Name: Konvansiyonel UV Lazer konfokal mikroskopi kullanılarak Tetikleme Hücre Stres ve Ölüm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Öğrenin, UV lazer konfokal mikroskopi kullanarak tek hücre çözünürlüğünde ablasyon yapmayı ve Danio rerio ile nörodejeneratif hastalık mekanizmalarını incelemeyi. Bu yöntem, hücre stresi ve ölümü tetikleyerek mikroglia tepkilerini analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Avustralya MND Araştırma Enstitüsü ve Cure for MND Vakfı [GIA 1638], Snow Vakfı ve Macquarie Üniversitesi [MQRDG 9201401462] tarafından desteklenmiştir. Görüntüleme, Macquarie Üniversitesi Biyomedikal Bilimler Bölümü'ndeki Mikroskopi Tesisi'nde gerçekleştirildi. MND araştırma merkezinin diğer üyelerine, bu yöntemlerin ve balık misinalarının geliştirilmesine katkılarından dolayı teşekkür edilir.

NOT: Hayvan deneylerinde tasarımı, yürütülmesi ve raporlama güncel kılavuzlarda 15 dikkate almak zorundadır. Böyle bir çalışma, yerel hayvan koruma otorite tarafından önceden onaylanmış olmalıdır (bizim durumumuzda, Macquarie Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Komitesi). 1. Montaj ve UV Hücre Ablasyon için Zebra balığı hazırlayın <ol><li> Zebrafish (Danio rerio) floresan proteinleri ifade oluşturun. <ol><li> , Zebra balığı ilgi floresan proteinleri ifade Zebra balığı yumurta tek hücreli aşamaya plazmid enjeksiyonları gerçekleştirmek (başka yerde 16 açıklandığı gibi) ya da floresan transgenik hatları kullanın. Birden fazla hücre tiplerini etiketlemek için, ilgi soruya uygun kurulmuş transgenik hatları geçerek bileşik transgenik zebrafish hatları oluşturmak. Akşamları bir yanlış alt çifti çiftleşme tankının her iki tarafında bir erkek ve bir kadın zebrafish yerleştirin ve ışığın başlangıcı ile bölücü kaldırmak(başka yerde 17 ayrıntılı olarak) Ertesi sabah. 28 ° C zebrafish tutmak ve kurulan protokolleri 17, 18 göre bunları idare. </li><li> plastik çay süzgecinden embriyoları içeren tankı suyun süzme başarılı yumurtlama sonrası embriyolar toplayın. Sistem su ile yumurta durulayın ve bir Petri kabındaki yumurta su içine aktarabilirsiniz. </li><li> döllenmeyi belirlemek için bir ışık mikroskobu altında inceleyin. Mağaza bir Petri kabındaki yumurta döllenir ve 28 ° C 18 bir inkübatör koyun. </li></ol></li><li> İsteğe bağlı: Belirli hücre popülasyonlarının etiket bir mikroenjeksiyon gerçekleştirin. Not: Bu, stabil transgenik çizgiler yükseltmek gerek kalmadan, ifade ve protein görünüm için izin veren bir alternatif bir yöntemdir. İlgili protein, toksik olan ve dengeli bir trans üretilmesini engeller, bu yöntem de avantajlıdırgen çizgiler. <ol><li> Başka bir yerde 19, 20, 21 tarif edilen şekilde, zebra balığı embriyoların tek hücreli aşamada plazmid yapıları enjekte edilir. Not: Bu yöntem, ilgilenilen proteinin mozaik ifadesi ile sonuçlanır. İlgili protein seçim promotöründen yapılır Tol2 çevrili (örneğin, 25 ya da MPEG1 26 araya 24, -3mnx1 23 22 islet1) tekrarlar 20 ters. </li></ol></li><li> İstenilen büyüklükte balık yaş. <ol><li> 3 balık yükseltmek - 5 gün sonrası fertilizasyon (dpf) ve floresan bileşik mikroskop altında koyun. Uygun fluorofor ifade hayvanları Ekran ve parlak etiketli balık seçin. Geç gömmek için yumurta su ile başka bir çanak içine uygun larvaları ayırın(28 ° C inkübatör deposunda) üzerine r. İsteğe bağlı: Embriyolar pigmentasyon oluşumunu inhibe 24 saat sonra döllenme (HPF) bir 0.2 mM 1-fenil-2-thioures (PTU) Ringer çözeltisi içine yerleştirilebilir. toksik ve yan fizyolojik, genetik veya morfolojik etkileri olabilir olarak bakım, PTU ile alınmalıdır. </li><li> Erken gelişim aşamasında çalışmalar için (&lt;2 dpf), elle keskin forseps kullanarak embriyolar dechorionate. enzimatik olarak yumurta su pronase (2 mg / ml) eklenmesi ve 28 ° C &#39;de 10 dakika boyunca inkübe edilerek embriyo sayıda Dechorionate. </li><li> dechorionation kolaylaştırmak için plastik Pasteur pipeti ile periyodik embriyolar geçirin. embriyoların çoğunluğu yumurta su ile onları birkaç kez yıkayarak kendi chorions ortaya çıkmıştır zaman süreci sonlandırmak. </li></ol></li><li> agaroz Zebra balığı gömme için çözümler hazırlayın. <ol><li> 4 g / L MS222 ekleyerek anestezi solüsyonu hazırlayın (tricaine stok çözeltisi, pH 7.0)Yumurta su içeren bir Petri kabı ilave edildi. 50 mg / ml dozu ile, tavsiye edilen bir başlangıç noktası (Şekil 1A) &#39;dir. </li><li> yumurta suda - (% 1.5 0.8) ve 1.5 mL mikrosantrifüj tüpler içine bölmeyin düşük erime agaroz bir stok hazırlayın. Önceden ısıtılmış bir ısıtma bloğu içinde bir kısım yerleştirin (38-40 ° C) ve bu ayar sıcaklığına gelmesini sağlar (~ 30 dak; Şekil 1B). </li><li> İsteğe bağlı: uzun vadeli görüntüleme (&gt; 4 saat) için, 35 mm cam alt Petri kabı içinde küçük bir agaroz daire hazırlamak ve (Ek Şekil 1) ayarlamanıza olanak verir. NOT: Bu fazladan adım daha uzun zaman dilimlerinde üzerinde zebrabalıkları ile tüm agaroz damla herhangi bir hareketi önlenmesinde etkili oldu. <ol><li> Bunu yapmak için, cam alt çanak iç çemberin boyunca agaroz yer ~ 300 uL balık yerleştirmek için hangi ortasında küçük bir açıklığı olan bir halka şekilli daire hazırlamak için (adım 1.5.3; Ek Şekil 1) . </li></ol></li></ol></li><li> mikroskopi için agaroz zebrafish monte edin. <ol><li> Seç 1 - ablasyon ön elemeden balık 3 ve anestezi solüsyonu ile bir çanak içine (bir transfer pipet kullanarak) onlara aktararak larvaları uyutmak (adım 1.4.1; Şekil 1C, yaklaşık 5 dakika). NOT: balıklar sığ solungaç hareketi ve azalmış kalp hızı gösterdiğinizde anestezi ve artık dokunmatik uyarılmış kaçış tepkisi sergilerler (teer; başarısızlık uzakta sonra yavaşça yüzmek bir fırça ile kendi kuyruk dokunmadan). balık etik tedavisi için uygun anestezi sağlamak ve floresan ışığa agaroz veya maruz içine transfer edildiği seğirmesi önlemek için. </li><li> Anestezi onaylandıktan sonra (için ~ 30 uL set cut-off 200 mcL ucu ile) ayarlanabilir bir pipet kullanarak bir larva emmek ve ucu dibine çöker edelim. ile sıvı bir damla bırakarak önceden ısıtılmış agaroz (adım 1.4.2) içine larva transferiagaroz içine larva (agaroz girmeden yumurta su miktarını en aza indirmeye çalışın; Şekil 1D). </li><li> agaroz çevrili balık emmek. önceden hazırlanmış cam alt 35 mm çanak içine hızlı bir şekilde dağıtın. </li><li> Tarafında (solda kafa) böylece vücut ve kuyruk düz (Şekil 1E) agaroz içinde hayvan konumlandırmak için bir diseksiyon mikroskobu ve standart bir boya fırçası (uzun astar, boyut 1) kullanın. Birden çok balık ile çalışan, bunlar daha sonra kolayca konfokal mikroskop kullanılarak bulunan, böylece çanak tüm balık hizalayın. NOT: Hızla konumlandırma ve hizalama bu yordamı gerçekleştirmek (agaroz soğuk sıcaklıklara maruz kaldıktan sonra hemen ayarlamak başlar gibi, bazı pratik gerekebilir). </li><li> Agaroz sıkıca ayarlanana kadar 15 dakika - 10 agaroz gömülü balık bırakın. Dikkatle ~ 2 mL yumurta su içeren tricaine (Şekil 1F) ile 35 mm Petri kabı kontör. </li></ol></li></ol> 2. Konfokal Mikroskop ve Görüntüleme parametreleri ayarlama <ol><li> konfokal mikroskop sahnede gömülü larva ile Petri kabı yerleştirin ve (parlak alanını kullanarak) hayvan omurilik dorsal tarafına odaklanmak. Uygun büyütme (40X) ve floresan ayarı altında hayvan inceleyin ve ilgi yapısını görselleştirmek (örneğin, etiketli nöronların veya mikroglial hareketin floresan yoğunluğu) sonraki ablasyonu (Şekil 2) için gerekli tüm görüntüleme parametreleri onaylamak için. Biz rutin zaman atlamalı çalışmalar yapmak 40X objektif kullanın. </li><li> İsteğe bağlı: birkaç saat boyunca zaman atlamalı çalışma gerçekleştirmek için, bu hücrenin ve çevresinin soğukkanlı fizyolojik yanıtı kurmak için ablasyona tek ya da birkaç zaman noktaları öncesinde kayıt tavsiye edilir (örneğin, mikroglial hareket bazal hız kurmak ve hareketliliği). </li><li> yapının kalınlığını belirlemekUV lazer ablasyon ilgi ure. <ol><li> Z-sürücü kullanarak, manuel olarak odaklama ve aşağı tarafından ilgiyle yapısı (örneğin, hücre soma) üst ve alt doğrulayın. Ablasyon edilecek z-düzlemi not edin (örneğin, hücrenin merkezi). NOT: deneyim, bu yöntem parlak etiketli omurilik nöronlar (ablasyon sonrası kolay time-lapse görselleştirme sağlayan yüksek sinyal-gürültü oranı, örneğin, Şekil 4) hedefleyerek en etkili ve orta ablasyon ile hücre soma. Hücre çekirdeği floresan doğru hedefleme ve yüksek ablasyon etkinliğini sağlamak için avantajlı olabilir. </li></ol></li></ol> 3. Lazer Ablasyon Zebra balığı Omurilik Bireysel Hücreler Hedefli gerçekleştirin NOT: Bu ablasyon ve görselleştirme yaklaşımı için, bir konfokal mikroskop (Leica SP5) kullanıldı. hücreye özel dest için 405 nm diyot kullanarak ablasyon işlemiruction yazılımı (Leica Application Suite, v2.7.3.9723) göre ayrıntılı. Ancak, 405-nm lazer ve sıkı bağlamak (photobleaching sonra floresan kurtarma) ya da ağartıcı modülü ile donatılmış herhangi bir geleneksel konfokal mikroskop ancak potansiyel biraz farklı ayarlar parametreleri ve isimleri ile, aynı hücre manipülasyonlar performansını sağlayacaktır. <ol><li> Yazılım menüsü (Şekil 3A, 1 ve 2) üstündeki açılır menüden üzerine tıklayarak sıkı bağlamak sihirbazını başlatın. Lazer ablasyon için spesifik parametreler kurulumunu izin veren farklı adımlarla yeni bir pencere gözlemlemek (Şekil 3B, 3). </li><li> Biçimi, tarama hızı (Şekil 3B, 4) seçerek ve ortalamasını alarak ablasyon yaklaşım görüntü parametreleri belirlemek (Şekil 3B, 5). 400 Hz ve bir çizgi tarama hızında 1024 x 1.024 bir resim biçimi4 ortalama en uygun oldu. NOT: önceki edinme olarak belirlenmiştir (örneğin uyarma veya emisyon parametreleri gibi) spektral algılama değiştirmeye gerek, genellikle vardır. <ol><li> (Adım 2.4 açıklandığı gibi.) Ablasyon z-düzlemi zaten seçili değilse, &quot;Canlı&quot; butonuna basın ve floresan yapı veya kesilip olacak istenen z-düzlemi kadar numune ile odak odakta. </li></ol></li><li> Genel görüntü parametreleri ayarlandıktan sonra, &quot;Bleach&quot; adımı (Şekil 3C, 6) özel ablasyon bileşenlerini kontrol etmek erişir. Not: Lazer yoğunluğunun kombinasyonu (Şekil 3C, 8), tarama hızı ve aşama 3,2 (Şekil 3B, 4 ve 5) &#39;de ayarlanır tekrarlama, sayısı olarak ayarlanmış olan ortalama 3.5 (Şekil 3E adım12), bu nedenle ağartma verimliliği ROI UV lazer toplam bekleme zamanını belirlemek ve edecektir. <ol><li> Ağartma prosedürü (Şekil 3C, 8) için aktive ederek 405-nm lazer Engage. NOT: - Bizim deney düzeneği içinde% 80 yukarıda belirtilen ayarlarla çoğu başarı 60 arasında 405 nm lazer yoğunlukları ile elde edilmiştir. Bu lazer güç çıkışı enstrüman özgüdür ve her konfokal kurulum için farklı olacağını unutmayın. </li><li> Bu nedenle bekleme süresini maksimize tarama alanını azaltarak seçilen ROI ağartma yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için bir seçenek &quot;zoom&quot; (Şekil 3C, 7) kullanın. Alternatif olarak, bu işlem için seçim yazılımı &quot;Bleach noktası&quot; seçeneğini kullanın. </li></ol></li><li> Görüntü elde etme rüzgarda çizim araçlarından birini kullanarak ablasyonu için bir ya da birden fazla ROI&#39;leri (Şekil 3B, 10) seçinizOw (Şekil 3D, 9). 8 mikron - yaklaşık 4 dairesel çizim aracı ile, örneğin, akson tepecik hedefleyin. NOT: ablasyon alan uygulamaya bağlı olarak daha geniş bir alana tek bir pikselin, ayarlanabilir. </li><li> ROI kurduktan sonra, &quot;Zaman Kursu&quot; tuşuna (Şekil 3E, 11) seçin ve ROI (Şekil 3E, 12) ablasyon / taranır döngü sayısını onaylayın. ağartma işleminden sonra hemen önce ve hemen tüm görüntünün bir bakış izin istendiği gibi &quot;Ön Bleach&quot; ve &quot;Post-Bleach&quot; kare seçin. </li><li> Gerekli tüm ablasyon parametreleri, basın &quot;Run Experiment&quot; (Şekil 3E, 13) ve ablasyon etkinliğini izlemek kurduktan sonra. NOT: Bizim sıkı bağlamak kurulumunda, tek bir görüntü öncesi ve uygun lazer e sıkı bağlamak devrinden sonra alınacakxcitation (EGFP ifade eden hücreler için, örneğin, 488 nm eksitasyon). Bunlar öncesi ve sonrası ablasyon resimler seçilen ablasyon parametreleri ne kadar tatmin edici ROI ağartılmış ve ne kadar etkili bir hızlı bir yargıya izin verir. </li><li> Lazer yoğunluğu ayarlanarak tekrarlayın (Şekil 3C, 8), bir tarama hızı ve ortalama (Şekil 3B, 4 ve 5) ve bir durumda tekrar (Şekil 3E, 12) seçilen YG de tamamlanmasından sonra, yüksek floresans yoğunluğunu gösterir sıkı bağlamak çevrimi. </li></ol> 4. &quot;Rescue&quot; veya Bertaraf balık dahil, Takip Prosedürü uygulayın <ol><li> Deney terminali ise, Tricaine aşırı dozda hayvan euthanize. Yumurta suyu çıkarmak ve 10 dakika boyunca anestezi stok solüsyonu ile değiştirin. ötenazi sağlamak için, kalp atışı kesilmesi için mikroskop altında kontrol edin. </li><li> İsteğe bağlı:Deney terminali değilse, ince forseps ve bir fırça ile agaroz dikkatlice balık çıkarın. Taze yumurta suda balık yerleştirin ve 15 dakika boyunca gözlem altında kurtarmak için izin verir. Normal yüzme davranışı dönerse, inkübatör balık dönün. </li><li> Kurumun onaylanan GDO&#39;lu atık akımının göre transgenik hayvanlar imha ediniz. </li></ol>

<ol><li>Becker, T. S., Rinkwitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+genomics+model+for+human+neurological+and+polygenic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a genomics model for human neurological and polygenic disorders.</a> Dev Neurobiol. 72 (3), 415-428 (2012).</li>
<li>Wilt, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+light+microscopy+for+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Advances in light microscopy for neuroscience.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 435-506 (2009).</li>
<li>Philips, T., Robberecht, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+role+of+glial+activation+in+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation in amyotrophic lateral sclerosis: role of glial activation in motor neuron disease.</a> Lancet Neurol. 10 (3), 253-263 (2011).</li>
<li>Robberecht, W., Philips, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+scene+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nat Rev Neurosci. 14 (4), 248-264 (2013).</li>
<li>White, D. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitroreductase+system+of+inducible+targeted+ablation+facilitates+cell-specific+regenerative+studies+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish.</a> Methods. 62 (3), 232-240 (2013).</li>
<li>Jagadeeswaran, P., Paris, R., Rao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+thrombosis+in+zebrafish+larvae%3A+a+novel+genetic+screening+method+for+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Laser-induced thrombosis in zebrafish larvae: a novel genetic screening method for thrombosis.</a> Methods Mol Med. 129, 187-195 (2006).</li>
<li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> J Vis Exp. (54), e2845(2011).</li>
<li>Matrone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-targeted+ablation+of+the+zebrafish+embryonic+ventricle%3A+a+novel+model+of+cardiac+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair.</a> Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).</li>
<li>Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+Ca2%2B+waves+transmit+brain-damage+signals+to+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia.</a> Dev Cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).</li>
<li>Lewis, G. M., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+nerve+transection+and+time-lapse+imaging+of+glial+cell+behaviors+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li>
<li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).</li>
<li>Villegas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Dev. 7, 19(2012).</li>
<li>O'Brien, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Soustelle, L., Aigouy, B., Asensio, M. L., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+laser+mediated+cell+selective+destruction+by+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">UV laser mediated cell selective destruction by confocal microscopy.</a> Neural Dev. 3, 11(2008).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biol. 8 (6), 1000412(2010).</li>
<li>Essentials of Biology 2. JoVE. , JoVE Science Education Database. Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques (2016).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="https://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).Vol.4th ed</a>. , Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Clark, K. J., Urban, M. D., Skuster, K. J., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+zebrafish+using+transposable+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic zebrafish using transposable elements.</a> Methods Cell Biol. 104, 137-149 (2011).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cranial+motor+neurons+in+live+transgenic+zebrafish+expressing+green+fluorescent+protein+under+the+control+of+the+islet-1+promoter%2Fenhancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer.</a> J Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).</li>
<li>Arkhipova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+regulation+of+the+hb9%2Fmnx1+beta-cell+progenitor+specific+enhancer+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish.</a> Dev Biol. 365 (1), 290-302 (2012).</li>
<li>Flanagan-Steet, H., Fox, M. A., Meyer, D., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+synapses+can+form+in+vivo+by+incorporation+of+initially+aneural+postsynaptic+specializations%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations.</a> Development. 132 (20), 4471-4481 (2005).</li>
<li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+alpha2-deficient+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (17), 7092-7097 (2007).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), 49-56 (2011).</li>
<li>Morsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+microglial+engulfment+of+dying+neurons+in+the+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord.</a> Front. Cell. Neurosci. , (2015).</li>
<li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Headwaters+of+the+zebrafish+--+emergence+of+a+new+model+vertebrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Headwaters of the zebrafish -- emergence of a new model vertebrate.</a> Nat Rev Genet. 3 (9), 717-724 (2002).</li>
<li>Lele, Z., Krone, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+system+in+developmental%2C+toxicological+and+transgenic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model system in developmental, toxicological and transgenic research.</a> Biotechnol Adv. 14 (1), 57-72 (1996).</li>
<li>Veldman, M. B., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+developmental+model+organism+for+pediatric+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research.</a> Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).</li>
<li>Kabashi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain+and+loss+of+function+of+ALS-related+mutations+of+TARDBP+%28TDP-43%29+cause+motor+deficits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Gain and loss of function of ALS-related mutations of TARDBP (TDP-43) cause motor deficits in vivo.</a> Hum Mol Genet. 19 (4), 671-683 (2010).</li>
<li>Laird, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+is+neurotrophic+in+vivo+and+protects+against+a+mutant+TDP-43+induced+axonopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Progranulin is neurotrophic in vivo and protects against a mutant TDP-43 induced axonopathy.</a> PLoS One. 5 (10), 13368(2010).</li>
<li>Lemmens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+mutant+superoxide+dismutase+1+causes+a+motor+axonopathy+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Overexpression of mutant superoxide dismutase 1 causes a motor axonopathy in the zebrafish.</a> Hum Mol Genet. 16 (19), 2359-2365 (2007).</li>
<li>Ramesh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+in+zebrafish+displays+phenotypic+hallmarks+of+motoneuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A genetic model of amyotrophic lateral sclerosis in zebrafish displays phenotypic hallmarks of motoneuron disease.</a> Dis Model Mech. 3 (9-10), 652-662 (2010).</li>
<li>Hanneman, E., Trevarrow, B., Metcalfe, W. K., Kimmel, C. B., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+pattern+of+development+of+the+hindbrain+and+spinal+cord+of+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Segmental pattern of development of the hindbrain and spinal cord of the zebrafish embryo.</a> Development. 103 (1), 49-58 (1988).</li>
<li>Lewis, K. E., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cells+to+circuits%3A+development+of+the+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">From cells to circuits: development of the zebrafish spinal cord.</a> Prog Neurobiol. 69 (6), 419-449 (2003).</li>
<li>Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-cell+autonomous+toxicity+in+neurodegenerative+disorders%3A+ALS+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond.</a> J Cell Biol. 187 (6), 761-772 (2009).</li>
<li>Philips, T., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Glial cells in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Exp Neurol. 262, Pt B 111-120 (2014).</li>
<li>Mazaheri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+BAI1+and+TIM-4+in+the+engulfment+of+dying+neurons+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia.</a> Nat Commun. 5, 4046(2014).</li>
<li>van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells+are+cleared+by+directional+migration+and+elmo1-+dependent+macrophage+engulfment%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment.</a> Curr Biol. 22 (9), 830-836 (2012).</li>
<li>Radford, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+established+and+emerging+roles+of+astrocytes+and+microglia+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The established and emerging roles of astrocytes and microglia in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> Front Cell Neurosci. 9, 414(2015).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Lazer Ablasyon Yaklaşımlar Lazer destekli ablasyon teknikleri hücrelerin bireysel ya da küçük gruplar hassas hedefleme sağlar. yüksek çözünürlüklü mikroskopi ve zebrabalıkları gibi hayvan modellerinde görülen genetik manipülasyonlar ile birleştirme tekniği araştırmacılar sistematik tek bir hücre kaderine ve yaralanma sonrası etkileşimleri çalışma sağlar. Burada tarif edilen UV (405 nm) lazer ile kesip alma protokolü tek tek hücreler stresli veya öldürülmüş seçici (doza bağlı bir şekilde), nöronlar, glia komşu iken, aksonlar zarar görmeden kalır nasıl özetlenmektedir. Biz başarıyla hücre kültürü deneylerinde bu yaklaşımı kullanılmıştır ve burada Zebra balığı omurilik ayrıntılı bir yaklaşım açıklar var. Biz seçici diğer hücreler (Şekil 5, A ve bir ağ içinde tek bir nöron vurgulayarak Zebra balığı omurilikteki bu yaklaşımın uygulanmasını göstermek <strong&gt; B) ya da hemen ve kurtarma olmayan tek bir nöronu öldürerek (Şekil 5, C ve D). Daha önce, bu tür darbeli azot lazer ya da iki-fotonlu lazer sistemleri gibi özel lazer sistemleri, doku hasarı ve motor sinir transection 10, 11, 12, 13 oluşturmak için gereken edildi. Bu lazer sistemleri başarıyla tür arterler ve venler 6 tromboz, akut böbrek hasarı 7, kardiyak hasar 8 gibi hücre hasarına, neden ve kalsiyum dalgaları ve beyin hasarı 9 sonra mikrogliyal tepkisini incelemek için kullanılmıştır. Ayrıca, Soustelle ve arkadaşları Drosophila 14 &lt;içinde epitel hasarı ve glial hücreler ikna etmek için geleneksel bir konfokal kurulum (351 nm ve 364 nm UV lazerler) kullanılır/ Sup&gt;. ALS Anlamak için Zebra balığı Modeller Uygunluk (ve Diğer İnsan Hastalıkları) Balığı, özellikle gelişim çalışmalarında 28, 29, 30 için, yaygın olarak kullanılan bir model organizma olarak. belli sınırlamalar varken, insan hastalığı modellemek ve patojenik moleküler mekanizmaları bir anlayış vermek için kendi potansiyeli çok büyüktür. Balığı modeller MSB&#39;nin çalışma için iyi kurulmuş ve önemli moleküler Insights 31, 32, 33, 34 yol açmıştır. Transgenik zebrafish hatları hızla oluşturulabilir (4-5 ay) ve belirli bir hücre tipi, onları ALS mevcut hayvan modellerinde değerli bir katkı yapmak özelliklerin seçici izleme sağlar. Zebra balığı embriyolar / larva optik şeffaf ve benzersiz bu deneyimlerden teklifbeyin veya kolayca kemirgen modellerinde elde edilen (ya da insanlarda) olamaz omurilik, tek hücre düzeyinde uzun vadeli canlı görüntüleme sağlayan zihinsel avantajları. Bu tür tek hücreli ablasyonu gibi moleküler teknikler ile kombine edildiğinde, bu in vivo kesin moleküler mekanizmaları çalışmak için eşsiz bir deneysel bir platform sağlar. Motor Nöronlar Seçici UV Lazer Ablasyonunu kullanma Hedefli Olabilir Zebra balığı spinal nöronlar doğumdan sonraki 10 saat içinde gelişmeye başlar ve sonra yaklaşık 48 saat 35 36 kurulmuştur. Bu hızlı gelişme, kısa zaman dilimlerinde ve yüksek verimlilik ile bu nöronların görselleştirme sağlar. Motor nöronlar ALS, motor korteks (üst motor nöronlar), beyin sapı ve omurilik (alt motor nöronlar) etkilendiğini, beyin ve kaslar arasında gerekli bağlantıyı sağlamak ve. Bu nöronların kaybı kaçınılmaz mu yol açarSistemik lupus atrofi ve güçsüzlük. Zebrafish omurilikteki motor nöronlar, ayırt edici projeksiyonları tarafından ve -3MNX1 gibi motor-nöron özel promoterlerin kullanımı ile tespit edilebilir. Bu tür çıkıntı nöronların hücre soma Hedefleme zaman (Şekil 4 ve Video 1) üzerinden aksonal projeksiyon boyunca ileriye dejenerasyon saptandı. Spinal motor nöronlarının Tek hücreli çözünürlüklü görüntüleme ayrıca lazer ablasyon (Şekil 4 ve Referans 27 Ek video 3&#39;e bakınız) sonra fosfatidilserin translokasyon ve buna bağlı olarak Annexin V-etiketleme doğruladı. Bizim UV lazer ablasyon yaklaşımı sonra nöronlar ölüyor içinde Annexin V aktivasyonunu rapor olmasına rağmen bu hızlandırılmış süreçte tetiklenir ölüm kaskad tam nörodejenerasyon veya normal hücre homeostazında sırasında meydana nöron ölümünü eşleştiğini, belli olamaz. Bu ablasyon yaklaşımı son derece tekrarlanabilir ikenve özel, farklı gömme stratejileri de UV ablasyon verimliliğini etkileyebilir. bizim deneyim, biz bizim balık gömülü agaroz katmanı en aza indirmek için en başarılı oldu. nedeniyle zayıflama ve meydana gelen saçılma etkileri sonuçta hücre tarafından alınan UV gücünü azaltabilir yumurta su ilave tabaka ile orta gömme kalın tabakalar ışın yolu boyunca. Gelecekte, farklı transjenik balık hatlarının kesiştiği lazerle indüklenen hücre yıkımı için, örneğin glia gibi etkilenmiş hücrelerin, tepkileri (12 saat kadar) anında ve kısa dönem gözlenmesi için izin verir. Örneğin, ALS gibi nörodejeneratif hastalıklarda astrosit olmayan hücreli bağımsız toksisite araştırması spot edilmiş ve büyük ölçüde düzensiz ve ailesel ALS 37, 38 arasında patojenite rol oynar. Bununla birlikte, mekanizma glial toksisite ve seçicilik yatanMotorun doğru nöronlar belirsizliğini koruyor. Biz ve diğerleri son zamanlarda mikroglia tarafından nöronları ölen yutulmasına incelemek için bu yaklaşımın yararlandı ve nöronal kalıntıları 27, 39, 40 temizlenmesini görüntülendi. yüksek çözünürlüklü mikroskopi ve nöro için işaretleri ile ablasyon tekniği birleştiren gelecekte araştırmacılar tek hücre fonksiyonu ve birbirine pili sistemlerinin anlaşılmasını genişletmek için izin verecektir. In vivo ortamda bu işlemlerin karakterizasyonu gelişim ortamlarda hem de hücresel etkileşimler 3 bozulmuş olabilir MSB, 41 dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların, modellerinde, sadece önemlidir.

Floresan mikroskobu uzun zebrabalıkları MSS transgenlerin, kalkınma 1 özellikle etkileri etkilerini incelemek için kullanılır olmuştur. Yüksek çözünürlüklü mikroskopi beyin gelişimi, kas üretimi, ve diğer birçok gelişimsel olayların 2 katılan hücresel süreçlerin detaylı haritalama izin verdi. Tek bir hücrenin ölümünü incelenmesi esas olarak standart görüntüleme işlemleri sırasında seçici hücre ölümünü teşvik teknik zorluklar, daha zor olmuştur. Ancak, tek hücreli çözünürlükte görüntüleme ve yüksek hedefli ablasyon tekniklerinin birleşimi sonucu hücre-hücre etkileşimleri yanı sıra, stres ve yaralanma anında hücresel yanıtları soruşturma sağlar. Bu süreçlerin daha iyi anlaşılması, özellikle, nöron glia etkileşimleri ilerlemesine katkıda bulunduğu gösterilmiştir motor nöron hastalığı (MSB), nörodejeneratif hastalıklar, kritikHastalığın 3. MSB, ya da Amyotrofik lateral skleroz (ALS), beyin sapı, motor korteks ve omurilikteki motor nöronlarını etkileyen yıkıcı bir nörodejeneratif bir hastalıktır. Bu nöronların kaybı, kas kaybına yol açar ve hastalar 3 içinde ölür - tanı 4 5 yıl. kas lifleri omurilik renkli motor nöron ve kas kasılması kolaylaştıran bir rol oynamaktadır. Bu nöronların bu iletişim veya ölüm başarısızlığı giderek kasları zayıflatır ve yutmak yürümek, konuşmak ve nefes hastanın yeteneğini etkiler. canlı bir hayvanda bir motor nöron ve kısa vadeli sonuçların ölümünü görselleştirme daha normal hücre homeostazında ve hastalıkta rol dinamik süreçleri anlamak için mükemmel bir fırsat sağlar. Balığı nörodejeneratif hastalıklar 1 çalışma için cazip bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. BuBu dış döllenme kısa gelişim süresi, sinir sistemine bir optik erişim ve transgenesis kolaylığı gibi, bu model organizma sunduğu avantajlardan kaynaklanmaktadır. Buna ek olarak, kolay bileşiği, transjenik zebrafish oluşturma yeteneği, farklı hücre tipleri çok markalama stratejileri sağlar. Genetik ablasyon spesifik hücre tipleri oldukça geniş rahatsızlık verir, ancak tek tek hücrelerin 5 hedefleme iyi denetim eksikliği öldürmek için yaklaşımlar. Lazer destekli teknikleri, diğer taraftan, ince geçici ve aralıklı kontrolünün sağlar ve farklı hayvan modellerinde kullanılmıştır. Iken gibi çoğu yaklaşımlar kullanmak özel ekipman, lazer yazıcılarını 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ya da iki-foton set-up&#39;lar 13 darbeliaraştırma grupları son zamanlarda geleneksel konfokal mikroskoplar 14 UV lazer avantajı almış. Burada anlatılan teknik, seçilen motor nöronlarda doza bağlı bir şekilde hücre stres veya ölüme neden UV lazer kaynaklı yaklaşım yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi birleştirir. Bu, hücre kültüründe ve yaşam hayvanlarda başarıyla test edilmiştir yaygın olarak yüklenmiş 405-nm lazer kullanımına dayanır ve bu nöronal ölümünden sonra mikrogliyal açıklık gibi hücresel etkileşimleri, detaylı karakterizasyonu sağlar.

<table><tbody><tr><td>Agaroz düşük erime noktalı</td><td>Fisher-Scientific</td><td></td><td>Yumurta suyunda trikain (% 0.02) ile% 0.8 - 1.5</td></tr> <tr><td>Trikain</td><td>Argent Labs</td><td>MS-222</td><td>0.02</td></tr><tr><td>% Harvard standart duvar Borosilikat filament ile Kılcal Cam</td><td>Dünyası Hassas Aletler, Inc.</td><td>GC100F-10 (kısa) GC100F-15 (uzun)</td><td>2 - 7 M&Omega direncine çekin;</td></tr><tr><td>Yumurta suyu&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0,6 g Instant Ocean deniz tuzu, 10 L deiyonize suda 4 mL 1 mg/mL metilen mavisi</td></tr><tr><td>1-fenil-2-tiyoüre (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Isı bloğu</td><td>Select BioProducts</td><td>Dijital blok ısıtıcı (SBD110_)</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon aparatı</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>Mikroenjeksiyon, yüklü bir cam iğne ve bir Picospritzer II (General Valve corporation) ile bir steromikroskop (Leica) altında elle gerçekleştirildi</td></tr>. <tr><td>Stereoskop</td><td>Leica</td><td></td><td>Parlak alan aydınlatma mikroskobu, bir Leica M165FC stereo diseksiyon mikroskobu (Leica)</td></tr> <tr><td>Mikroskobu</td><td>Leica&nbsp;</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>35 mm cam alt çanak</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr></tbody></table>

konvansiyonel uv lazer konfokal mikroskopi kullanılarak tetikleme hücre stres ve Ölüm

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Standart bir konfokal kurulum kullanılarak, hücresel hasarı seçici olarak indüklemek ve CNS'deki tek hücreli yanıtları ve hücre-hücre etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için bir UV ablasyon yöntemi kullanılabilir. Önceden, yaralanmadan sonra bu hücreye özgü tepkileri incelemek, genellikle karmaşık kurulumlar veya hücrelerin veya hayvanların farklı, fizyolojik olmayan ortamlara aktarılmasını gerektiriyordu, bu da anlık ve kısa vadeli analizleri karıştırıyordu. Örneğin, ilaç aracılı ablasyon yaklaşımları genellikle tek hücreli yanıtları ve anında hücre-hücre etkileşimlerini incelemek için gereken özgüllükten yoksundur. Benzer şekilde, yüksek güçlü darbeli lazer ablasyon yaklaşımları çok iyi kontrol ve doku penetrasyonu sağlarken, hücresel yanıtların gerçek zamanlı görselleştirilmesini zorlaştırabilecek özel ekipman gerektirirler. Burada açıklanan rafine UV lazer ablasyon yaklaşımı, araştırmacıların 405 nm lazerle donatılmış geleneksel bir konfokal mikroskop kullanarak tek bir hücreyi doz ve zamana bağlı bir şekilde strese sokmalarına veya öldürmelerine olanak tanır. Yöntem, zebra balığı omuriliğindeki yoğun bir çevreleyen hücre ağı içindeki tek bir nöronu seçici olarak ablate etmek için uygulandı. Bu yaklaşım, ablasyonlu nöronların doza bağlı bir tepkisini ortaya çıkardı ve hücresel cisimlerin parçalanmasına ve akson boyunca dakikalar ila saatler içinde anterograd dejenerasyona neden oldu. Bu yöntem, araştırmacıların ölmekte olan tek bir hücrenin kaderini ve daha da önemlisi, ablasyon bölgesini çevreleyen mikroglia ve astrositler gibi hücrelerin anlık tepkisini incelemelerine olanak tanır.

Burada tarif edilen yöntem, ticari konfokal mikroskop FRAP modülü kullanılarak zebra balığı omurilikteki motor nöron ablasyon sağlar. Gibi özel promotörlerin kontrolü altında nöronlarda yeşil floresan protein ifade eden bir transjenik zebra balığı hatları - 3mnx1, islet1 veya araya kullanılmıştır. (Örneğin -3mnx1 veya tanıştığımız) motor nöron organizatörü tarafından tahrik GFP ifade hücre gövdeleri, ana akson ve kaslara uzanan çevresel dalları (Şekil 4 ve Video 1) yüksek çözünürlüklü görselleştirme sağlar. 3. Başarılı ablasyon olduğunu adımda açıklanan% 70 ~ bir lazer gücü ve genel ayarlarda 80 sn - 3- 5 gün yaşlı balıkların omurilikte Nöronlar başarıyla 60 genel bir bekleme süresi ile ablasyon edilmiştir floresan ablasyonu sonrası hemen kaybolur zaman eldeve asla (Şekil 5, C ve D) devam eder. (Örneğin 488 nm lazer çizgisi gibi) diğer lazer hatları ile ablasyon girişimleri kalıcı solma neden olmadı, ve floresan kısa zaman dilimleri içinde restore edilmiştir. Önemli olarak, bu yöntem, Annexin V varlığında lizozomal dejenerasyon görünen morfolojik değişiklikler ve ablasyon nöron 27 aksonal blebbing UV ablasyon nöronların apoptotik hücre ölümünün karakteristik özelliklerini ortaya koymuştur. Bu yaklaşımın özgüllük hücresel belirtileri olmadan tek bir hedef sinir dönüştürüldü photoconvertible fluorofor Kaede (yani, UV ışığına maruz kaldıktan sonra yeşilden kırmızıya olan emisyonunu geçer), (Şekil 5 A ve B) kullanılarak yapılan deneyler ile teyit edilir birkaç saat içinde yok. Daha yüksek lazer gücü kullanımı yerine t açarO, kesip çıkarılacak bölgede (Şekil 5, C ve D) yakın hücreler (~ 20 mm) hedeflenen nöron (ölüm olmaksızın) (Resim Fotoçevrim veya floresan yeniden ortaya çıkma) ve Fotoçevrim yok oluşu. Bu lazer kaynaklı ablasyon tekniğinin önemli bir avantajı yaklaşım doz bağımlılığı. Farklı yoğunluklarda ile hedef hücrelere, ince ayar çok katmanlı (8 Şekil 3C), tarama hızı ve hat ortalama (Şekil 3B, 4 ve 5), ROI boyutu ablasyon için lazer gücünü ayarlayarak kullanılabilir (Şekil 3D, 10) ve tekrar (Şekil 3E, 12). Özellikle, bu yaklaşım aynı zamanda, hücrenin ölümünü teşvik bireysel hücrelerin hücresel stresi uygulamak için kullanılabilir. Örneğin, ince ayar olmuşturBir nöronun ölümüne sırasında hücresel süreçleri değerlendirmek için oldukça değerli. Düşük UV lazer yoğunlukları ile ablasyon yapıldı uzun akson projeksiyonlar motor nöronların karakteristik "blebbing" hedefli soma de başlamış ve zamanla akson boyunca (40 devam etmiştir (oluşumu ve hücresel veziküllerin parçalanması), ortaya - 90 dakika; Şekil 4 ; 3D) video 1 Bu ablasyon filmi render. Sonuç olarak, farklı lazer ablasyon parametreler ve dolayısıyla indüklenen hücre stresi ve ölüm zaman sürecini modüle araştırmacılara deney esneklik, yüksek düzeyde sağlar. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig1.jpg"> Şekil 1: canlı görüntüleme için zebrafish gömülmesi. (AF) canlı görüntüleme prosedürü gömülmesi: (A) Tricaine zebra balığı A uyuşturan yumurta suya eklenir 50 mg / L ta başlangıç ​​doz oranı. (B), düşük ısıda eriyen agaroz (0,8-1,5%) hazırlanmış ve 38 kadar ısıtılır - 40 ° C. Bir transfer pipeti kullanarak (C), filtrelenmiş ve seçilen zebra balığı tricaine çözeltisi ile bir çanak içine aktarılmaktadır. Başarılı sedasyon sonra, balık önceden ısıtılmış agaroz (D) aktarılır (sığ solungaç hareketi, kalp hızı, dokunmatik uyarılmış yanıt eksikliği azalma). sonraki seyreltme önlemek için agaroz aktarılır yumurta su miktarını en aza indirin. Bir cam alt 35 mm tabak üzerine zebrafish ihtiva eden - (50 uL ~ 30) (E) agaroz bir damla aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirin ve yavaşça tercih yönelimine zebrafish hizalamak için bir fırça kullanın. Agaroz ayarlamak kadar 15 dakika ve çanak (F) tricaine çözeltinin ~ 2 mL ekleyin - 10 bekleyin.ank "&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig2.jpg"> Şekil 2: 3-dpf'e zebrafish omurilik nöronların görselleştirilmesi ve mikroglia. 3 günlük eski transgenik zebrafish omurilikte mikroglia ve nöronlar görselleştirme ifade (A) GFP pozitif nöronlar (islet1: GFP) ve (B) mCherry-pozitif mikroglia (MPEG1: GAL4, UAS: mCherry). (C) birlikte parlak alan görüntü ile nöron ve mikroglia kanalının Kompozit görüntü. (C) şematik uç balık yönünü göstermektedir ve sunulan bölgeyi özetliyor. Ölçek çubuğu 30 mikron =. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 3: (protokolde tarif edilen, aşama 3), UV lazer ablasyon işleminde Adım. Adımlar konfokal yazılımı (Leica Application Suite) FRAP yazılım modülünü kontrol etmek. (A) UV lazer ablasyon gerçekleştirmek için bir araç olarak sıkı bağlamak modülü başlatılıyor. Lazerin bekleme süresi belirleyecek biçimi, hız ve ortalama alma gibi ablasyon ve diğer sıkı bağlamak ayarları z-düzlemi kurma (B). Lazer yoğunluğu ve ağartma verimliliği maksimize etmek "seçeneği yakınlaş" (C) Kontrol. Ablasyon olacaktır (D) (ROI), bir ya da birden fazla bölgelerin seçimi. Beyazlatma zaman sürecini ayarlanması (E) ağartıcı döngüleri ve ROI de genel lazer bekleme süresini belirler. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig3large.jpg" target="_blank">Onu tıklayınız</a> E bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54983/54983fig4.jpg"> Şekil 4: UV ablasyon nöronun anterograd dejenerasyon. UV-ablasyon spinal nöronun nörodejenerasyonun Time-lapse görüntüleme. (AF), tek bir omurga nöronun UV ışınlaması (buluştu: GAL4, UAS: EGFP; A; daire) aksonal parçalanma, ardından (AC) daralma ve zamanla yuvarlama nöronun soma sonuçlandı (CF; ok başları) . Aksonal dejenerasyon soma (ablasyon sitesi) başlayan ve nihayet, soma floresan kayboldu ve tüm akson "blebbing" (DF) gösterene kadar akson uzak ucuna doğru anterograd ilerledi. Ölçek çubukları 20 mikron =. Bu ablasyon 3D render time-lapse film video 1'de gösterilmiştir.es / ftp_upload / 54983 / 54983fig4large.jpg "target =" _ blank "&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54983/54983fig5.jpg"> Şekil 5: Bir motor nöron bir photoconvertible flüorofor (Kaede) ile tek hücreli UV ışıması etkisinin doğrulanması. Bir nöron içinde photoconvertible fluorofor Kaede aktivasyonu yoluyla tek hücreli UV ışınlaması Doğrulama. Kaede ile etiketlenmiş nöronların (AD), UV ışınlama. 10 saniye için% 30 bir lazer gücü ile tek bir nöron (daire) (A) Fotoçevrim sadece hedeflenen tek tek nöron (B) (yeşilden kırmızıya) Kaede bir Fotoçevrim yol açtı. dönüştürülmüş hücre birkaç saat hayatta ve bozulma hiçbir görsel işaretler, örneğin blebbing olarak veya yukarı yuvarlama gösterdi unutmayın. Tek bir nöronun Ablasyon (Cı ; daha yüksek bir lazer gücünün (10 s için% 95) olan bir daire), yaklaşık 20 um'lik bir yarıçaptaki nöronların küçük bir sayı olduğu nöron (D hemen yok olması) ve Kaede sonraki Fotoçevrim sonuçlandı. Ölçek çubukları 20 mikron =. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/54983/54983vid1.jpg"> Video 1: Şekil 4'te gösterildiği UV ablasyon nöronun 3D yüzey render (Imaris). Şekil 4'te gösterilen nöron time-lapse video görselleştirme yazılımı (Imaris, Bitplane) kullanılarak işlenen yüzeydir. Bu anterogradely hücrenin uzak ucuna doğru aksonal parçalanma ardından ablasyon soma küçülme sürecini vurgular.euron_ablation-3D_rendered.mov "target =" _ blank "&gt; Bu dosyayı indirmek için tıklayınız. Ek Şekil 1: Uzun süre görüntüleme için isteğe bağlı agaroz döküm. uzun vadeli satın alma sırasında balık ve agaroz hareketini önlemek için bir donut cam alt 35 mm çanak (A) ortasında kenarları boyunca agaroz şeklindeki daire hazırlar. 10 dakika ~ için agaroz set edelim ve agaroz (B) bir damla iç daire içine balık transfer. katıştırma için agaroz miktarını en aza indirmek (balık yönlendirici sonra dışarıya aşırı agaroz fırça) deneyin. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/Supplementary_Figure_1.jpg" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a>

Tek tek hücrelerde yönlendirilmiş strese veya ölüme neden olacak hedefli manipülasyonların gerçekleştirilmesi nispeten zor olmuştur. Burada, hücre kültüründe ve canlı hayvanlarda tek tek hücreleri seçici olarak strese sokmak ve öldürmek için tek hücre çözünürlüklü bir ablasyon yaklaşımı, standart bir konfokal UV lazere dayalı olarak açıklanmaktadır.

Konvansiyonel UV Lazer konfokal mikroskopi kullanılarak Tetikleme Hücre Stres ve Ölüm

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Bu hücre ablasyon yaklaşımının genel amacı, hücre kültüründe veya canlı hayvanlarda tek tek hücreleri seçici olarak strese sokmak veya öldürmektir. Bu yöntem, araştırmacıların ölmekte olan tek bir hücrenin kaderini ve mikroglia ve astrositler gibi hücrelerin çevredeki ablasyon bölgesine tepkisini incelemelerine olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, tek tek hücrelerin hassas bir şekilde hedeflenmesidir ve bu, 405 nanometre lazerle donatılmış normal bir konfokal mikroskop ile elde edilebilir.Motor Nöron Hastalığı veya Frontotemporal Demans gibi nörodejeneratif hastalıkları incelemek için zebra balığını model bir sistem olarak kullanıyoruz. Bir motor nöronun ölümünü ve müteakip sonuçlarını görselleştirmek, hastalıkta yer alan dinamik süreçleri daha iyi anlamak için mükemmel bir fırsat sağlar. Hücresel stresi doza bağımlı bir şekilde uygulama yaklaşımımız, hücresel etkileşimlerin ayrıntılı karakterizasyonuna izin verir.Örneğin, nueronal ölümden sonra mikroglia klirensi. Bu yöntem, canlı bir organizmanın hastalık mekanizmaları hakkında bilgi sağlarken, kültürdeki izole hücrelerde de benzer şekilde uygulanabilir. Metin protokolüne göre çiftleşme için erkek ve dişi transgenik hatları kurduktan sonra, tank suyunu süzerek başarılı yumurtlamadan sonra embriyoları toplamak için plastik bir çay süzgeci kullanın.Daha sonra yumurtaları durulamak için yumurta suyu kullanın ve bir Petri kabındaki yumurta suyuna aktarın. Döllenmeyi belirlemek için embriyoları ışık mikroskobu altında inceleyin. Daha sonra döllenmiş yumurtaları 28 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Embriyolar döllenme veya DPF'den iki ila beş gün sonrasına ulaştığında, bunları bir floresan bileşik mikroskobu altına yerleştirin ve embriyoları uygun florofor ekspresyonu için tarayın. Daha sonra, parlak etiketli balıkları daha sonra gömmek için yumurta suyuyla taze bir tabağa ayırın. Zebra balığını agaroza gömmek için, yumurta suyu içeren bir Petri kabına litre başına dört gram MS 222 damla damla ekleyerek bir anestezi solüsyonu hazırlayın.Düşük erime noktalı agaroz ve yumurta suyu stoğu hazırlayın ve 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine koyun. 38 ila 40 santigrat derecede bir ısı bloğuna bir alikot yerleştirin ve dengelenmesine izin verin. Dört saatten uzun görüntüleme süreleri için, ortasında küçük bir açıklık bulunan çörek şeklinde bir daire hazırlamak için cam tabanlı bir tabağın iç çemberi boyunca yaklaşık 300 mikrolitre agaroz pipetleyin.Zebra balığını mikroskopi için agaroza monte etmek için, balığı metin protokolüne göre uyuşturduktan sonra, bir larva çekmek için ayarlanabilir bir pipet kullanın ve ucun dibine batmasına izin verin. Larvaları minimum hacimde sıvı içinde önceden ısıtılmış agaroz içine bırakın. Daha sonra balığı agarozla birlikte hazırlayın ve önceden hazırlanmış, cam tabanlı 35 milimetrelik bir tabağa hızlıca dağıtın.Diseksiyon mikroskobu altında, hayvanı veya birden fazla hayvanı agaroz içinde yanlarına yerleştirmek için standart bir boya fırçası kullanın, böylece gövde ve kuyruk düz olur. Gömülü balığın, agaroz sıkıca ayarlanana kadar 10 ila 15 dakika oturmasına izin verin. Ardından, 35 milimetrelik Petri kabını dikkatlice doldurmak için yaklaşık iki mililitre trikadlı yumurta suyu kullanın.Petri kabını gömülü bir larva ile konfokal mikroskop aşamasına yerleştirin ve parlak alan aydınlatması ve 40x büyütme kullanarak hayvanın omuriliğinin sırt tarafına odaklanın. Uygun bir floresan ayarına geçin ve tüm görüntüleme parametrelerinin sonraki ablasyon için gerektiği gibi olduğunu doğrulamak için ilgilenilen yapıyı görselleştirin. UV lazer ablasyonu için yapının kalınlığını belirlemek için, manuel olarak yukarı ve aşağı odaklanarak ilgilenilen yapının üst ve alt kısımlarını doğrulamak için Z sürücüsünü kullanın.Kesilecek olan Z düzlemini manuel olarak kaydedin. Örneğin, hücrenin merkezi. Lazer ablasyonu gerçekleştirmek için, yazılım menüsünün üst kısmındaki açılır menüye tıklayarak FRAP Sihirbazını başlatın.Yeni pencereden, formatı, tarama hızını ve ortalamayı seçerek ablasyon yaklaşımı için görüntü parametrelerini belirleyin. Ablasyon için Z düzlemi henüz seçilmemişse, Canlı düğmesine basın ve floresan yapı veya ablasyon için istenen Z düzlemi netlenene kadar numuneye odaklanın. Genel görüntü parametreleri ayarlandıktan sonra, belirli ablasyon bileşenlerini kontrol etmek için Ağartma adımına erişin.Daha sonra 405 nanometre lazeri beyazlatma işlemi için aktive ederek devreye sokun. Ardından, tarama alanını azaltarak ve böylece bekleme süresini en üst düzeye çıkararak seçilen ROI'de ağartma yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için Yakınlaştır seçeneğini kullanın. Görüntü Alma penceresindeki çizim araçlarından herhangi birini kullanarak ablasyon için bir veya daha fazla ROI seçin.Örneğin, yaklaşık dört ila sekiz mikrometrelik dairesel çizim aletiyle akson tepeciğini hedefleyin. ROI'yi belirledikten sonra, Zaman Kursu düğmesini seçin ve ROI'lerin taranacağı ve kesileceği döngü sayısını onaylayın. Ağartma işleminden hemen önce ve hemen sonra tüm görüntünün genel bir bakışını sağlamak için Ağartma Öncesi ve Ağartma Sonrası çerçeveleri istediğiniz gibi seçin.Bu ayarlar, araştırmacılara birden fazla iyileştirme katmanı sağlar. Lazer gücünün, tarama hızının, çizgi ortalamasının, ilgilenilen bölgenin boyutunun ve tekrarların ayarlanması yoluyla bu teknik, tek tek hücrelerde strese veya ölüme neden olmak için yüksek derecede serbestlik sunar. Gerekli tüm ablasyon parametrelerini belirledikten sonra, Deneyi Çalıştır'a basın ve ablasyonun verimliliğini izleyin.Daha fazla ayrıntı için metin protokolüne bakın. Bu deneyde, transgenik zebra balığının omuriliğindeki GFP eksprese eden motor nöronlar üzerinde UV lazer ablasyonu gerçekleştirildi. 3 MINX one, IO one veya MET gibi motor nöron promotörleri tarafından yönlendirilen GFP ekspresyonu, hücre gövdelerinin, ana aksonların ve kaslara uzanan periferik dalların yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine olanak tanır.Omurilikteki nöronların başarılı bir şekilde ablasyonu, floresan ablasyondan hemen sonra kaybolduğunda ve asla devam etmediğinde elde edilmiştir. Bu yaklaşımın özgüllüğü, UV ışığına maruz kaldıktan sonra emisyonunu yeşilden kırmızıya çeviren fotoconvertible fotofluro Kaede kullanılarak tek bir hedeflenen nöronun dönüştürüldüğü burada gösterildiği gibi doğrulanmıştır. Farklı yoğunluklara sahip hücreleri hedeflemek için, lazer gücünü, tarama hızını, çizgi ortalamasını, kesilecek ROI'nin boyutunu ve tekrarları ayarlayarak çok sayıda ince ayar katmanı mevcuttur.Burada gösterildiği gibi, daha düşük UV lazer yoğunlukları ile somada ablasyona yapılan uzun aksonal projeksiyonlara sahip motor nöronlar, zamanla somadan akson boyunca devam eden karakteristik kanama ortaya çıkardı. Bu prosedürü denerken, her bir konfokal kurulumun benzersiz olduğunu ve her cihaz için lazer güç çıkışının spesifik olduğunu ve farklı olabileceğini hatırlamak önemlidir. İşlemi takiben, ablasyonlu nöronlarda apoptotik hücre ölümünün karakteristik özellikleri görülebilir.XN 5 gibi apoptotik belirteçler veya somal dejenerasyon veya eksternal kanama gibi morfolojik değişiklikler tekrarlanabilir şekilde tespit edilebilir. Omurilikteki tek veya çoklu nöronların ablasyonundan yüzme performansının nasıl etkilendiği gibi daha fazla soruyu yanıtlamak için ek testler yapılabilir. Araştırmacılar, farklı transgenik zebra balığı çizgilerini geçerek, diğer hücrelerin lazerle indüklenen hücre yıkımına tepkisini araştırabilirler.Bu yöntemler, in vivo olarak MND gibi bir hastalığın kesin moleküler mekanizmalarını anlamak için benzersiz bir deneysel platform sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığının konfokal mikroskopi için nasıl hazırlanacağını ve tek hücreli UV lazer ablasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

triggering-cell-stress-death-using-conventional-uv-laser-confocal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Source: Morsch, M.,  vd. al., Konvansiyonel UV Lazer Konfokal Mikroskopi Kullanarak Hücre Stresini ve Ölümünü Tetikleme. J. Vis. Exp. (2017) Bu videoda, transgenik zebra balıklarında tek tek nöronları hassas bir şekilde hedeflemek ve incelemek için yüksek yoğunluklu UV lazer ablasyon tekniğini keşfediyoruz. Yaralanma ve iyileşmenin hücresel dinamiklerini vurgulayarak nöronal tepkilerin nasıl hazırlanacağını, hareketsiz hale getirileceğini ve görselleştirileceğini gösteriyoruz.

Konfokal Mikroskop Kullanılarak Zebra Balığı Larvasında Seçici Tek Nöron Lazer Ablasyonu

1.94 μm sürekli dalga lazer radyasyonunu kullanarak bir kültür çanağındaki hücreleri ısıtmak için orijinal bir deney düzeneği burada tanıtıldı. Bu yöntemi kullanarak, farklı termal pozlamalardan sonra retina pigment epitel (RPE) hücrelerinin biyolojik cevapları araştırılabilir.

Hücresel Termal Etkileri İncelemek İçin Kültür Hücrelerini Isıtma İçin Sürekli Dalga Tribün Lazeri

Lazerler sıklıkla DNA hasarına hücre tepkisinin çalışmada kullanılır. Bununla birlikte, normal koşullar altında, aralık, sıklık, ve çarpışmalar çoğaltma çatal nadiren karakterize lezyonlar üretir. Burada, lazer lokalize kol içi çapraz bağlar ile bu parametrelerin belirlenmesini sağlayan bir yaklaşım açıklar.

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

Lazer microirradiation yaşayan hücrelerde DNA onarım çalışmaları için yararlı bir araçtır. Çeşitli DNA lezyonlar ikna etmek için UVA lazerler kullanımı için bir metodolojik yaklaşım gösterilir. Normal hücre döngüsü tutar yerel microirradiation için bir yöntemi optimize; Böylece, ışınlanmış hücre mitoz devam edin.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Bu protokol lazer microirradiation DNA hasar, nispeten basit kırılmalara ve DNA hasar sinyal ve onarım faktör montaj hasar sitelerde içinde vivo çalışmaya karmaşık hasarı gibi farklı türde ikna etmek için nasıl kullanılacağını açıklamak için hedeftir .

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

DNA hasar inducing ve DNA onarım proteinler seçili alt nükleer alanlarda yanıt izlemek confocal floresan mikroskopi ve lazer mikro-ışınlama teklif araçları. Bu teknik, hasar tespiti, sinyal ve işe alım ile ilgili bilgilerimizi önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu el yazması tek ve Çift Kişilik strand sonu onarım incelemek için bu teknolojilerin gösterir.

Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde

Bu iletişim kuralı açıklar caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC); Başlatan caspases, indüklenen yakınlığı hangi onların harekete geçirmek için ilk adımdır görselleştirmek için kullanılan bir görüntüleme tabanlı yöntemi.

Caspase harekete geçirmek Bimolecular floresan uluslara kullanarak yolları kadar aydınlatma

DNA hasar onarım Kinetik eğitim lezyonlar tanımlanmış alt nükleer bölgeler itibariyle ikna etmek için bir sistem gerektirir. Biz bir yöntem bir 405 nm lazer ile donatılmış lazer tarama confocal mikroskop kullanarak yerelleştirilmiş çift iplikçikli kesmeleri oluşturmak ve tamir faktörler bu lezyonlar, dinamikleri ölçmek için otomatik yordamlar sağlar açıklar.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

Sıkı odaklı femtosaniye lazer, gerçek zamanlı gözlem ve fotostimülasyon sağlayan bir Konfokal mikroskopiye birleştirilerek hücrelere hassas stimülasyon sağlayabilir. Fotostimulasyon, ERK sinyalizasyon yolu ve reaktif oksijen türlerinin mitokondriyal yanıp sönme dahil olmak üzere hücre moleküler olaylarını etkinleştirebilir.

Femtosecond lazer tarafından fotostimulasyon hedef hücrelerde Ekstrelüler-sinyal düzenlenmiş kinaz (ERK) sinyalizasyon veya mitokondriyal olayları etkinleştirir

Bu protokol, fare oküler yüzey hücrelerinden canlı birincil kültürlerde reaktif oksijen türlerinin (ROS), canlı hücrelerin ve ölü hücrelerin eşzamanlı olarak tespitini göstermektedir. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iyodür ve Hoechst boyama ros, ölü hücreleri ve canlı hücreleri değerlendirmek için kullanılır, sırasıyla, görüntüleme ve analiz izledi.

Ultraviyole-C (UV-C) Hasarına Yanıt Olarak Birincil Fare Oküler Yüzey Hücrelerinde/Kök Hücrelerinde Oksidatif Hasarın Değerlendirilmesi

Bu protokol, lazer mikro ışınlama ile DNA onarım proteini alımını ölçmek gibi aşağı akış mikroskopi çalışmaları için S faz hücrelerini verimli bir şekilde tanımlamak için invaziv olmayan bir yöntemi açıklar.

S Aşamasında DNA İşe Alımını İncelemek için Lazer Mikro Işınlama

Öğrenin, UV lazer konfokal mikroskopi kullanarak tek hücre çözünürlüğünde ablasyon yapmayı ve Danio rerio ile nörodejeneratif hastalık mekanizmalarını incelemeyi. Bu yöntem, hücre stresi ve ölümü tetikleyerek mikroglia tepkilerini analiz etmenizi sağlar.

Konvansiyonel UV Lazer konfokal mikroskopi kullanılarak Tetikleme Hücre Stres ve Ölüm

Daha fazla video keşfet