Modifiye MicroSecure Vitrifikasyon: İnsan Blastosistlerinin A, Güvenli Basit ve Etkili Kryoprezervasyon Prosedürü

MicroSecure embriyo vitrifikasyon yönteminin genel amacı, insan embriyoları için güvenli, emniyetli, basit ama etkili bir aseptik kapalı vitrifikasyon prosedürü sağlamaktır. Bu yöntem, insan embriyolarının vitrifikasyonunda kalite kontrol değişkenlerini en aza indirmek, böylece güvenilir ve tekrarlanabilir başarı sağlamak için geliştirilmiştir. Bu tekniğin temel avantajı, biyologlar ve laboratuvarlar arasındaki teknik farklılıkları ortadan kaldırmaya çalışmasıdır.

Tekniğimizin gerçekleştirilmesi o kadar basit ki, kursiyerlerimiz için en büyük zorluğun, embriyoları kaybetmeden nasıl pipetleneceğini öğrenmek olduğunu görüyoruz. Yöntemimizin arkasındaki fikir, yaygın olarak kullanılan iki FDA onaylı öğeyi uyarlayarak özel cihazlara olan ihtiyacı ortadan kaldırmaktı. Dahili olarak etiketlenmiş bir iyonomerik saklama pipeti ve steril bir flexipet.

Bu tekniğin görsel gösterimi, başarılı bir şekilde uygulanmasını sağlayan temel ipuçlarını vurguladığı için son derece yararlıdır. Prosedüre başlamadan önce, steril 0.3 ml meni samanını, iç sızdırmazlık oluşturmak ve iç sızdırmazlık sağlamak için tapanın hemen önünde, temel bir masa üstü darbeli mühürleyicinin elektrodunun teflon yüzeyine yerleştirin. Isıyı etkinleştirmek için tutamağa basın, kırmızı ışık söndüğünde ve bir bip sesi duyulduğunda kolu bırakın.

Ardından, kurulumu tamamlamadan önce pamuklu tapayı iç contaya doğru ileri doğru itin. Numunelerin kriyo-seyreltme ve blastosist yüklemesi için, hasta kültür kabını inkübatörden çıkarın ve tüm numune tanımlamalarını ikincil bir kaynakla onaylayın. Bir stereomikroskop altında, blastosistleri karşılık gelen bir kriyo kabının üst sırasındaki ayrı tutma damlacıklarına taşımak için vit ucu olarak adlandırılan bir vitrifikasyon flexipet kullanın.

Daha sonra, flexipet'i 3 mikrolitre V1 çözeltisi ile önceden doldurun ve içeriğin yarısını ilk embriyoya dağıtın. Embriyoyu aspire edin ve ilk V1 yıkama damlasına aktarın. Daha sonra embriyoyu damlacığın çevresine iki ila üç kez pipetleyin ve damlacığın dışındaki kalan pipet içeriğini tabak yüzeyine temizleyin.

Daha sonra blastosisti ayrı bir V1 tutma damlasına taşıyın ve ek embriyoları yeni bir vit ucu ile pipetlemeden önce vit ucunu bir sonraki V2 solüsyonu ile önceden yükleyin. V2 ve V3 damlacıklarındaki tüm blastosistleri az önce gösterildiği gibi yıkadıktan sonra, V3 tutma damlacığının dışındaki vit ucundan kalan çözeltiyi ve kabarcıkları temizleyin ve ucu ilk embriyonun etrafından temiz V3 çözeltisi ile tamamen doldurun. Hacmin yaklaşık 1 mikrolitresini dışarı atın ve blastosisti ve kalan V3 solüsyonunu tamamen vit ucuna aspire edin.

Şimdi, ucu pipetten çıkarın ve vit ucunun dış yüzeyinden kalan V3 solüsyonunu kurutmak için steril bir gazlı bez kullanın. Ucun dış yüzeyinin kurutulması kritiktir ve herhangi bir ek embriyo kaybı riskine neden olmaz. Ardından uç ucunu önce önceden kapatılmış pipetin açık ucuna yerleştirin ve pipeti ters çevirin, etiket ucu aşağı gelecek şekilde çevirin.

İç tapadaki uca dikkat edin. Açık uçta 1 cm'lik bir hava boşluğu bırakın ve ardından güvenli bir şekilde kaynak yaparak kapatın. Tüm pipetler mühürlendiğinde, bunları paslanmaz çelik bir dewar şişesinde doğrudan sıvı nitrojene daldırın ve pipetleri hastanın bastonuna bağlı açık kadehte saklayın.

Kriyo-çözelti elüsyonu ve seyreltmesi için, karşılık gelen altı kuyulu seyreltme kabını bir stereomikroskop aşamasının ortasına ve mikroskobun bir tarafına 37 santigrat derece sükroz ısıtma banyosu içeren 60 mm'lik bir petri kabına yerleştirin. Ardından, ısıtılacak pipeti izole edin ve numunenin kimliğini doğrulamak için üst pipet contasını sıvı seviyesinin üzerinde tutun. Vit ucunu sıvı nitrojene batırılmış halde tutmak için pipeti dahili tapanın altına sabitlemek için mayonez makası kullanın.

Kalite kontrol önlemi olarak ucu pipetin iç yan duvarından çıkarmak için makası dewar şişesine birkaç kez sıkıca vurun ve pipeti stereoskop yüzeyinin yanında veya altında yatay bir yönde ortam havasına kaldırın. Pipetin etiketsiz ucunu kavrayarak, pipeti iç tapadan kesin. Daha sonra pipeti ısıtma banyo kabının üzerine kaldırın ve vit ucunu, uç tamamen ekstrüde olana kadar 60 derecelik bir açıyla banyoya dökün.

Flexipet'in tabanı, çanak yan duvarının üzerinde durmalıdır. 5 ila 10 saniye sonra pipet tabanını bir mikro kapaklı pipetleme cihazına aktarın. Beş dakikalık bir zamanlayıcı başlatın.

Mikroskobu görüntülerken, ampul deliğini kapatmak için bir işaret parmağı kullanın ve vitrifiye blastosisti vit ucundan T1 yıkamasına bırakmak için ampulü hafifçe sıkın. Blastosistin serbest bırakılmasını onayladıktan sonra, kalan V3 çözeltisini ve kabarcıkları pozitif basınçla temizleyin ve içeriği kullanılmayan bir ıskarta kuyusunun ortasına boşaltın. Vit ucunu steril bir pipete aktarın ve embriyoyu kalan dört dakika boyunca yağ altında ikinci T1 damlacığına hareket ettirin.

İnkübasyon sırasında, flexipet'i bir sonraki çözelti ile önceden doldurun, ardından blastosisti T2, 3 ve 4 damlacıklarında üç dakikalık aralıklarla seyreltin. Son olarak, T5 damlacıkındaki blastokistleri inkübatöre geri göndermeden önce 37 santigrat derecelik bir yüzeyde beş dakika boyunca dengeleyin. Modifiye Gardner Blastosist Derecelendirme Sistemi, tam blastosistleri trofektoderm hücrelerinin %10'dan daha az herniasyonuna sahip olarak kabul ederken, %50'ye kadar herniasyona sahip blastosistler genişlemiş olarak sınıflandırılır.

%50'den fazla fıtıklaşma gösteren blastokistler kuluçka olarak kabul edilir. Gösterilen kriyo-koruma ve ısıtma yöntemlerini kullanarak, implantasyon öncesi genetik test olsun ya da olmasın, döngü başlangıcı başına yüksek seviyelerde canlı doğumlar tutarlı bir şekilde elde edilmiştir. Bu başarılar önemli ölçüde daha yüksek olmasına rağmen, önceden seçilmiş öploid blastosistler kullanılarak.

Gerçekten de, yalnızca kriyo ile korunmuş döngüler için iyi bir prognoz hasta popülasyonunu değerlendiren bu donmuş embriyo transfer verileri, hem implantasyon hem de canlı doğum oranları için ulusal ortalamadan %30'un üzerinde daha iyi başarı oranları göstermektedirAğırlıklı olarak genetik olarak test edilmiş tek öploid vitrifiye blastosistleri transfer ederek, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki en yüksek implantasyon oranlarından ve canlı doğum oranlarından bazıları, yaştan bağımsız olarak, Hastalık Kontrol Merkezi tarafından diğer iki saygın doğurganlık kliniği için bildirilen son ulusal istatistiklere ve Yardımcı Üreme Teknolojileri Derneği tarafından yayınlanan verilere kıyasla elde edilmiştir. MicroSecure vitrifikasyon, teknik kolaylık, güvenilirlik ve kriyo güvenliği göz önünde bulundurularak geliştirilmiş yeni bir aseptik prosedürdür. Bu basit, ticari olmayan vitrifikasyon sistemi, vitrifikasyon cihazlarına oldukça etkili, düşük maliyetli bir alternatif sunar.

Geliştirilmesinden bu yana, MicroSecure yöntemi %99,9'un üzerinde embriyo iyileşmesi ve %95'in üzerinde tam blastosist sağkalımı sağlamıştır. Bu, klinik pratiğimizin son üç yılda neredeyse tüm kriyo-korunmuş embyro transfer döngülerine dönüştürülmesini sağlamıştır. Hala güvenilir kaynak contaları ve olağanüstü ısınma sonrası sonuçlar elde etmek için iyonomerik sperma pipetlerinin pamuk tapasının önüne bir iç conta eklemek için prosedürümüzü etkili bir şekilde değiştirdik.

Günümüzde yardımcı üreme teknolojisi endüstrilerinde kullanılan birçok farklı cihaz sistemi vardır, ancak başka hiçbir cihaz, MicroSecure vitrifikasyon gibi kullanıcı varyasyonunu esasen ortadan kaldırmak ve optimize edilmiş güvenlik sağlamak için basitlik ve teknik tekrarlanabilirlik sunmaz.