Caenorhabditis elegans Nöronlarında PolyQ Protein Agregasyonunun Floresan Ömür Boyu Görüntülenmesi

Anestezi uygulanmış, yaşa uygun kontrol ve şaperon eksikliği olan Caenorhabditis elegans solucanları ile başlayın.

Her iki grup da nöronlarında yanlış katlanmaya eğilimli florofor etiketli poliQ proteinlerini eksprese eder.

Kontrol solucanlarında, şaperon proteinleri yanlış katlanmış poliQ agregasyonunu sınırlarken, şaperon eksikliği olan solucanlarda, yanlış katlanmış poliQ kolayca agregalar oluşturur.

Kontrol slaytını Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM) için konfokal bir mikroskop tablasına yerleştirin.

Darbeli bir lazer kullanarak solucanları aydınlatın.

Lazer, temel duruma dönerken bir foton yayan floroforu uyarır.

FLIM, floresan ömrünü ölçer - floroforun uyarılmış durumda kaldığı süre.

Şaperon eksikliği olan solucanlarda, polyQ agregasyonu floroforları kümeler, foton emisyonu yerine bitişik floroforlar arasında enerji transferini teşvik eder ve böylece floresan ömrünü azaltır.

FLIM yazılımı, renk kodlu haritalar oluşturmak için bu ömürleri işler ve toplama görselleştirmesini mümkün kılar.

Şaperon eksikliği olan solucanlarda kontrollere kıyasla azaltılmış floresan ömrü, poliQ agregasyonunun arttığını gösterir.

Nematodların tamamen hareketsiz olduğundan emin olun. FLIM edinme yazılımını açın. Sekme düğmesini bulun ve Çıktıları Etkinleştir'e basın. Slaytı monte edilmiş C. elegans ile sahneye yerleştirin ve iletim modunda 10 kat büyütme lensi kullanarak nematodların slayt üzerindeki konumunu belirleyin. Slaytı çıkarın, objektifi 63 kat büyütmeli bir lense geçirin ve gerekli daldırma ortamını uygulayın.

Slaytı sahneye yerleştirin ve nematodları lokalize edin. Örneği taramaya başlayın. İlgilendiğiniz bir bölge seçin ve maksimum projeksiyon düzlemine odaklanın. FLIM yazılımının arayüzünde, algılanan foton sayısını önizleyin. ADC değeri 1 çarpı 10 ila dördüncü ve 1 çarpı 10 ila beşinci arasında olmalıdır. Gerekirse, odağı farklı bir düzleme kaydırın veya daha fazla foton toplamak için lazer gücünü artırın.

- Foton yığılmasını önlediğinizden emin olun, ancak ömür boyu iyi bir uyum ve ölçüm oluşturmak için yeterli miktarda foton toplayın.

- Menü çubuğunda, alım parametrelerini ayarlamak için sekmeyi seçin. Tek foton algılamasına izin vermek için Scan Sync In (Tarama Senkronizasyonu) öğesini seçin. Alımı sabit bir süreye veya sabit bir foton sayısına ayarlayın. Alıma başlamak için Başlat'a basın. Yazılımı açın ve FLIM veri dosyalarını Dosya aracılığıyla içe aktarın, FLIM Verilerini Yükleyin. Farklı seanslarda ve farklı biyolojik tekrarlardan elde edilmiş olsa bile, tüm numuneleri tek bir koşuldan yükleyin.

Gerekirse, Segmentasyon, Segmentasyon Yöneticisi aracılığıyla birçok FLIM resmi için tek bir nematodu segmentlere ayırın. Kırpma aracını, vurgulanana kadar ilgilenilen alanın etrafında sürükleyin. Tamamlandığında, Tamam'a basın. C. elegans'ın yoğunluğa dayalı görüntüsünün göründüğü küçük bir bölge seçin. Bu bölgenin bozunma eğrisi, arayüzün sağ tarafındaki büyük bozunma penceresinde görünür.

Veri sekmesinde kullanım ömrünü tahmin etmek için, iyi bir uyum sağlayamayacak kadar sönük pikselleri hariç tutmak için 40 ile 300 arasında rastgele bir tümleşik minimum değer ayarlayın. FLIM sinyalini bu değerlerle sınırlamak için bir minimum zaman ve bir maksimum zaman sayısı seçin. Birinin ön ayar sayılarını değiştirmeyin. Alım sırasında kullanılan lazerin tekrarlama oranını megahertz cinsinden girin.

Tüm doygun pikselleri dışlamak için bir geçit maksimum değeri girin. Kullanım Ömrü sekmesinde, kullanılacak genel bir bağlantı parçası seçin. Seçilen floresan bozunmasının çok üstel olduğu ve birden fazla ömür sergilediği biliniyorsa, üstel seçim sayısı dışında başka bir parametreyi değiştirmeyin.

IRF'yi IRF menüsü aracılığıyla yükleyin. IRF kaymasını tahmin etmek için, IRF, Tahmin, IRF Kayması'nı seçin. IRF sekmesinde otomatik olarak bir dizi değer görünür. Bu kurulduktan sonra, bu sekmenin diğer parametrelerini değiştirmeyin. Tüm parametreler ayarlandıktan sonra Veri Ayarını Sığdır'a basın. Mavi bir çizgiyle vurgulanan sonuçta ortaya çıkan uyum, tüm olaylarla örtüşmelidir. Tüm olaylar uyum boyunca hizalandığında iyi bir uyum elde edilir.

Yazılım arayüzünün sağ üst menülerinde bulunan Parametreler sekmesine tıklayın ve istatistiği, ağırlıklı ortalamayı seçin ve ki-kare değerinin bire mümkün olduğunca yakın olduğunu kontrol edin. Seçilen görüntünün yaşam boyu değeri böylece tau 1 olarak ortaya çıkar. İlgilendiğiniz herhangi bir bilgiyi Dosya, Yoğunluk Görüntülerini Dışa Aktar, Sonuç Tablosunu Sığdır, Görüntüler, Histogramlar aracılığıyla dışa aktarın.