Name: Değişken Açılı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskopi (VA-TIRFM) üzerine Hücre yapışma Nanotopology (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Öğrenin, hücre yapışma topolojisini nanometre hassasiyetinde ölçmek için VA-TIRFM tekniğini kullanmayı. Bu yöntem, kanserli ve kansersiz hücreler arasındaki yapışma farklarını analiz ederek hücre biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Land Baden-Württemberg ve Europäische Birliği Europäischer Fonds für die regionale Entwicklung ederim - fon ZAFH-PHOTON n, herhangi bir fon araştırma bursu için Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) için. 1792C08 yanı sıra proje &quot;Aurami&quot; finansmanı için Baden-Württemberg-Stiftung GmbH.

1. Hücre Ekici ve Kuluçka <ol><li> Tohum tek tek hücreler, örneğin, U373-MG-251 ya da U-MG, glioblastoma hücrelerinin bir cam slayt üzerinde 100 hücre / mm 2 &#39;tipik bir yoğunlukta ve (örneğin RPMI 1640 ve% 10 fetal dana serumu ile takviye kültür ortamı 4872 saat süreyle büyümelerini ve 37 bir inkübatör kullanarak antibiyotikler) ° C ve% 5 CO 2. </li><li> Bir zar işaretleyici, örneğin 6-Dodekanoil-2-dimetilamino 8 uM (kültür ortamı, 4) ya da bir işaretleyici sitoplazma &#39;lik bir konsantrasyonda 60 dakika için uygulanan naftalen (laurdan), örneğin, kalsein acetomethlyester bir 40 dakika boyunca uygulanmış olan hücreler inkübe 4,5, 5 uM 3, ışığa ya da ilişkili bir zar konsantrasyonu, örneğin, protoporfirin IX, öncülü olan 5-aminolevulinik asit (1 mM 5-ALA) ile 4 saat kuluçka üzerine indüklenen. </li><li> Kültür ortamı veya fosfat ile yıkayın hücrelerini salin (PBS) floresan mikroskobu önce tamponlu. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. VA-TIRFM <ol><li> Dik bir mikroskop, örneğin, Zeiss Axioplan kullanımı ve Ref de tarif edildiği gibi, bir aydınlatma cihazı tarafından kondansatör değiştirin. Hemi-küresel veya optik (bkz. Şekil 1) nesnenin slayt birleştiğinde hemi-silindirik cam prizma ile 3. </li><li> Paralel collimated Lazer ışını kullanarak hangi cam prizma ve tekrar ileri optik bileşenlerin (örn. içbükey ayna) numune yüzeyi (telesentrik öğrenci ışını) üzerinde paralel bir ışın sonuçlar tarafından görüntüleme sonra. Elektrik alan vektörü geliş düzlemine dik polarize olmasına özen gösterin. </li><li> Örnek düzleminde görüntülenmiş ve sıklığı değişken açılı (nesne ışını) altında örnek yanar kondenser içinde bulunan ayarlanabilir bir ayna kullanın. Her bir pozisyon sıklığı iyi tanımlanmış bir açı karşılık geldiği goniometrik ölçümler 3 tarafından belirlendiği gibi ayarlanabilir ayna, bir adım motoru tarafından tahrik edilebilir </&gt; sup. </li><li> Kritik açısı kullanılarak ayarlanabilir ayna açısal konumunun kalibre Θ c = 61.3 °, sabit bir değer olarak bir su-cam geçiş için. Θ c floresan boya (örneğin 1 mM flavin mononükleotid, FMN) suda çözülür Θ değişimi üzerine canlandırılabilir. De ayna pozisyon Θ = Θ c ayna pozisyonlama programında depolanır. </li><li> Sıcaklık, kazanç, kayıt süresi ve vardiya hız dahil kameranın parametrelerini (arka aydınlatmalı Andor Ixon EMCCD, DV887DC, ANDOR Teknoloji, Belfast, UK 6) ayarlayın. </li><li> Uygun büyütme ve tercihen orta sayısal diyafram (örneğin 40 × / 0,75 ya da 63 × / 0.90 suya daldırma) bir objektif lens kullanın ve mikroskop nesne slayt yerelleştirilmesine. Cam prizma ile numunenin optik bağlantıyı sağlamak için immersiyon yağı kullanın. Değişimi üzerine özdeş örnekleri floresans görüntüleri kaydedinaydınlatma açısı (Θ ≥ Θ Θ c ile c hücre cam arayüzü için 64,5 ° karşılık gelen). 0.5 ° veya 1 ° adımlarla 66 ° -74 ° arasında bir açı aralığı önerilir. Floresans saptama için uygun bir uzun pas veya band geçiren filtre kullanın. </li></ol> 3. Veri Analizi <ol><li> Değişik açılardan Θ yanı sıra kamera ayarlarını (arka plan ayrımcılık), dalgaboyu ve cam kırılma endeksi (= 1.52 n + 1) ve hücreler de kaydedilen görüntüleri (ASCII formatında örneğin) (n 2 = 1.37) okuyun değerlendirme programı içine (LabView; NanoCell). Için parametreler penetrasyon derinliği d (Θ) ve iletim faktörü T (Θ) her set otomatik olarak hesaplanır. </li><li> Denklem 5 (membran belirteci) veya Denklem 4 (sitoplazma işaretleyici), homojen olmayan ile bireysel görüntülere göre Δ hücre-substrat mesafeleri değerlendirilmesinde kullanılan görüntüleri seçinaydınlatma (açığa e, g. çizgili) hariç tutulabilir. </li><li> Hücre-yüzey topolojisi görüntüleri hesaplama ve görüntüleme için uygun bir renk kodu belirleyin. Şekil 2 &#39;de gösterildiği gibi tek tek piksel değerlendirilmesi profilleri boyunca, görüntülenebilir. Bu profilleri uygun kalitesi için bir gösterge olarak kullanılabilir. </li><li> Değerlendirme protokolü saklayın. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Örnek deneyler nazik Prof Oca Mollenhauer, Moleküler Onkoloji Bölümü, Güney Danimarka Üniversitesi, Odense tarafından verilen genetiği U251-MG glioblastoma hücreleri ile yürütülmektedir. Bu U251 hücreleri iki yola çıkılarak alt klonlar olarak tümör baskılayıcı genler TP53 veya PTEN kullanarak aşırı ifade edilir bir Tet-On indüklenebilir ifade sistemi, bu hücrelerin azalması tümörojenik potansiyeli sergilemek ve daha az malign olarak kabul edilebilir böyle. Supresör geni olmadan son derece malign U251-MG hücreleri kontrol grubu olarak kullanıldı ve U251-edilirMG vahşi tip hücrelerin bir başka karşılaştırma için hizmet vermektedir. Pikosaniye bakliyat, yarı sürekli bir dizi (;: 391 nm; darbe enerjisi: 12 PJ; tekrarlama oranı: dalgaboyu sürücüsü PDL 800-B, Picoquant, Berlin, Almanya ile LDH400 40 MHz) yayan bir lazer diyot bir uyarım kaynağı olarak kullanılır. Şekil olarak bir aktif TP53 tümör baskılayıcı gen ve laurdan (8 uM; 60 dk) ile inkübe U251-MG glioblastoma hücreleri 3 TIRFM görüntüleri 66.0 ° insidansı açıları, 69.0 ° ve 73.0 ° ve penetrasyon derinlikleri karşılık için tasvir edilmiştir yaklaşık 140 nm yiten elektromanyetik alan, 75 nm ve 60 nm, sırasıyla. Penetrasyon derinliği floresans azalması ile yoğunluğu azalır (terazi bakın) ve hücrelerin daha yüzeysel siteleri (üzerlerine kenarları örneğin odak kişileri) kaynaklanmaktadır. Hücre-substrat mesafeleri (0-600 nm arasında değişen bir renk kodu ile Şekil 3d görüntülenmiştir) kuvvetle üzerine arasındaki hücreleri üzerinde değişiklikly birkaç nanometre (beyaz-sarı) ve 250-300 nm (koyu kırmızı), yani odak kişileri ve daha büyük hücre-substrat mesafeleri yakın çevresinde bulunmaktadır. Şekil 4b, hücre-substrat mesafeleri U251-MG kontrolü ve 80-100 nm tipik değerleri ile vahşi tip hücreleri (sarı için oldukça sabit iken aynı bir aktifleştirilmiş baskılayıcı gen PTEN (Şekil 4d) ile U251-MG glioblastoma hücreleri için geçerlidir ) ve 150-200 nm (turuncu-kırmızı; Şekil 4a). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig1.jpg" /> Şekil 1. Dik mikroskop VA-TIRFM için aydınlatma cihazı. Bir adım motoru tarafından tahrik edilen bir ayarlanabilir ayna ± 0.25 ° &#39;lik bir açısal izin vermektedir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4133/4133fig2.jpg" /> Bir PIX için Şekil 2. Değerlendirilmesi profiliel (şematik). Ne ln [I F / T (Θ)] 1 / d (Θ) bir fonksiyonu olarak çizilir, yamaç hücre-substrat mesafe Δ temsil eder. Bu eğim, genellikle yaklaşık bir hassasiyet ±% 10 ile tespit edilir. Bir değer - homojen aydınlatma kaynaklanan - işaretlenir ve değerlendirme dışında tutulmuştur. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig3.jpg" /> Şekil 3 laurdan (8 uM, 60 dk) ile inkübasyondan sonra, aktif TP53 baskılayıcı gen ile U251-MG, glioblastoma hücrelerinin TIRFM görüntüler. Aydınlatma çeşitli açılardan (AC) de kaydedilir; 0-600 nm aralığında hücre-yüzey mesafeleri gösterildiği 391 nm, algılama: ≥ 420 nm; resim boyutu: dalgaboyu, bir renk kodu (d). 210 mikron × 210 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig3large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . Şekil 4, bir renk kodu ile gösterilen 0-600 nm aralığında U251-MG glioblatoma hücreleri hücre-yüzey mesafeleri;. (A) vahşi tip (B), kontrol, aktive baskılayıcı gen TP53 (c) hücreleri, (d) aktive supresör geni PTEN olan hücreler; dalgaboyu: 391 nm, algılama: ≥ 420 nm; resim boyutu:. 210 mikron × 210 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig4large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol><li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+reflection+microscopy%3A+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li>
<li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+%28I%29+Modelling+cell+contact+region+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li>
<li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28VA-TIRFM%29%3A+realization+and+application+of+a+compact+illumination+device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device.</a> J. Microsc. 211, 19-29 (2003).</li>
<li>Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -P., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotomography+of+cell+surfaces+with+evanescent+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Opt.+Technol%22%5BJournal%5D)">Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields.</a> Adv. Opt. Technol. 2008, 254317(2008).</li>
<li>Lassalle, H. -P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+topology+upon+ALA-PDT+using+variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28VA-TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Environ.+Pathol.+Toxicol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM).</a> J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).</li>
<li>Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+low-light+microscopy+with+back-illuminated+electron+multiplying+charge-coupled+device%3A+enhanced+sensitivity%2C+speed+and+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution.</a> J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).</li>
<li>Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+with+continuous+wave+beams%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">STED microscopy with continuous wave beams.</a> Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).</li>
<li>Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li>
<li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosensitizers%3A+therapy+and+detection+of+malignant+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).</li>
<li>Ölveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+fluorophore+distribution+in+three+dimensions+by+quantitstive+multiple+angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+vry+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+microscopy%3A+technical+innovations+and+novel+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bir yöntem olup nanometre hassas hücre-yüzey uzunluk ölçmek için açıklanmıştır. Halen, süper-çözünürlük mikroskopi yöntemleri, örneğin yapılandırılmış aydınlatma 7 veya tek molekül saptama 8-10 yanı sıra uyarılmış emisyon azalması (STED) mikroskopi 11 hatırı sayılır bir ilgi vardır dayanmaktadır. Bu teknikler hiçbiri, yine de, 50 nm altındaki bir eksenel çözünürlüğe izin vermektedir. Buna ek olarak, 50100 arasında oldukça yüksek ışınım W / cm 2 STED mikroskopi için te...

Kırılma indisi n, 1 arasında bir ortam içinden ilerleyen bir ışık ışını kırılma indisi n, 2, ikinci bir ortam bir ara yüz karşılaştığında &lt;n 1, toplam iç yansıma kritik açı daha büyük olan oran Θ tüm açılar meydana gelir Θ c = arcsin (n = 2 / n 1). Tamamen yansıyan olmasına rağmen olay ışık demeti ben göre ikinci orta ve arabirimden dik mesafe z&#39;nin katlanarak çürüklerini giren bir fani elektromanyetik alan çağrıştırıyor (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) olarak verilen, dalga boyu λ da penetrasyon derinliği ile elektromanyetik alan ve d (Θ) yoğunluğunu tekabül d (Θ) = (λ/4π) (n 1 2 sin 2 Θ - n 2 2) -1 / 2 Literatürde 1,2 bildirildiği kadarıyla, ben 0 </sub&gt; I e iletim faktörü T (Θ) ve oranı n 2 / n 1 ile çarpılır olayla ışık yoğunluğuna karşılık gelir. Bu, ışının elektrik alan vektörü geliş düzlemine (olay ve yansıyan ışın tarafından yayılmış düzlemi yani) için polarize dik ise, bu iletim faktörü tarafından verilir T (Θ) = 4 cos 2 Θ / [1 - (n = 2 / nL 1) 2] TIRFM ölçümleri de tespit edilen floresans yoğunluğu, ışık emme numune, tüm tabakaları üzerine entegre edilmiş ve ilgili boya floresans kuantum verimi ile η yanısıra algılama Ω katı açı ile çarpılarak gerekmektedir. 3. Daha önce belirtildiği gibi, bu yoğunluk ile tanımlanabilir Ben F (Θ) = (Θ) OC (z) AT E-z / d (Θ) dz Eğer bağımsız f tüm faktörler<html> florofor konsantrasyon c (Z) hemen hemen sabit olduğu için kabul edilir ise ROM geliş açısı Θ ve koordinat z deneysel sabit A. Denklem 3 içinde yer alır, analitik olarak çözülebilir - Ya da bütün koordinatlar z ≥ Δ de arayüzünden bir mesafe Δ sahip olan hücrelerinin sitoplazması içinde, örn. Bu durumda, tamamlayıcı z = Δ kadar z = ∞ elde olarak hesaplanmalıdır Ben F = A c T (Θ) d (Θ) e-Δ / d (Θ) - Ya da z arasında = Δ - t / 2 ve z = Δ + T / 2, kalınlığı t, ince bir tabaka içinde, yani, örneğin, arayüz Δ bir mesafede bulunan bir hücre membranıdır. Bu durumda, floresan yoğunluğu olarak hesaplanabilir; Ben F = A c T (Θ) te-Δ / d (Θ), t Δ ile karşılaştırıldığında küçük ise. floresans yoğunluğunu I, F görüntü değişken açılı için kaydedilir ise Eşitlik (4) ve (5) hücre-yüzey mesafeleri ent &quot;&gt; Δ, hesaplanabilir Θ, ve eğer ln (I F / T d) (denklem 4) ya da ln (I F / T) (denklem 5) bu açılar için 1 / d&#39;lik bir fonksiyonu olarak değerlendirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan zar işaretleyici laurdan (s. altında) için değerlendirme Denk. 5&#39;e göre yapıldı. Daha önce 3, görüntü elde bildirdi ve değerlendirme gerektirdiğinden dolayı - Numune üzerinde uyarma ışık homojen dağılımı, - 2-katmanlı model (yüzey ve sitoplazma için kırılma indisleri n 1 ve n 2 ile, sırasıyla) geçerlilik. Plazma zar çok ince ise, bu, tutar, ve hücre dışı ortamda (hücre ile alt tabaka arasında) tabaka gelen ışığın dalga boyu ile karşılaştırıldığında küçük ise. Buna ek olarak, bir orta açıklık sayısal(Tipik olarak A ≤ 0.90) mikroskop objektif lens dielektrik arayüz yakın alanına radyasyon anizotropi dolayı parlaklık sapmaları engellemek için avantajlıdır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Tip </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Kuluçka makinesi </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> Laminar akım </td><td> Güvenli Holten </td><td> S2010 1.2 TR GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM +% 10 FCS +% 1 penisilin / streptomisin </td><td> Biochrom </td><td></td><td> Yetiştirme ortamı </td></tr><tr><td> Cam nesne slaytlar </td><td> Marienfeld </td><td> Saf beyaz cam </td><td> Kullanılan özel temizleme prosedürü </td></tr><tr><td> 6-Dodekanoil-2-dimetilamino naftalin (laurdan) </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td> Floresan işaretleyici (Stok çözelti: Etanol içinde 2 mM) </td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Carl Zeiss </td><td> Axioplan 1 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Lazer diyot </td><td> PicoQuant </td><td> Sürücü PDL 800-B ile LDH 400 </td><td> Dalga boyu: 391 nm </td></tr><tr><td> Tek modlu fiber sistemi </td><td> Nokta Kaynağı </td><td> kineFlex </td><td> Collimating optik ile ikinci </td></tr><tr><td> EMCCD kamera </td><td> Andor </td><td> DV887DC </td><td> Arka aydınlatmalı kamera </td></tr></tbody></table>

değişken açılı toplam İç yansıma floresan mikroskopi (va-tirfm) üzerine hücre yapışma nanotopology

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Yüzey topoloji, bir substrat üzerinde büyüyen hücrelerin örneğin, Değişken Açılı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskopi (VA-TIRFM) tarafından nanometre hassasiyetle belirlenir. Hücreler şeffaf slaytlar üzerinde ekili ve homojen onların plazma membranında dağıtılan bir floresan işaretleyici ile inkübe edilir. Aydınlatma yiten elektromanyetik alanın farklı nüfuz etme derinliği olan toplam iç yansıma (TIR) ​​değişken açılı altında paralel bir lazer ışını ile gerçekleşir. Yaklaşık 10 farklı açılarda ışınlaması üzerine floresans görüntülerinin kaydedilmesi birkaç nanometre hassasiyetle hücre yüzey mesafeleri hesaplamak için izin verir. Çeşitli hücre çizgileri, örneğin, kanser hücreleri ve daha az habis hücreleri arasında yapışma farklılıkları, bu şekilde tespit edilmektedir. Buna ek olarak, kimyasal ya da fotodinamik tedavi bağlı hücre yapışmasının olası değişiklikleri kontrol edilebilir. Süper-çözünürlük diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında mikroskopi ışığa maruz tutulurcanlı hücreler, çok küçük, ve herhangi bir hasar meydana beklenmektedir.

Bir substrat üzerindeki hücre adezyon Topolojisi değişken açılı toplam iç yansıma floresan mikroskobu (VA-TIRFM) tarafından nanometre hassasiyetle ölçülür.

Değişken Açılı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskopi (VA-TIRFM) üzerine Hücre yapışma Nanotopology

Örneğin bir substrat üzerinde büyüyen hücrelerin yüzey topolojisi, Değişken Açılı Toplam İç Yansıma Floresans... yöntemiyle nanometre hassasiyetinde belirlenir.

Bu prosedürün genel amacı, bir substrat üzerindeki hücre adezyonunun topolojisini nanometre hassasiyetinde ölçmektir. Bu işlem, öncelikle şeffaf cam lamlar üzerinde hücrelerin kültüre edilmesi ve floresan bir işaretleyici ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, mikroskobun ayarlanabilir aynasının açısal konumu kalibre edilir ve bu konum ayna konumlandırma programına kaydedilir.Bir sonraki adım, yaklaşık 10 farklı açıda ışınlama sonrası floresan görüntülerini kaydetmektir. Son adım ise hücre-substrat mesafelerini birkaç nanometre hassasiyetle hesaplamaktır. Nihayetinde, substrat üzerindeki hücre adezyonunun topolojisine ilişkin sonuçlar, örneğin kanser hücreleri ve daha az malign hücreler gibi çeşitli hücre hatları arasındaki adezyon farklarını göstermek için kullanılır.Bu tekniğin konfokal mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, gerçek çözünürlüğün yalnızca birkaç nanometre aralığında olmasıdır. Bu yöntem hücre membranları hakkında bilgi sağlayabilmenin yanı sıra, küçük veziküller veya nanomalzemeler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.Deneyi, hücre örneklerini hazırlayacak olan doktora sonrası araştırmacımız Petra ve deneyi yürütecek olan mühendisimiz Michael Wagner gerçekleştirecektir. Değişken açılı, toplam internal yansıma floresan mikroskopi için hücreleri hazırlamak amacıyla, tekil hücreleri %10 fetal kalfa serumu ve antibiyotiklerle desteklenmiş kültür ortamında, cam lam üzerine milimetrekare başına 100 hücre yoğunluğunda ekiniz. Hücreleri, 37 °C ve %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde 72 saat boyunca büyütün.Ardından, hücrelere kültür ortamında 8 µM konsantrasyonunda floresan membran belirteci 6-DAPI (decano two, dimethyl amino naphthalene) veya lorane uygulayın ve floresan mikroskopisi öncesinde 60 dakika inkübe edin. Hücreleri PBS ile yıkayın; ortamı uzaklaştırmak için tampon çözeltiyi nesne lamının üzerine pipetle aktarın, ardından nesne lamının arka yüzündeki tampon çözeltiyi silerek temizleyin. Değişken açılar için, arka aydınlatmalı ve or exon E-M-C-C-D kamera ile donatılmış Zeiss Axio plan gibi dik bir mikroskop kullanılır.T-I-R-F-M sisteminde kondansatör, nesne lamına optik olarak bağlanmış hemi silindirik bir cam prizmaya sahip özel yapım bir aydınlatma cihazı ile değiştirilir. Lazer ışını, kolime edilmiş tek modlu bir fiberden gelir; bu ışın, cam prizma ve diğer optik bileşenler tarafından görüntülenen ardından örnek yüzeyinde tekrar paralel bir ışına dönüşür. Elektrik alan vektörünün, geliş düzlemine dik olacak şekilde polarize edildiğinden emin olun.Bu konum, fiberin çıkış kuplörü üzerinde işaretlenmiştir. Kondansatörün içinde yer alan, örnek düzleminde görüntülenen ve örneği değişken bir geliş açısı veya nesne ışını altında aydınlatan ayarlanabilir bir ayna kullanın. Ayarlanabilir ayna, yazılımla kontrol edilen bir step motor tarafından sürülebilir.Her bir konum, go metrikle gerçekleştirilen ölçümlerle belirlenen tanımlı bir geliş açısına karşılık gelir. Ayarlanabilir aynanın açısal konumunu kalibre etmek için, suda çözünmüş bir milimolar flavin nükleotid gibi floresan bir boya kullanın. Geliş açısı varyasyonuna bağlı olarak kritik açıyı görselleştirmek için, cam-su geçişi için 61,3 derecelik kritik açıyı sabit bir değer olarak kullanın; geliş açısının kritik açıya eşit olduğu aynanın açısal konumu, ayna konumlandırma programına kaydedilir.Kamera yazılımını kullanarak, sıcaklık kazancı, kayıt süresi ve kaydırma hızı dahil olmak üzere E-M-C-C-D kamerasının parametrelerini ayarlayın. Numunenin optik temasını sağlamak için imersiyon yağı kullanın. Cam bir prizma ile, hücreler için uygun büyütme oranına ve orta seviyede sayısal açıklığa sahip bir objektif lens seçin.Nesneyi mikroskop altında görüntülemek için, floresan deteksiyonuna uygun bir uzun geçiren veya bant geçiren filtre kullanın. Aydınlatma açısının değiştirilmesi üzerine özdeş örneklerin floresan görüntülerini kaydedin. Geliş açıları, kritik açıya eşit veya ondan daha büyük olmalıdır.Hücre-cam ara yüzü için kritik açının 64,5 derece olması nedeniyle, 0,5 derecelik veya bir derecelik adımlarla 66 derece ile 74 derece arasında bir açı aralığı önerilir. Veri analizine başlamak için, çeşitli açılarda kaydedilen görüntülerin yanı sıra kamera ayarlarını, eksitasyon dalga boyunu ve kırılma indekslerini okumak için lab view programını kullanın. Verilerin uygun şekilde değerlendirilmesi için cam için 1,52 ve hücreler için 1,37 olan ayarlar içe aktarılır.Her bir parametre seti için, prosedürün başarısı adına penetrasyon derinliği ve transmisyon faktörü otomatik olarak hesaplanır. Görüntülerin dikkatle kaydedilmesi ve analiz için seçilmesi önemlidir. Hücre-substrat mesafelerinin değerlendirilmesinde kullanılacak görüntüleri denklem doğrultusunda seçiniz.Bir membran işaretçisi için, bu örnekte gösterildiği gibi, homojen aydınlatmaya sahip bireysel görüntüler hariç tutulabilir. Hücre substrat topolojisinin görüntülerini hesaplayın ve değerlendirme sırasında görüntüleme için uygun bir renk kodu seçin. Bireysel piksellerin profilleri, bu şekilde tasvir edildiği gibi görüntülenebilir.Bu profiller, uyumun kalitesi için bir gösterge olarak kullanılabilir. Son olarak, değerlendirme protokolünü kaydedin. Bu şekil, aktive edilmiş bir TP 53 tümör baskılayıcı gene sahip U2 51 mg glioblastoma hücrelerinin toplam internal yansıma görüntülerini betimlemektedir.Çeşitli geliş açılarıyla kaydedilen inkübasyon sonucunda, yaklaşık 140 nanometrelik bir evanesan elektromanyetik alan penetrasyon derinliğine karşılık gelen 66 derece, 75 nanometrelik bir penetrasyon derinliğine karşılık gelen 69 derece ve azalan penetrasyon derinliği ile 60 nanometrelik bir penetrasyon derinliğine karşılık gelen 73 derecede, floresans yoğunluğu azalmakta ve hücrelerin kenarlarındaki fokal temaslar gibi daha yüzeysel bölgelerden kaynaklanmaktadır. Hücre-substrat mesafeleri, Panel D'de burada görüldüğü üzere sıfırdan 600 nanometreye kadar değişen bir renk kodu ile betimlenmiştir.Hücre-substrat mesafeleri, beyazdan sarıya kadar temsil edilen yalnızca birkaç nanometre ile koyu kırmızı ile temsil edilen 250 ila 300 nanometre arasında, hücreler genelinde büyük farklılıklar göstermektedir. Bu durum, fokal temasların ve daha geniş hücre-substrat mesafelerinin birbirine yakın olduğunu göstermektedir. Benzer bir hücre-substrat mesafe varyasyonu, aktive edilmiş bir tümör baskılayıcı gene sahip P 10 U2 51 mg glioblastoma hücreleri için hesaplanmıştır.Buna karşılık, hücre-substrat mesafeleri, sarı ile temsil edilen U2 51 mg kontrol hücreleri ve turuncudan kırmızıya temsil edilen vahşi tip hücreler için gelişimden sonra oldukça sabittir. Bu teknik, hücre-substrat topolojisi alanındaki araştırmacıların tümör hücrelerini ve lazer terapisi sonrası morfolojik değişiklikleri incelemelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, canlı organizmalar tarafından iyi tolere edilen düşük ışık maruziyeti altında, nanometre aralığında gerçek bir çözünürlükle yüzeylerin nasıl görselleştirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

nanotopology-cell-adhesion-upon-variable-angle-total-internal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Toplam İç Yansıma Floresans (TIRF) mikroskopi yakın yüksek kontrast ve zamansal çözünürlükte hücre yüzeyine yapıları gözlemlemek için güçlü bir yaklaşımdır. Biz TIRF hücre duvarı kapalı bakteriyel ve mantar hücreleri kortekste protein dinamiklerini incelemek için istihdam edilebilir göstermek.

Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

Bu videoda, aktin ve mikrotübül polimerizasyon dinamiklerini görselleştirmek için toplam iç yansıma mikroskobu tabanlı bir teknik olan TIRF açıklanmaktadır. Yöntem, hücresel karışmaları anlamak için gerekli olan aktin ve mikrotübül eşleşme dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine izin verir.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğini Görselleştirmek için TIRF Mikroskobu

Kaynak: Daniele, F., et. al SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde Nörotransmitter Vezikül Dinamiklerini Değerlendirmek için TIRFM ve pH'a duyarlı GFP probları: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi. J. Vis. Uzm. (2015). Bu video, florofor etiketli sinaptik vezikülleri görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak insan nöroblastom hücrelerinin görüntülenmesini göstermektedir. Hücreler ilk olarak epifloresan modunda odaklanır. Daha sonra, zarın yakınındaki floroforları...

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Kullanılarak Hücre Görüntüleme

Hızlı ve yüksek çözünürlüklü izin gelişmiş bir mikroskop düşsel hem, izole plazma zarı ve çevredeki hücre içi hacim sunulacak. Yüksek edinme hesaplı en fazla 3,5 canlı görüntüleme deneyler bir kurulum disk ve toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik entegrasyon sağlar görüntü yığını başına s.

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

Canlı hücrelerin plazma zarında ligand bağlanması ile indüklenen mEGFP etiketli-reseptör oligomerlerinin ortalama oligomerik durumunun belirlenmesi için bir görüntüleme yaklaşımını tanımladık. Protokol, Sayı ve Parlaklık (N&amp;B) analizi ile birlikte Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobuna dayanmaktadır.

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Ile Canlı Hücrelerdeki Hücre Yüzey Reseptörlerinin Oligomerizasyon Dinamiği Sayı ve Parlaklık Analizi ile Birlikte

Bu protokol, hızlı hücre yuvarlaması yapışması sırasında yapışma olaylarını görüntüleyene kadar yapışma ayak izi testini gerçekleştirmek için deneysel prosedürleri sunar.

Yapışma Ayak İzi Tahlili ile Hücre Yuvarlanmasında Görüntüleme Moleküler Yapışması

UV'ye yakın litografi ve çekiş kuvveti mikroskopisi, mikropatterned hidrojeller üzerindeki hücresel kuvvetleri ölçmek için birleştirilir. Tek hücrelerin hedeflenen ışık kaynaklı salınımı, aynı numune üzerinde yüksek sayıda ölçüm sağlar.

Çekiş Kuvveti Mikroskopisinde Uygulamalar için Hidrojel Desenleme Teknikleri Kullanılarak Hücre Yapışıklıklarının Kontrolü

Dinamik mikrotübüllerin ve floresan olarak etiketlenmiş mikrotübülle ilişkili proteinlerin eşzamanlı görüntülenmesi için girişim-yansıma mikroskobu ve toplam-iç-yansıma-floresan mikroskobu uygulamak için bir protokol sunuyoruz.

Dinamik Mikrotübülleri ve İlişkili Proteinleri Görüntülemek için Eşzamanlı Girişim Yansıması ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu

Bu protokol, in vitro toplam iç floresan (TIRF) mikroskopi testi kullanarak dinamik aktin ve mikrotübülleri görselleştirmek için bir kılavuzdur.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğinin In Vitro Total İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Görselleştirilmesi

Bu protokol, bireysel iyon kanallarını izlemek ve desteklenen lipit membranlarındaki aktivitelerini belirlemek için TIRF mikroskopisinin nasıl kullanılacağını açıklar, böylece yanal membran hareketi ile kanal fonksiyonu arasındaki etkileşimi tanımlar. Membranların nasıl hazırlanacağını, verilerin nasıl kaydedileceğini ve sonuçların nasıl analiz edileceğini açıklar.

Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi

Öğrenin, hücre yapışma topolojisini nanometre hassasiyetinde ölçmek için VA-TIRFM tekniğini kullanmayı. Bu yöntem, kanserli ve kansersiz hücreler arasındaki yapışma farklarını analiz ederek hücre biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

Değişken Açılı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskopi (VA-TIRFM) üzerine Hücre yapışma Nanotopology

Daha fazla video keşfet