Konvansiyonel UV Lazer konfokal mikroskopi kullanılarak Tetikleme Hücre Stres ve Ölüm

Bu hücre ablasyon yaklaşımının genel amacı, hücre kültüründe veya canlı hayvanlarda tek tek hücreleri seçici olarak strese sokmak veya öldürmektir. Bu yöntem, araştırmacıların ölmekte olan tek bir hücrenin kaderini ve mikroglia ve astrositler gibi hücrelerin çevredeki ablasyon bölgesine tepkisini incelemelerine olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, tek tek hücrelerin hassas bir şekilde hedeflenmesidir ve bu, 405 nanometre lazerle donatılmış normal bir konfokal mikroskop ile elde edilebilir.

Motor Nöron Hastalığı veya Frontotemporal Demans gibi nörodejeneratif hastalıkları incelemek için zebra balığını model bir sistem olarak kullanıyoruz. Bir motor nöronun ölümünü ve müteakip sonuçlarını görselleştirmek, hastalıkta yer alan dinamik süreçleri daha iyi anlamak için mükemmel bir fırsat sağlar. Hücresel stresi doza bağımlı bir şekilde uygulama yaklaşımımız, hücresel etkileşimlerin ayrıntılı karakterizasyonuna izin verir.

Örneğin, nueronal ölümden sonra mikroglia klirensi. Bu yöntem, canlı bir organizmanın hastalık mekanizmaları hakkında bilgi sağlarken, kültürdeki izole hücrelerde de benzer şekilde uygulanabilir. Metin protokolüne göre çiftleşme için erkek ve dişi transgenik hatları kurduktan sonra, tank suyunu süzerek başarılı yumurtlamadan sonra embriyoları toplamak için plastik bir çay süzgeci kullanın.

Daha sonra yumurtaları durulamak için yumurta suyu kullanın ve bir Petri kabındaki yumurta suyuna aktarın. Döllenmeyi belirlemek için embriyoları ışık mikroskobu altında inceleyin. Daha sonra döllenmiş yumurtaları 28 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

Embriyolar döllenme veya DPF'den iki ila beş gün sonrasına ulaştığında, bunları bir floresan bileşik mikroskobu altına yerleştirin ve embriyoları uygun florofor ekspresyonu için tarayın. Daha sonra, parlak etiketli balıkları daha sonra gömmek için yumurta suyuyla taze bir tabağa ayırın. Zebra balığını agaroza gömmek için, yumurta suyu içeren bir Petri kabına litre başına dört gram MS 222 damla damla ekleyerek bir anestezi solüsyonu hazırlayın.

Düşük erime noktalı agaroz ve yumurta suyu stoğu hazırlayın ve 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine koyun. 38 ila 40 santigrat derecede bir ısı bloğuna bir alikot yerleştirin ve dengelenmesine izin verin. Dört saatten uzun görüntüleme süreleri için, ortasında küçük bir açıklık bulunan çörek şeklinde bir daire hazırlamak için cam tabanlı bir tabağın iç çemberi boyunca yaklaşık 300 mikrolitre agaroz pipetleyin.

Zebra balığını mikroskopi için agaroza monte etmek için, balığı metin protokolüne göre uyuşturduktan sonra, bir larva çekmek için ayarlanabilir bir pipet kullanın ve ucun dibine batmasına izin verin. Larvaları minimum hacimde sıvı içinde önceden ısıtılmış agaroz içine bırakın. Daha sonra balığı agarozla birlikte hazırlayın ve önceden hazırlanmış, cam tabanlı 35 milimetrelik bir tabağa hızlıca dağıtın.

Diseksiyon mikroskobu altında, hayvanı veya birden fazla hayvanı agaroz içinde yanlarına yerleştirmek için standart bir boya fırçası kullanın, böylece gövde ve kuyruk düz olur. Gömülü balığın, agaroz sıkıca ayarlanana kadar 10 ila 15 dakika oturmasına izin verin. Ardından, 35 milimetrelik Petri kabını dikkatlice doldurmak için yaklaşık iki mililitre trikadlı yumurta suyu kullanın.

Petri kabını gömülü bir larva ile konfokal mikroskop aşamasına yerleştirin ve parlak alan aydınlatması ve 40x büyütme kullanarak hayvanın omuriliğinin sırt tarafına odaklanın. Uygun bir floresan ayarına geçin ve tüm görüntüleme parametrelerinin sonraki ablasyon için gerektiği gibi olduğunu doğrulamak için ilgilenilen yapıyı görselleştirin. UV lazer ablasyonu için yapının kalınlığını belirlemek için, manuel olarak yukarı ve aşağı odaklanarak ilgilenilen yapının üst ve alt kısımlarını doğrulamak için Z sürücüsünü kullanın.

Kesilecek olan Z düzlemini manuel olarak kaydedin. Örneğin, hücrenin merkezi. Lazer ablasyonu gerçekleştirmek için, yazılım menüsünün üst kısmındaki açılır menüye tıklayarak FRAP Sihirbazını başlatın.

Yeni pencereden, formatı, tarama hızını ve ortalamayı seçerek ablasyon yaklaşımı için görüntü parametrelerini belirleyin. Ablasyon için Z düzlemi henüz seçilmemişse, Canlı düğmesine basın ve floresan yapı veya ablasyon için istenen Z düzlemi netlenene kadar numuneye odaklanın. Genel görüntü parametreleri ayarlandıktan sonra, belirli ablasyon bileşenlerini kontrol etmek için Ağartma adımına erişin.

Daha sonra 405 nanometre lazeri beyazlatma işlemi için aktive ederek devreye sokun. Ardından, tarama alanını azaltarak ve böylece bekleme süresini en üst düzeye çıkararak seçilen ROI'de ağartma yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için Yakınlaştır seçeneğini kullanın. Görüntü Alma penceresindeki çizim araçlarından herhangi birini kullanarak ablasyon için bir veya daha fazla ROI seçin.

Örneğin, yaklaşık dört ila sekiz mikrometrelik dairesel çizim aletiyle akson tepeciğini hedefleyin. ROI'yi belirledikten sonra, Zaman Kursu düğmesini seçin ve ROI'lerin taranacağı ve kesileceği döngü sayısını onaylayın. Ağartma işleminden hemen önce ve hemen sonra tüm görüntünün genel bir bakışını sağlamak için Ağartma Öncesi ve Ağartma Sonrası çerçeveleri istediğiniz gibi seçin.

Bu ayarlar, araştırmacılara birden fazla iyileştirme katmanı sağlar. Lazer gücünün, tarama hızının, çizgi ortalamasının, ilgilenilen bölgenin boyutunun ve tekrarların ayarlanması yoluyla bu teknik, tek tek hücrelerde strese veya ölüme neden olmak için yüksek derecede serbestlik sunar. Gerekli tüm ablasyon parametrelerini belirledikten sonra, Deneyi Çalıştır'a basın ve ablasyonun verimliliğini izleyin.

Daha fazla ayrıntı için metin protokolüne bakın. Bu deneyde, transgenik zebra balığının omuriliğindeki GFP eksprese eden motor nöronlar üzerinde UV lazer ablasyonu gerçekleştirildi. 3 MINX one, IO one veya MET gibi motor nöron promotörleri tarafından yönlendirilen GFP ekspresyonu, hücre gövdelerinin, ana aksonların ve kaslara uzanan periferik dalların yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine olanak tanır.

Omurilikteki nöronların başarılı bir şekilde ablasyonu, floresan ablasyondan hemen sonra kaybolduğunda ve asla devam etmediğinde elde edilmiştir. Bu yaklaşımın özgüllüğü, UV ışığına maruz kaldıktan sonra emisyonunu yeşilden kırmızıya çeviren fotoconvertible fotofluro Kaede kullanılarak tek bir hedeflenen nöronun dönüştürüldüğü burada gösterildiği gibi doğrulanmıştır. Farklı yoğunluklara sahip hücreleri hedeflemek için, lazer gücünü, tarama hızını, çizgi ortalamasını, kesilecek ROI'nin boyutunu ve tekrarları ayarlayarak çok sayıda ince ayar katmanı mevcuttur.

Burada gösterildiği gibi, daha düşük UV lazer yoğunlukları ile somada ablasyona yapılan uzun aksonal projeksiyonlara sahip motor nöronlar, zamanla somadan akson boyunca devam eden karakteristik kanama ortaya çıkardı. Bu prosedürü denerken, her bir konfokal kurulumun benzersiz olduğunu ve her cihaz için lazer güç çıkışının spesifik olduğunu ve farklı olabileceğini hatırlamak önemlidir. İşlemi takiben, ablasyonlu nöronlarda apoptotik hücre ölümünün karakteristik özellikleri görülebilir.

XN 5 gibi apoptotik belirteçler veya somal dejenerasyon veya eksternal kanama gibi morfolojik değişiklikler tekrarlanabilir şekilde tespit edilebilir. Omurilikteki tek veya çoklu nöronların ablasyonundan yüzme performansının nasıl etkilendiği gibi daha fazla soruyu yanıtlamak için ek testler yapılabilir. Araştırmacılar, farklı transgenik zebra balığı çizgilerini geçerek, diğer hücrelerin lazerle indüklenen hücre yıkımına tepkisini araştırabilirler.

Bu yöntemler, in vivo olarak MND gibi bir hastalığın kesin moleküler mekanizmalarını anlamak için benzersiz bir deneysel platform sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığının konfokal mikroskopi için nasıl hazırlanacağını ve tek hücreli UV lazer ablasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.