Konfokal Mikroskop Kullanılarak Zebra Balığı Larvasında Seçici Tek Nöron Lazer Ablasyonu

Spinal motor nöronlarda bir floresan proteini ifade eden anestezi uygulanmış bir transgenik zebra balığı larvası içeren önceden ısıtılmış bir agaroz çözeltisi alın.

Larvaları agaroz halkalı bir cam kaba aktarın.

Bir mikroskop kullanarak larvaları yan tarafına çevirin. Ardından, larvaları hareketsiz hale getirerek agarozun katılaşmasına izin verin.

Anesteziyi sürdürmek için anestezik içeren tampon ekleyin.

Çanağı konfokal mikroskop aşamasına yerleştirin ve dorsal omurilik bölgesini bulmak için parlak alan görüntülemeyi kullanın.

Floresan motor nöronları görselleştirmek için floresan moduna geçin.

Hassas ablasyon hedeflemesi için hücre soma'sının merkezi z düzlemini belirleyin.

Foto hasarı en aza indirirken yüksek çözünürlüklü çekim için görüntüleme parametrelerini yapılandırın.

İstenen z düzlemi odaklandığında, odaklanmış bir ultraviyole lazer kullanarak hedef nöron bölgesinde ablasyon gerçekleştirin.

Lazer enerjisi hücresel yapıları bozarak floresan kaybına ve hücre ölümüne neden olur. Geri dönüşümsüz floresan kaybı, çevredeki hücreleri etkilemeden hassas ablasyonu doğrular.

Bir larva çekmek için ayarlanabilir bir pipet kullanın ve ucun dibine batmasına izin verin. Larvaları minimum miktarda sıvı içinde önceden ısıtılmış agaroz içine bırakın, daha sonra balığı agarozla birlikte çekin ve önceden hazırlanmış 35 milimetrelik bir cam tabanlı tabağa hızlıca dağıtın. Diseksiyon mikroskobu altında, hayvanı veya birden fazla hayvanı, agaroz içinde yanlarına yerleştirmek için standart bir boya fırçası kullanın, böylece gövde ve kuyruk düz olur.

Gömülü balığın, agaroz sıkıca ayarlanana kadar 10 ila 15 dakika oturmasına izin verin. Ardından, 35 milimetrelik petri kabını dikkatlice doldurmak için trikanlı yaklaşık iki mililitre yumurta suyu kullanın. Gömülü bir larva içeren petri kabını konfokal mikroskop aşamasına yerleştirin ve Brightfield aydınlatması ve 40X büyütme kullanarak hayvan omuriliğinin sırt tarafına odaklanın. Uygun bir floresan ayarına geçin ve tüm görüntüleme parametrelerinin sonraki ablasyon için gerektiği gibi olduğunu doğrulamak için ilgili yapıyı görselleştirin.

UV lazer ablasyonu için yapının kalınlığını belirlemek için, manuel olarak yukarı ve aşağı odaklanarak ilgilenilen yapının üst ve alt kısımlarını doğrulamak için Z sürücüsünü kullanın. Kesilecek olan Z düzlemini, örneğin hücrenin merkezini manuel olarak kaydedin. Lazer ablasyonu gerçekleştirmek için, yazılım menüsünün üst kısmındaki açılır menüye tıklayarak FRAP sihirbazını başlatın.

Yeni pencereden, formatı, tarama hızını ve ortalamayı seçerek ablasyon yaklaşımı için görüntü parametrelerini belirleyin. Ablasyon için Z düzlemi henüz seçilmemişse, canlı düğmeye basın ve floresan yapı veya ablasyon için istenen Z düzlemi netlenene kadar numuneye odaklanın. Genel görüntü parametreleri ayarlandıktan sonra, spesifik ablasyon bileşenlerini kontrol etmek için ağartma adımına erişin, ardından ağartma prosedürü için etkinleştirerek 405 nanometre lazeri devreye sokun.

Ardından, tarama alanını azaltarak ve böylece bekleme süresini en üst düzeye çıkararak seçilen ROI'de ağartma yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için yakınlaştırma seçeneğini kullanın. Görüntü alma penceresindeki çizim araçlarından herhangi birini kullanarak ablasyon için bir veya daha fazla ROI seçin. Örneğin, yaklaşık 4 ila 8 mikrometrelik dairesel çizim aracıyla akson tepeciğini hedefleyin.

ROI'yi belirledikten sonra, zaman kursu düğmesini seçin ve ROI'lerin taranacağı ve kesileceği döngü sayısını onaylayın. Ağartma işleminden hemen önce ve hemen sonra tüm görüntünün genel bir bakışına izin vermek için ağartma öncesi ve ağartma sonrası çerçeveleri istediğiniz gibi seçin.

Bu ayarlar, araştırmacılara birden fazla iyileştirme katmanı sağlar. Lazer gücünün, tarama hızının, çizgi ortalamasının, ilgilenilen bölgenin boyutunun ve tekrarların ayarlanması yoluyla bu teknik, tek tek hücrelerde strese veya ölüme neden olmak için yüksek derecede serbestlik sunar.

Gerekli tüm ablasyon parametrelerini belirledikten sonra, Deneyi çalıştır'a basın ve ablasyonun verimliliğini izleyin. Daha fazla ayrıntı için metin protokolüne bakın.