Etilen Glikol Tabanlı Vitrifikasyon Fare Embriyolar Kriyoprezervasyon

Bu prosedürün genel amacı, fare embriyolarını sıvı nitrojen içinde dondurarak saklamak ve canlı farelerin geri kazanımı için çözmektir. Bu, önce fare embriyolarının dengeleme ortamına daldırılması, bir kriyo tüpünde vitrifikasyon ortamına aktarılması ve ardından bir sıvı nitrojen tankına yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra embriyolar yüksek ozmotik bir ortamda çözülebilir ve alıcı dişilere transfer edilene kadar kültür ortamında inkübe edilebilir.

Sonuç olarak, sonuçlar vitrifiye çözüldükten sonra embriyoların %90'ından fazlasının hayatta kaldığını ve embriyo transferinden sonra doğum oranlarının %30 ila 70 arasında olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin temel avantajı, geçirgen kriyoprotektan glikolün embriyolar için geleneksel kriyoprotektan daha az toksik olmasıdır. Bu protokole başlamadan önce laboratuvarımdan bir teknisyen prosedürü gösterecektir.

Doğal çiftleşme veya geleneksel IVF teknikleriyle elde edilen kültürde iki hücreli fare embriyosunu nihai depolama için bir kriyo tüpüne hazırlayın, 50 mikrolitre embriyo dondurma çözeltisi EF S 40 ekleyin. Daha sonra 50 mikrolitre oda sıcaklığında 35 milimetre veya 60 milimetre plastik Petri kabı hazırlayın. EFS 20.

Tabağa 30'a kadar embriyo aktarmak için bir cam kılcal damar kullanın. Kültür ortamını aktarmaktan kaçınmaya dikkat edin. Ayrıca embriyoların dehidrasyonunu sağlamak için, onları damlanın dibine yerleştirin.

Yaklaşık 60 ila 90 saniye sonra, susuz kalmış embriyoları çekmek için bir kılcal tüp kullanın. Büzülmüş bir morfoloji ile. Bu embriyoları kriyo tüpündeki EFS çözeltisine taşıyın ve mümkün olduğunca az EFS 20 aktarın.

Embriyolar transfer edildikten sonra, sıvı nitrojen içinde dondurmadan önce bir dakika boyunca EFS 40'a yerleşmelerine izin verin. Embriyolar çözülmeden önce, M 16 ortamı gibi en az iki damla 10 mikrolitre yüksek ozmolariteli embriyo kültür ortamından bir kültür kabına yerleştirin. Daha sonra damlaları tamamen silikon veya mineral yağ ile örtün ve tabağı kullanılana kadar bir karbondioksit inkübatörüne koyun.

Ardından, bir yüz maskesi ve kriyo eldiven takarken TS one solüsyonunu 37 santigrat dereceye ısıtın. Embriyoları sıvı nitrojen tankından alın. Şimdi kriyo tüpünü hızlı bir şekilde açın ve herhangi bir sıvı nitrojeni tanka veya uygun herhangi bir kaba atın.

Ardından 30 saniye bekleyin. Şimdi kriyo tüpüne 850 mikrolitre ılık TS bir çözelti ekleyin. Çözeltiyi yaklaşık 10 kez nazikçe emdirin ve küçümseyin, böylece eşit şekilde çözülür.

Ardından tüm hacmi 60 milimetrelik plastik bir Petri kabına aktarın. Veya embriyoların prosedürün geri kalanında kalmaları gereken oda sıcaklığına dengelenmesi için üç dakika bekleyin. Isıtma cihazı kullanmayın.

Bu inkübasyonun başlangıcında nasıl göründüklerini öğrenmek için çanaktaki embriyoları stereo mikroskop altında hızlı bir şekilde inceleyin. Yaklaşık iki dakikalık inkübasyondan sonra, ortam tabağın yüzeyine yayılıncaya kadar tabağı hafifçe sallayarak embriyoları batırın. İnkübasyonun son dakikasında, bir tabağa üç ayrı 50 mikrolitre damla TS iki solüsyonu çıkarın.

Üç dakika bittiğinde, embriyoların hafifçe küçüldüğünü doğrulamak için bir stereo mikroskop kullanın. Embriyolar hala şişmişse, inkübasyona bir ila üç dakika daha devam edin. Şimdi, embriyoları bir cam kılcal damar ile alın ve onları TS iki'nin ilk damlasına aktarın.

Üç dakika bekleyin ve embriyoları ikinci damlaya aktarın. Ardından üçüncü damla gelir. Son olarak, inkübatörde saklanan hazırlanmış embriyo ortam kabını alın ve embriyoları ortamın ilk damlasına aktarmak için bir cam kılcal damar kullanın.

Bir stereoskop altında incelenirse, embriyolar yavaş yavaş normal morfolojilerini geri kazanmalıdır. Şimdi, çanağı yaklaşık 10 dakika boyunca inkübatöre geri koyun. Daha sonra TS ikiden taşınan sakarozu yıkamak için.

Embriyoları bir sonraki kültür ortamına taşıyın. Embriyoları, alıcı dişilerin uc'sine aktarılana kadar CO2 inkübatörde kültürlemeye devam edin. Üç farklı fare suşunun 300 ila 480 embriyosunu vitrifiye ettikten ve geri kazandıktan sonra, sağkalım çok yüksekti.

Çözüldükten sonra, normal morfoloji gösteren embriyoların oranı %93 ile %99 arasındaydı ve bu embriyoların en az %84'ü blast kistlerine dönüştü. Sızıntı nitrojen ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve doğrudan temastan kaçınmak ve sızıntıya kısa mesafeli maruziyeti en aza indirmek için önlemler alın. Bu işlem yapılarak her zaman azot alınmalıdır.