Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Kullanılarak Hücre Görüntüleme

Bir tampon içinde yapışmış insan nöroblastom hücreleri ile cam lamel içeren kapalı bir görüntüleme odası ile toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kurulumu ile başlayın.

Bu hücreler sinaptik vezikül zarlarına özgü floroforları eksprese eder.

Epifloresan modunda, görüntüleme için bir hücre seçin.

TIRF modunda, objektif aracılığıyla, kapak üzerinde bir nokta olarak görünen numuneye bir lazer yönlendirin.

Açıyı, yüksek kırılma indeksli cam lamel ile düşük kırılma indeksli numune arasındaki arayüzdeki kritik açıyı aşacak şekilde ayarlayın, bu da ince bir çizgi olarak görülen toplam iç yansımaya (TIR) neden olur.

TIR, en yakın membran üzerindeki floroforları uyaran bir buharlaşma dalgası üretir.

Yayılan floresan objektif tarafından toplanır ve bir kamera tarafından yakalanır.

Lamelin yakınındaki hücre zarının yüksek kontrastlı bir görüntüsü için ince ayar yapın.

Foto ağartmayı en aza indirmek ve örnekleme frekansını ayarlamak için çekim ayarlarını optimize edin.

Kaynaşmış sinaptik vezikülleri görselleştirmek için TIRF görüntülemeye başlayın.

Epifloresan modunda, lamel üzerine odaklanın ve oda merkezine yerleştirilen transfekte edilmiş hücreleri seçin. Yazılım kontrolü altında, canlı modda çim aydınlatmasına geçin. Çim konfigürasyonunu ayarlamak için, objektiften çıkan kirişin numune kapağı üzerindeki konumunu kontrol edin. Işın objektif merceğin merkezine yerleştirildiğinde, çim numune kapağının merkezinde bir nokta görünür ve hücre epifloresan modunda görüntülenir.

Kritik açıya ulaşmak için, çim kaydırıcısındaki açı ayar vidasını kullanarak odaklanılan noktayı Y yönünde hareket ettirin. Işın, numune düzlemi üzerinde kritik açıdan daha büyük bir açıyla birleştiğinde, nokta kaybolur ve numune kapağının ortasında düz, ince, odaklanmış bir çizgi belirgindir. Çim açısına ince ayar yapmak için bir hücre örneği kullanın.

Videodaki floresan görüntüsünü izleyin. Bu aşamada, epifloresan benzeri bir görüntü hala görülebilir. Çim durumu elde edilene kadar vidayı yavaşça hareket ettirin. Burada, hücrenin yalnızca bir optik düzlemi odaktadır ve bu da yüksek kontrastlı düz bir görüntü sağlar.

Örnek görüntüleme gerçekleştirmek için tek kanallı zaman atlamalı deneyi ayarlayın. Uygun maruz kalma süreleri 40 ila 80 milisaniye arasındadır. Görüntüleri 1 veya 2 Hertz örnekleme frekansında elde edin.