Tübülin Kusurlarını İncelemek için Bir Sıçan Modelinde İkinci Harmonik Nesil Görüntüleme

Bir cam slayta monte edilmiş ve bir tampona batırılmış bir sıçan beyin dokusu dilimi ile başlayın.

Sıçan, mikrotübüllerin yapı taşları olan tübülindeki kusurların neden olduğu ve anormal birikimlerine ve bozulmalarına yol açan bir durum olan tübülinoppatiden muzdariptir.

Bu aynı zamanda merkezi sinir sistemindeki miyelin üretimini de etkiler.

Ayrıntılı görüntüleme için dilimi kapalı iki fotonlu uyarma mikroskobunun altına yerleştirin.

Bütünlüğünü korumak için dilimi düzenli olarak nemlendirin.

Mikroskobu, zayıf sinyalleri tespit etmek için etiketsiz bir teknik olan taranmamış bir görüntüleme moduna ayarlayın.

Dokuyu darbeli bir kızılötesi lazere maruz bırakın.

Mikrotübüller, ikinci harmonik nesil veya SHG sinyalleri olarak bilinen algılanabilir sinyaller olarak ışık yayar.

Anormal mikrotübül birikimi olan alanlar bu sinyalleri yükselterek tespit edilebilirliklerini artırır.

Bu sinyalleri iyileştirmek için optik filtreler uygulayın.

Yakalanan görüntü, mikrotübül yoğunluğunu ve anormalliklerini ortaya çıkarır, burada yüksek SHG yoğunluğu ve kümelenme, tübül kusurlarını ve azalmış miyelin üretimini gösterir.

Numuneyi mikroskobun altına yerleştirin ve iletilen ışıkla oküler aracılığıyla doğrudan gözlem yaparak objektifin altına uygun şekilde konumlandırın. İnce bir sıvı film tüm numuneyi kaplayacak şekilde fazla HBSS'yi çıkarın. Numunenin aşırı buharlaşmasını ve kurumasını önlemek için sıvı filmi birkaç dakikada bir görsel olarak kontrol edin.

Mikroskop aşamasını, karanlık inkübasyon odasının tüm kapılarının kapatılmasını veya inkübasyon odasının siyah naylon poliüretan kaplı bir kumaşla kaplanmasını içeren, taranmamış görüntüleme için hazırlayın. İletim yolu boyunca taranmamış görüntüleme modunu seçin. Bu şekilde, tübülinin zayıf SH sinyalinin yakalanması optimize edilecektir.

Ardından reklam verme amacını seçin. Ardından, 12,6 mikrosaniye piksel bekleme süresine sahip bir lazer gücü ayarlayın. 512 x 512 pikselden büyük olmayan, hız 5 ve ortalama 2 ile ortalama 15 saniyelik çekim süresi için resimler çekin. Önce 485 nanometre kısa geçiren filtre kullanarak görüntü yakalayın. Ve ikinci adımda, keskin bir 405 nanometre bant geçiren filtre ekleyin.