Name: Etilen Glikol Tabanlı Vitrifikasyon Fare Embriyolar Kriyoprezervasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Öğrenin fare embriyolarını etilen glikol bazlı vitrifikasyon ile kriyoprezerve etme yöntemini. Bu teknik %90'ın üzerinde sağkalım oranı sağlar ve geleneksel yöntemlere göre daha az toksiktir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada Milli BioResource Projesi ile işbirliği içinde yürütülen Milli Eğitim Bakanlığı, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji, Japonya.

Deney genel şeması Şekil. 1. 1. Reaktif Hazırlama <ol><li> Lütfen aşağıdaki grafiğe göre, 100 ml cam şişe taban orta (burada PB1 olarak bilinen) olun: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> MW </td><td> mM </td><td> mg/100 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,4 </td><td> 136,98 </td><td> 800,0 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,6 </td><td> 2,68 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136,1 </td><td> 1,47 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 .12 H 2 O </td><td> 358,14 </td><td> 8,04 </td><td> 288,1 </td></tr><tr><td> MgCl 2, 6H 2 O </td><td> 203,3 </td><td> 0,49 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td glikoz></td><td> 180,2 </td><td> 5,56 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> Na piruvat </td><td> 110 </td><td> 0,33 </td><td> 3,6 </td></tr><tr><td> CaCl 2, 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 0,9 </td><td> 13,2 </td></tr><tr><td> Penisilin G </td><td></td><td></td><td> 6.0 (yaklaşık) </td></tr></tbody></table></li><li> Ficoll-sakkaroz (FS) çözümü: <ol><li> 14 ml, 50 ml tüp PB1 çözüm için aşağıdaki kimyasallar ekleyin. <table border="1"><tbody><tr><td> Ficoll 70 </td><td> 6.0 g </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> 3.424 g </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42.0 mg </td></tr></tbody></table></li><li> Ficoll 70 PB1 çözüm sakaroz tamamen eriyene kadar karıştırın ve iyice çalkalayınız. </li><li> BSA, üzerinde tam bir çözülme kontrol ettikten sonra, çözüm yüzey eklemek ve bunu tutmakBSA kadar 4oC tamamen çözülmüş (&gt; 4 saat veya gece boyunca). </li></ol></li><li> 50 ml tüp dengeleme çözümü (EFS20) ve vitrifikasyon solüsyonu (EFS40): <ul><li> EFS20:% 20 (v / v) etilen glikol,% 24 (w / v) Ficoll ve BSA PB1 0.4 mol / L sakkaroz </li><li> EFS40:% 40 (v / v) etilen glikol,% 18 (w / v) Ficoll ve BSA PB1 0.3 mol / L * sakaroz * BALB / c veya ICR gerginlik embriyolarında 6 cryodamage daha duyarlıdır, çünkü, 0.9 mol / L sakkaroz sakaroz konsantrasyonu artırır. </li></ul><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> EFS20 çözüm </td><td> EFS40 çözüm </td></tr><tr><td> Etilen glikol </td><td> 1 ml </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> FS çözüm </td><td> 4 ml </td><td> 3 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Filtrasyon ile 0.45 mikron filte kullanarak çözüm sterilizer. 4, 5 ml polistiren tüpleri ve mağaza alikotları olun ° C Bunlar yaklaşık 6 ay için kullanılabilir. </li><li> 0.75 M sakkaroz (TS1) içeren embriyo çözülme çözüm hazırlanması <ol><li> PB1 7.7 g sakaroz (adım 1.1 hazırlanan) çözülür ve toplam hacim 30 ml getirmek. Yavaşça sallayarak sakaroz tamamen eriyene kadar karıştırın. </li><li> 90 mg BSA çözüm yüzey üzerine ekleyin ve tamamen eriyene kadar stand it bırakın. </li><li> Çözüm filtrasyon ile sterilize edin. </li><li> 4 ° C'de kısım ve mağaza Yaklaşık 1 ay süreyle kullanılabilir. </li></ol> Not: TS1, aynı zamanda piyasada bulunan M2 hazırlanmış olabilir. <ol start="6"><li> 7.7 g sakaroz M2 çözülür ve toplam hacim 30 ml getirmek. </li><li> Yavaşça sallayarak sakaroz tamamen eriyene kadar karıştırın. </li><li> Çözüm filtrasyon ile sterilize edin. </li><li> 4oC kısım ve saklayın. Yaklaşık 1 ay süreyle kullanılabilir. </li></ol></li><li> TS2 (çözülme çözüm: 0.25 M sukroz) içeren <ol><li> Uygun olarak, PB1 veya M2 20 ml hacmi 10 ml TS1 seyreltilir. </li><li> 4 ° C'de kısım ve mağaza Yaklaşık 1 ay süreyle kullanılabilir. </li></ol></li></ol> 2. 2-hücre Mouse Embriyolar, Vitrifikasyon <ol><li> Doğal çiftleşme ya da in vitro fertilizasyon teknikleri geleneksel 2-hücreli fare embriyoları hazırlayın. </li><li> Kısım cryotube içine 50 ul EFS40. Bundan sonra, oda sıcaklığında vitrifikasyon prosedürünün geri kalanını gerçekleştirmek. </li><li> EFS20 35 mm veya 60 mm plastik Petri kabı alt kısım 50 ul. </li><li> Kültür ortamı sadece minimum miktarda kılcal bir bardak kullanarak EFS20 30 embriyolar aktarın. 2 dakika için bir zamanlayıcı başlayın. Not: embriyolar açılan alt yerleştirin. Bu embriyoların verimli dehidratasyon yapar. Stereomikroskopta embriyo morfolojisi kontrol edin. Şekil olarak Susuz embriyolar çekmiş, bir morfoloji göstermektedir. 2A.Onlar yeterince kurutulmuş değilseniz, 1 veya 2 dakika bekleyin. </li><li> Yaklaşık 1,5 dakika, çözümün sadece asgari miktarı ile EFS20 damla embriyolar pick up. Adım 2.1 'de hazırlanan cryotube EFS40 aktarabilirsiniz. Not: En iyi sonuç için, tüm embriyolar yaklaşık 2 dakika EFS40 aktarılır, böylece embriyolar toplayıp zamanlamasını ayarlayın. </li><li> 1 dakika bekleyin. </li><li> Cryotube doğrudan sıvı azot (LN 2) içine koyun. </li></ol> 3. Vitrifiye 2-hücreli Fare Embriyolar Çözülme <ol><li> Çözülme önce, kurtarılan embriyolar embriyo kültür ortamı 10 ul damla (3.13 adım) bir yemek hazırlayın. CO 2 inkübatör petrol ve yer ile çanak kullanana kadar örtün. Not: Bu deneyde kullanılan rutin embriyo kültürü için herhangi bir ortam olsa da, M16 orta gibi yüksek ozmolarite medya önermektedir. </li><li> 37 ° C'ye kadar TS1 Sıcak </li><li> Bir yüz maskesi ve cryogloves koyun. LN 2 t açınank ve embriyoları içeren bir cryotube almak. </li><li> Tüpün üst hızla açmak ve LN 2 atın. Sonraki aşamada dondurma TS1 önlemek için 30 saniye bekleyin. </li><li> Tüpe TS1 850 ul (37 ° C) ekleyin ve çözüm eşit eriyene kadar nazik pipettings (25 saniye içinde on kat) tarafından çözüm karıştırmak için bir 1000ul pipet kullanın. </li><li> , Plastik bir 60 mm Petri kabında (ya da bir saat camı) (Şekil 3A) tüp tüm hacim aktarın . Not: Adım 3.14 CO 2 inkübatör yerleşene kadar Embriyolar oda sıcaklığında (22-25 ° C) ele alınmalıdır. </li><li> 3 dakika süreyle bir zamanlayıcı başlayın. </li><li> Embriyoları içeren orta çanak (Şekil 3B) yüzeyine yayılmış kadar çanak TS1 yaklaşık 2 dakika, hafifçe sallayın. Not: Bu TS1 için transfer yüzeyine yakın yüzen embriyolar nedeniyle dibe yardımcı olacaktır. </li><li> Th üzerine üç 50 ul TS2 damla koyune kap (Şekil 3C). </li><li> TS1 3 dakika sonra, bir stereomikroskopta embriyo morfolojisi kontrol edin, onlar biraz çekmiş olmalı. TS1 önceki embriyo morfolojisi (Şekil 2B) ve daha sonra (Şekil 2C). Not: embriyoların hala şiş, 3 dk ile 1 TS1 içinde saklayın. </li><li> Embriyoların Pick up ve TS2 ilk damla (Şekil 3D) aktarabilirsiniz. 3 dk için Sayacı başlat </li><li> 3 dakika sonra, üçüncü bir damla (Şekil 3E) sonra ikinci damlasına kadar embriyo transferine ve . </li><li> Adım 3.1 hazırlanan kültür ortamı embriyoların transferi. Embriyolar Şekil şeklinde. 2D. </li><li> CO 2 inkübatör yerleştirin çanak. Yaklaşık 10 dakika sonra, TS2 yapılmıştır sakaroz yıkamak için kültür ortamı sonraki düşüş embriyo transferi. </li><li> Embriyo transferi kadar CO2 inkübatör kültür devam edin. Not: Transferi Embryçözülme, gün alıcı kadın siyon hatası os. , In vitro Uzun kültür farelerin bazı suşları embriyo canlılığı azalabilir . </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Çözülme Tablo 1 ve 2'de sunulmuştur ve in vivo embriyo geliştirme sonra In vitro. Bu protokolün avantajları, farelerde farklı suşları çözülme ve geniş uygulanabilirliği sonra embriyoların yüksek beka. <table border="1"><tbody><tr><td> Gerginlik </td><td> Toplam tüpler Sayısı </td><td> Vitrifiye embriyoların sayısı </td><td> Kurtarılan (No (%)) </td><td> Morfolojik olarak normal (No (%)) </td><td> Blastosist geliştirme (No (%)) </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397 (99) </td><td> 394 (99) </td><td> 342 (87) </td></tr><tr><td> BALB / CA </td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296 (99) </td><td> 282 (95) </td><td> 238 (84) </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474 (99) </td><td> 443 (93) </td><td> 398 (90) </td></tr></tbody></table> Tablo 1, ortak fare suşlarının vitrifiye çözülmüş embriyoların in vitro- geliştirme <table border="1"><tbody><tr><td> Embriyoların Durumu </td><td> Alıcı kadın sayısı </td><td> Embriyoların No transfer </td><td> İmplantasyonu siteleri (No (%)) </td><td> Canlı yavrular (No (%)) </td></tr><tr><td> Taze </td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141 (78.3) </td><td> 110 (61.1) </td></tr><tr><td> Vitrifiye </td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202 (83.5) </td><td> 125 (51.7) </td></tr></tbody></table> (Tablo 2). C57BL/6J farelerde vitrifiye çözülmüş embriyoların in vivo- geliştirme. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1Deney dengeleme, vitrifikasyon ve embriyo çözülme de dahil olmak üzere genel şeması. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 çözülme her aşamada embriyo morfolojisi. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 embriyo prosedür Eritme. Tüm işlemler, oda sıcaklığında yapılır. (A) cryotube TS1 (37 ° C) 850 ul ekleyin ve bir plastik tabak üzerine cryotube çözümün tüm hacim transferi. Şu anda, embriyoların Şekil gösterildiği gibi şişmiş bekliyoruz. 2B. (B), çanak yüzey üzerinde yavaşça sallayarak Spread çözüm. (C) üç 50 ul damla TS2, plastik tabak yerleştirin. (D), TS2 ilk damlasına kadar embriyolar transfer. Şekil olarak 3 dakika sonra, embriyolar shurunken bekliyoruz. 2C. (E), onları seri transferKalan TS2 içine ly sonra kültür ortamına düşer ve.

<ol><li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196%C2%B0+and+-269%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li>
<li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196%C2%B0C+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li>
<li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Anim%22%5BJournal%5D)">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li>
<li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mamm.+Ova.+Res%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li>
<li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution%2C+without+appreciable+loss+of+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fert%22%5BJournal%5D)">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li>
<li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li>
<li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li>
<li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li>
<li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li>
<li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li>
</ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

1985 2 Rall ve Fahy fare embriyo vitrifikasyon ilk rapordan bu yana, çözdürme sonrası embriyo beka artırmak için bazı teknik iyileştirmeler yapılmıştır. En başarılı değişiklikler düşük toksisite ve membran geçirgenliği yüksek, çünkü bir dölveriminin olarak etilen glikol kullanımı sağlandı. Gibi avantajlar sağlar; bize 4 oda sıcaklığı donma embriyolar ele diğer vitrifikasyon yöntemleri soğuk ısılarda teslim embriyo gerektirir ve her zaman BALB / c 6 farelerin bazı suşları için geçerli değildir. Ilk etilen glikol bazlı vitrifikasyon Kasai ve ark tarafından geliştirilmiştir. 1990 5,7. Orijinal bir yöntem olarak plastik kaplar payet için optimize edilmiş olduğundan, biz biraz laboratuvarlarda daha kolay erişilebilir ve fiziksel hasarlara karşı daha dayanıklı cryotubes için protokol değiştirdiniz. Bu nedenle, burada açıklanan Vitrifikasyon yöntemi uygulaması olması olabiliraraştırma modelleri gibi bir çok laboratuar fareleri kullanarak licable. Aynı yöntem morula ve blastosist aşamalarında 8 ve sıçan embriyolar 9, fare embriyoları için de kullanılabilir . Ancak, son zamanlarda cryotubes kalitesi, donma-çözülme sonrası embriyoların sağkalım oranları etkileyebileceğini bulduk. Bu nedenle, iç yüzey sırlama embriyolar (bkz. Tablo özel reaktifler ve ekipman gibi) önce düzgünlük için cryotubes incelemek için esastır. Vitrifikasyon yöntemleri geleneksel yavaş dondurma yöntemlerine göre birçok avantajı var, ancak doğal olarak ulaştırma amacı açısından bir dezavantaj var. Vitrifiye embriyolar aşağıda -120 tutulmalıdır ° C canlılığını korumak amacıyla, kuru nakliyatçılar genellikle güvenli taşınması için kullanılır. Kuru nakliyatçılar ağır ve hantal, ve bunların gidiş-dönüş, özellikle uluslararası taşımacılık, pahalı. Biz şimdi yeni bir vitrifikasyon yöntemi henüz gelişmekte olanvitrifiye embriyolar en az 7 gün 10 için (-80 ° C ile ilgili) kuru buz sıcaklığında saklanan olabilir. Bu yöntem, yeni nesil vitrifikasyon olmalıdır.

<table border="1"><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Sığır serum albümin </td><td> Merck Biosciences (Calbiochem) </td><td> 12657 </td><td></td></tr><tr><td> Etilen glikol </td><td> Wako Saf Kimya Endüstrileri </td><td> 058-00986 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 70 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> Wako Saf Kimya Endüstrileri </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Wako Saf Kimya Endüstrileri </td><td> 191-01665 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Wako Saf Kimya Endüstrileri </td><td> 163-03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Wako Saf Kimya Endüstrileri </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 · 12H 2 </sub&gt; O </td><td> Wako Saf Kimya Endüstrileri </td><td> 500-04195 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> Wako Saf Kimya Endüstrileri </td><td> 135-00165 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H2O </td><td> Wako Saf Kimya Endüstrileri </td><td> 031-00435 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-4687 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum piruvat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-8574 </td><td></td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> Wako Saf Kimya Endüstrileri </td><td> 196-00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16 orta </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> M2 orta </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> Cryotube </td><td> Sumitomo Bakalit </td><td> MS-4501 </td><td> &quot;Kriyojenik Flakon&quot; </td></tr></table>

etilen glikol tabanlı vitrifikasyon fare embriyolar kriyoprezervasyon

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Fare embriyo Kriyoprezervasyon birçok suşu farelerin genetik modifikasyon tarafından üretilen ve sayısı sürekli geçen yıl artmaktadır çünkü, biyomedikal bilimler destekleyen bir teknolojik temelini oluşturmaktadır. Onun teknik gelişme, daha sonra, 1980&#39;lerin sonlarında 2 geliştirilen vitrifikasyon yöntemleri takip 1970&#39;lerde 1 yavaş dondurma yöntemleri ile başladı. Genellikle, ikinci teknik çabukluk, basitlik, ve kurtarılan embriyoların yüksek beka avantajlıdır. Ancak, içerdiği cryoprotectants son derece toksik ve sonraki embriyo gelişimi etkileyebilir. Bu nedenle, teknik çözümleri 4 soğutulur bile, farelerde belirli suşları için geçerli değildi ° C embriyo işleme sırasında toksik etkisini azaltmak için. RIKEN BioResource Merkezi, 5000&#39;den fazla farklı genetik geçmişleri ve fenotipleri ile fare suşlarının 3 korunur ve bu nedenle bir vitrifikasyon te optimizechnique ile ortam sıcaklığı 4 sırlama ve çözülme (veya daha doğrusu, sıvılaştırılarak) sonra yüksek embriyo hayatta kalma faydaları, farelerin birçok farklı suşları embriyolar cryopreserve yapabilirsiniz. Burada, merkezimizde başarıyla kullanılmakta olan fare embriyoları için bir vitrifikasyon yöntemi sunuyoruz. Kriyoprezervasyon çözüm yerine DMSO embriyolar 5 toksisite en aza indirmek için etilen glikol içerir. Aynı zamanda, sırasıyla Devitrifikasyon önlenmesi ve osmotik ayarlama için Ficoll ve sakaroz içerir. Embriyolar, oda sıcaklığında ele ve 5 dakika içinde sıvı azot transfer edilebilir. Orijinal bir yöntem olarak plastik kaplar payet için optimize edilmiş olduğundan, biz biraz laboratuvarlarda daha kolay erişilebilir ve fiziksel hasarlara karşı daha dayanıklı cryotubes için protokol değiştirdiniz. Biz de kritik bir ste çünkü ayrıntılı olarak vitrifiye embriyolar çözülme sürecinin nasıl geliştiğini anlatabilircanlı farelerin etkin kurtarma için p. Bu metodolojileri, güvenli ve maliyet-etkin bir şekilde daha sonra kullanmak için fare suşlarının korunması gereken araştırmacı ve teknisyenler için yararlı olacaktır.

Fare embriyoları için etilen glikol tabanlı Vitrifikasyon yöntemi açıklanmıştır. , Sadeliği ve düşük embriyonik toksisite diğer yöntemler için avantajlı olduğunu ve bu nedenle farelerin kendilenmiş ve gen modifiye fareler de dahil olmak üzere birçok suşları, genel olarak uygulanabilir.

Etilen Glikol Tabanlı Vitrifikasyon Fare Embriyolar Kriyoprezervasyon

Fare embriyolarının kriyoprezervasyonu, birçok fare suşunun genetik yollarla üretilmiş olması nedeniyle biyomedikal bilimleri destekleyen teknolojik bir temeldir...

Bu prosedürün genel amacı, fare embriyolarını sıvı azot içinde kriyoprezerve etmek ve canlı farelerin elde edilmesi için onları çözdürmektir. Bu işlem, öncelikle fare embriyolarının dengeleme ortamına daldırılması, ardından bir kriyotüp içinde vitrifikasyon ortamına aktarılması ve sonrasında sıvı azot tankına yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra embriyolar, yüksek ozmotik bir ortamda çözdürülebilir ve alıcı dişilere transfer edilene kadar kültür ortamında inkübe edilebilir.Nihai olarak, sonuçlar vitrifikasyon çözünmesinin ardından embriyoların %90'ından fazlasının hayatta kaldığını ve embriyo transferi sonrası doğum oranlarının %30 ile %70 arasında olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin temel avantajı, geçirgen kriyoprotektan glikolün embriyolar için geleneksel kriyoprotektanlara göre daha az toksik olmasıdır. Bu prosedür, protokol başlamadan önce laboratuvarımdan bir teknisyen tarafından gösterilecektir.Doğal çiftleşme veya geleneksel IVF teknikleriyle elde edilen iki hücreli fare embriyolarını, nihai saklama için bir kriyotüpe hazırlayın ve 50 µL embryo dondurma çözeltisi EF S 40 ekleyin. Ardından, 35 mm veya 60 mm'lik plastik bir Petri kabını 50 µL oda sıcaklığındaki EFS 20 ile hazırlayın.30 adede kadar embriyoyu kaba aktarmak için cam bir kılcal tüp kullanın. Kültür ortamının aktarılmamasına dikkat edin. Ayrıca embriyoların dehidrasyonunu önlemek için onları damlanın tabanına yerleştirin.Yaklaşık 60 ila 90 saniye sonra, büzülmüş morfolojiye sahip olan dehidrate embriyoları çekmek için bir kapiler tüp kullanın. Bu embriyoları, mümkün olduğunca az EFS 20 transfer ederek kriyo tüpündeki EFS çözeltisine taşıyın.Embriyolar transfer edildikten sonra, sıvı azot içinde dondurmadan önce EFS 40 içerisinde bir dakika boyunca dinlenmelerini bekleyin. Embriyoları çözmeden önce, bir kültür kabına M 16 medium gibi yüksek ozmolariteli embriyo kültür ortamından en az iki damla (her biri 10 µL) yerleştirin. Ardından damlaların üzerini tamamen silikon veya mineral yağ ile kapatın ve kabı kullanıma kadar bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirin.Ardından, yüz maskesi ve kriyojenik eldivenler giymiş halde TS one çözeltisini 37 °C'ye ısıtın. Embriyoları sıvı azot tankından çıkarın. Şimdi kriyotübü hızla açın ve varsa sıvı azotu tanka veya uygun bir kaba boşaltın.Ardından 30 saniye bekleyin. Şimdi kriyotüpe 850 µL ılık TS one çözeltisi ekleyin. Çözeltinin eşit şekilde çözünmesi için yaklaşık 10 kez nazikçe çekip püskürtün.Ardından hacmin tamamını 60 milimetrelik plastik bir Petri kabına veya saat camına aktarın; embriyoların, prosedürün geri kalanı boyunca kalacakları oda sıcaklığına alışmaları için üç dakika bekleyin. Isıtıcı bir cihaz kullanmayın.İnkübasyonun başlangıcındaki görünümlerini belirlemek için kapta bulunan embriyoları bir stereo mikroskop altında hızlıca inceleyin. Yaklaşık iki dakikalık inkübasyonun ardından, besiyeri kabın yüzeyine yayılana kadar kabı nazikçe sallayarak embriyoları batırın. İnkübasyonun son dakikasında, bir kaba üç ayrı 50 µL TS two çözeltisi damlası bırakın.Üç dakika dolduğunda, embriyoların hafifçe büzüldüğünü onaylamak için bir stereo mikroskop kullanın. Embriyolar hâlâ şişkinse, inkübasyona bir ila üç dakika daha devam edin. Şimdi, embriyoları bir cam kılcal boru ile alın ve TS iki'nin ilk damlasına aktarın.Üç dakika bekleyin ve embriyoları ikinci damlaya aktarın. Ardından üçüncü damlaya aktarın. Son olarak, inkübatörde saklanan hazırlanmış embriyo ortam kabını çıkarın ve embriyoları ortamın ilk damlasına aktarmak için bir cam kılcal tüp kullanın.Stereoskop altında incelendiğinde, embriyolar yavaşça normal morfolojilerini geri kazanmalıdır. Şimdi, kabı yaklaşık 10 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Ardından, TS iki'den taşınan sakkarozu yıkamak için işlem yapın.Embriyoları bir sonraki kültür ortamı damlasına taşıyın. Embriyolar alıcı dişilerin uc'sine transfer edilene kadar CO2 inkübatöründe kültürlemeye devam edin. Üç farklı fare suşundan 300 ile 480 arasında embriyo vitrifike edilip geri kazandırıldıktan sonra, sağkalım oranı oldukça yüksek bulunmuştur.Çözme işleminden sonra, normal morfoloji gösteren embriyo oranı %93 ile %99 arasındaydı ve bu embriyoların en az %84'ü blastokiste dönüştü. Sızdıran azotla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini, doğrudan temastan kaçınmak ve kısa mesafeli maruziyeti en aza indirmek için önlemler alınması gerektiğini unutmayın. Azot alımı her zaman bu prosedür uygulanarak gerçekleştirilmelidir.

cryopreservation-mouse-embryos-ethylene-glycol-based

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video-makale-çözülme sonrası sağkalım oranları yüksek bir hamster oosit toplamak ve cryopreserve nasıl bir adım-adım gösteri sunuyoruz. Aynı işlem, başarılı bir şekilde dondurma ve preimplantasyon gelişimi farklı aşamalarında fare embriyoları Çözülme uygulanabilir.

Hamster Oosit ve Fare Embriyolar Toplama ve Kriyoprezervasyon

Preimplantasyon embriyolar hücresel dehidratasyon neden hipertonik dondurucu bir çözüm içine yerleştirildikten sonra Kriyoprezerve olabilir. Dengeleme sonra embriyonun çevresindeki çözüm, buz kristal oluşumu meydana gelir. Embriyo yavaş depolama için sıvı azot içine dalan önce sıfırın altındaki sıcaklıklara soğutulduğunda daha fazla dehidrasyon oluşur.

Preimplantasyon Sığır Embriyolar, Koyun ve Keçi, Kriyoprezervasyon

Burada fare sperm dondurulması için yeni geliştirilen I • Cryo kiti göstermektedir. Sperm ile dondurulmuş çözülmüş İki hücreli evre embriyo gelişimi bu kit kullanımı ile 5 fare suşlarının sürekli geliştirildi. 1.5 yıllık bir dönemde, 49 genetiği değiştirilmiş fare hatları I • Cryo kiti ile sperm dondurulması tarafından arşivlendiği ve daha sonra başarılı IVF tarafından kurtarıldı.

I · Cryo Kit kullanarak Fare Sperm Kriyoprezervasyon ve Kurtarma

Bu videoda, kriyoprotektan olarak etilen glikol ve dimetil sülfoksit ve taşıyıcı sistem olarak kriyojenik saman kullanılarak istenen gelişim aşamasında hasat edilen tavşan embriyolarının vitrifikasyon prosedürünü anlatıyoruz. Vitrifiye embriyolar yüksek hayatta kalma oranına sahiptir ve kullanıma kadar uzun süre saklanabilir.

Kriyojenik Saman Kullanarak Tavşan Embriyosu Vitrifikasyonu: Tavşan Embriyolarını Uzun Süreli Depolama için Korumak İçin Ultra Hızlı Bir Soğutma Tekniği

Bu video, vitrifiye tavşan embriyolarının çözülme prosedürünü ve optimal embriyo geri kazanımı için önlem ölçüm adımlarını göstermektedir.

Tavşan Embriyosu Çözdürme: Embriyo Transferi için Dondurularak Saklanmış Tavşan Embriyolarını Geri Kazanmak İçin Bir Isınma Prosedürü

Utero-Tüp embriyo transferi rahim transferinin gerçekleştirilmesi oluşabilecek embriyo akışını önlemek için bir bariyer olarak utero-tubal kavşak kullanır. Vasektomize erkek embriyo transferi için yalancı alıcıları almaları gerekmektedir. Her iki teknikler tartışılacaktır.

Fare Modelinde utero-tubal Embriyo Transferi ve Vazektomi

MicroSecure Vitrifikasyon, FDA iyi üretim ve doku işleme uygulamalarıyla uyumlu, ticari olmayan, aseptik kapalı bir vitrifikasyon cihazı sistemi olarak geliştirilmiştir. Hidrofobik tıkalı embriyo pipetlerinin endüstriden çekilmesi nedeniyle, vitrifikasyon prosedürü, standart iç pamuk tapadan önce bir iç conta içerecek şekilde değiştirildi.

Modifiye MicroSecure Vitrifikasyon: İnsan Blastosistlerinin A, Güvenli Basit ve Etkili Kryoprezervasyon Prosedürü

Destekli üreme teknikleri (ARTs) sonuçları geliştirmek ve ilişkili riskleri azaltmak için sürekli değerlendirme içindedir. Bu yazıda, tavşanların insan üreme açısından ideal bir hayvan modeli olarak kullanımına izin veren, verimli bir ağoprezervasyon protokolüyle minimal invaziv bir embriyo transfer prosedürü açıklanmaktadır.

En düşük Invaziv embriyo transferi ve tavşan modelinde optimum embriyo aşamasında embriyo vitrifikasyon

Burada blastosist büzülme ve re-Genleşme yoğunluğunu previtrification müdahaleler sonrası ısınma kurtarma sırasında takip etmek ve hızlandırılmış xarakteristikaları iletişim kuralı mevcut. Uygulama Protokolü'nün in vitro fertilizasyon Laboratuvarları ile hızlandırılmış mikroskoplar donatılmış mümkündür ve bir en iyi blastosist vitrifikasyon yöntemi gelişiminde önerilir.

Blastosist davranış objektif değerlendirme Vitrifiye ve ısınma adımları sırasında için xarakteristikaları Protokolü

Burada, tek hücreli embriyoların kriyopreservation için değiştirilmiş bir yöntem yanı sıra genetik olarak değiştirilmiş farelerin verimli nesil için dondurulmuş çözülmüş embriyolar ve elektroporasyon kullanarak çiftler bir protokol sıyoruz.

Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Yüksek Verimli Üretimi için Dondurulmuş Çözülmüş Embriyoların Kullanımı

Burada, ev yapımı bir spatuladan oluşan ve ev yapımı solüsyonlar kullanan fare ve koyun implantasyon öncesi embriyoları vitrifikasyon için Spatula Montevideo protokolünü sunuyoruz. Embriyolar, artan konsantrasyonda iki kriyoprotektan çözelti içinde hızla dengelenir, spatula üzerine yüklenir, sıvı nitrojene daldırılır ve son olarak 0.5 mL'lik bir samanla kapatılır.

Memeli embriyolarının vitrifikasyonu için spatula Montevideo cihazı

Öğrenin fare embriyolarını etilen glikol bazlı vitrifikasyon ile kriyoprezerve etme yöntemini. Bu teknik %90'ın üzerinde sağkalım oranı sağlar ve geleneksel yöntemlere göre daha az toksiktir.

Etilen Glikol Tabanlı Vitrifikasyon Fare Embriyolar Kriyoprezervasyon

Daha fazla video keşfet