka okuyucu kullanarak, floresan yoğunluğunu düzenli aralıklarla ölçün.

Floresansı, florojenik molekülün bilinen standart konsantrasyonlarıyla karşılaştırarak ölçün.

Floresan yoğunluğu, numunedeki proteazom aktivitesi ile orantılıdır.

Korkuya bağlı sıçanların nükleer fraksiyonunda artan proteazom aktivitesi, hafıza ile ilgili gen ekspresyonundaki değişiklikleri gösterirken, sinaptik fraksiyondaki azalmış aktivite, uzun süreli hafıza bakımı için gerekli olan sinaptik protein ekspresyonundaki değişiklikleri gösterir.

Tahlili ayarlamak için, plaka okuyucuyu önceden 37 santigrat dereceye ısıtın ve çalışma boyunca tutun. Uyarımı 360 nanometreye ve Emisyonu 460 nanometreye ayarlayın. Kullanılan 96 kuyulu plaka temizse, Optik Konumunu Alt olarak ayarlayın. Karanlık 96 oyuklu bir plaka kullanılıyorsa, Optik konumunu Üst olarak ayarlayın. Her 30 dakikada bir tarayarak 2 saatlik bir kinetik çalışma programlayın.

Kitte sağlanan 20s 10x tahlil tamponunu 13,5 mililitre ultra saf su ile sulandırın. Şimdi 1x tampona 14 mikrolitre 100 milimolar ATP ekleyin. Bu, numunelerdeki proteazom aktivitesini önemli ölçüde artırır ve test güvenilirliğini artırır. Kitte sağlanan AMC standardını 100 mikrolitre DMSO ile yeniden oluşturun. Standart ışığa duyarlı olduğu için karanlıkta veya düşük ışık koşullarında AMC standardını kullanarak adımları gerçekleştirin.

Bir dizi yüksekten düşüğe AMC konsantrasyonundan standart bir AMC eğrisi oluşturun. Bu eğri, plaka okuyucu kalibrasyonu ve homojenize numunelerdeki proteazom aktivitesinin analizi için kullanılacaktır. Kitte sağlanan proteazom substratını 65 mikrolitre DMSO ile sulandırın. Ayrıca, alt tabaka ışığa duyarlı olduğu için bu adımı karanlıkta veya düşük ışık koşullarında gerçekleştirin.

Daha sonra, 20 S tahlil tamponu kullanarak yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde proteazom substratının 1 ila 20 seyreltmesini oluşturun. İstenen numunelerin normalleştirilmiş bir miktarını 96 oyuklu bir plakaya ekleyin. Her örneği iki kopya halinde çalıştırın. İhtiyaç duyulan numune miktarı doku hazırlığına göre değişir. Genel olarak, herhangi bir hücre altı fraksiyon için 10 ila 20 mikrogram yeterlidir.

Numune kuyusu hacmini ultra saf su ile 80 mikrolitreye getirin. Eklenen miktar, eklenen numunenin hacmine bağlıdır. İki ayrı kuyuya tek başına 80 mikrolitre su ekleyin. Bunlar tahlil boşlukları olacaktır. Tahlil boşlukları da dahil olmak üzere her oyuğa 10 mikrolitre 20 S tahlil tamponu ekleyin. Kuyucuklar arasında tutarlı tahlil hacmi sağlamak için bir tekrarlayıcı veya otomatik pipet kullanın.

Işıkları kapatın veya karanlık bir odaya girin. Her standart için tek bir kuyu kullanarak 100 mikrolitre seyreltilmiş AMC standardının tümünü yeni bir kuyuya ekleyin. Karanlıkta, numune ve tahlil boşlukları içeren, ancak AMC standardını içermeyen kuyucuklara 10 mikrolitre seyreltilmiş proteazom substratı eklemek için bir tekrarlayıcı veya otomatik pipet kullanın. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve kinetik çalışmayı başlatın.