İki Fotonlu Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu Kullanarak Bir Farede Protein Kinaz A Aktivitesinin Görselleştirilmesi

Anestezi uygulanmış bir fareyi, motor korteksi üzerinde bir kraniyal pencere ile bir koşu bandına sabitleyin.

Fare, kortikal nöronlarda bir Protein Kinaz-A raportörünü eksprese eder.

Koşu bandını iki fotonlu bir FLIM objektifin altına yerleştirin.

Objektif ile kafatası penceresi arasına bir su damlası ekleyin.

Farenin uyanmasına ve koşu bandına alışmasına izin verin.

Parlak alan aydınlatmasını kullanarak görüntüleme bölgesini bulun. Harici ışığı engellemek için mikroskop muhafazasını kapatın.

Görüntüleme parametrelerini ayarlayın, hareketi teşvik etmek için koşu bandı dönüşünü başlatın ve görüntülemeye başlayın.

Zorlanmış hareket, muhabiri fosforile eden PKA'yı aktive ederek donör ve alıcı floroforlarını daha da yakınlaştırır.

Mikroskop, bir kızılötesi lazeri yönlendirerek, vericiyi alıcıya enerji aktarmaya teşvik eder ve vericinin floresan ömrünü azaltır.

Hareket durduğunda, PKA ve raportör aktif olmayan durumlarına geri döner, enerji transferini azaltır ve vericinin floresan ömrünü uzatır.

Dinlenme ve hareket sırasında kortikal PKA seviyelerini karşılaştırmak için görüntüleri analiz edin.

Kraniyal pencere kurulumundan en az iki hafta sonra, iki fotonlu uyarma lazer dalga boyunu 960 nanometreye ayarlayın ve anestezi uygulanmış deney faresinde ayak parmağı sıkışmasına yanıt verilmediğini doğrulayın. Anestezi uygulanmış fareyi motorlu koşu bandına yerleştirin ve farenin kafa plakasını koşu bandı kurulumunun kafa plakası tutucusuna monte edin. Kraniyal pencere lamelinin yüzeyini %70 etanol ile temizleyin ve motorlu koşu bandını 2pFLIM objektifinin altına yerleştirin.

Objektifteki kraniyal pencere lamolası arasına bir damla damıtılmış su uygulayın ve farenin uyanmasına ve en az 10 dakika boyunca koşu bandı ve mikroskop ortamına alışmasına izin verin. Epi-aydınlatma altında enjeksiyon konumuna gidin ve sonraki görüntüleme seansları sırasında aynı ilgi alanının görüntülenmesine yardımcı olmak için parlak alan altında referans özelliklerini belgeleyin.

Epi-aydınlatma ışık kaynağını kapatın. 2pFLIM mikroskop donanımının muhafazasını kapatın. 2pFLIM mikroskop fotoçoğaltıcı tüplerini etkinleştirmek için donanım komut voltajı kontrolünü açın. Z yığını 2pFLIM görüntüsü elde etmek için görüntü boyutunu 128 x 128 piksel olarak ayarlayın. Tarama hızı satır başına 2 milisaniye, görüş alanı çerçevede 90 ila 100 mikrometre, ortalama üç kare.

Görüntüleme ayarlarını, hazırlık ve donanım yapılandırmasına göre ayarlayın. Ve alınan görüntüyü FLIM görünümünde inceleyin. Entegre foton sayımlarını artırmak ve gerektiğinde kullanım ömrü tahmin hatasını azaltmak için azaltılmış görüş alanı, azalan tarama hızı, artan lazer gücü ve ortalaması alınacak kare sayısını artırın.

İlgilendiğiniz bölge başına yeterli foton elde ettiğinizden emin olun. Görünümdeki pozitif bir soma için uygulanabilir bir entegre fotoğraf sayısı yaklaşık 1.000 ila 10.000 fotondur.

Görüntü en iyi duruma getirildiğinde, koşu bandında 0 hızında en az 15 dakika boyunca düzenli aralıklarla taban çizgisi tekrarlanan Z-yığını görüntülerini alın. Daha sonra, 2pFLIM görüntüleri elde ederken koşu bandı dönüşünü 15 dakika boyunca saniyede yaklaşık santimetreye ayarlayın, ardından zorlu hareketin kesilmesinden sonra protein kinaz A aktivitesinin süresini değerlendirmek için koşu bandı dönüşünü kapattıktan sonra en az 20 dakikalık görüntü elde edin.

2pFLIM görüntü analizi için, görüntüleri film görünümünde açın ve uygun minimum ve maksimum tek foton sayma aralığı değerlerini girmek için tek foton sayma minimum ve maksimum aralık alanlarına tıklayın. Zaman 0 değerini girmek için zaman 0 değeri alanına tıklayın ve istenen eşik değerini 5 ile 30 foton arasında girmek için ömür boyu parlaklık minimum eşik değeri alanına tıklayın.

Eklenen her FLIM görüntüsündeki verileri birleştiren bir grup oluşturmak için Yeni grup düğmesini tıklayın ve bir deneme grubu adı atayın. İlgi bölgesi kontrolleri modülünde İlgi Bölgesi'ne tıklayın ve bir T-ACCR alfa pozitif soma etrafında bir ilgi bölgesi çizin. Z yığını aralığını azaltmak ve arka plan fotonlarından ve diğer Z-dip'lerinden kaynaklanan sinyal kirlenmesini en aza indirmek için Z yığını kontrol kaydırıcılarındaki alt ve üst Z sınırını hareket ettirin ve FLIM görüntüsünü gruba eklemek için Artı'yı tıklatın.

İlgilenilen bölge için ömür tahmini hatasında ortalama yaşam süresini hesaplamak için calc'a tıklayın ve 2pFLIM görüntüleme serisindeki bir sonraki dosyayı açın. Zaman içinde birbirini izleyen her görüntüde aynı T-ACCR alfa pozitif soma'yı ölçün ve soma etrafındaki ilgi bölgesini gerektiği gibi ayarlayın. Tüm görüntüler analiz edildiğinde, grup kontrolleri modülünde delta ortalama foton emisyon süresi delta ortalama fotoemisyon T0'ı seçin ve referans ömrünü hesaplamak için kullanılan görüntüleri tanımlamak üzere ilgilenilen görüntülerin indeksini girmek için referans değer alanına tıklayın.

Ardından, kinazın farklı ilgi bölgeleri boyunca hareketi sırasında protein kinaz A aktivitesinin karşılaştırılmasına izin vermek için tanımlanmış ilgi bölgelerinde deney sırasında T-ACCR alfa pozitif aktivitesine FLIM yanıtını içeren bir grafik oluşturmak için grafiği tıklayın.