Değişken Açılı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskopi (VA-TIRFM) üzerine Hücre yapışma Nanotopology

Bu prosedürün genel amacı, bir substrat üzerindeki hücre yapışmasının topolojisini nanometre hassasiyetinde ölçmektir. Bu, önce hücrelerin şeffaf cam slaytlar üzerinde yetiştirilmesi ve bunların bir floresan işaretleyici ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra mikroskobun ayarlanabilir aynasının açısal konumu kalibre edilir ve konum ayna konumlandırma programında saklanır.

Bir sonraki adım, ışınlama üzerine floresan görüntülerini yaklaşık 10 farklı açıda kaydetmektir. Son adım, hücre substrat mesafelerini birkaç nanometre hassasiyetle hesaplamaktır. Sonuç olarak, substrat üzerindeki hücre yapışmasının topolojisinin sonuçları, örneğin kanser hücreleri ve daha az kötü huylu hücreler gibi çeşitli hücre hatları arasındaki yapışma farklılıklarını göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin konfokal mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, gerçek çözünürlüğün sadece birkaç nanometre aralığında olmasıdır. Bu yöntem hücre zarları hakkında bilgi sağlayabilir. Küçük veziküller veya nanomalzemeler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Deneyi göstermek, hücre örneklerini hazırlayacak olan doktora sonrası Petra ve deneyi yürütecek olan mühendisimiz Michael Wagner olacak Hücreleri değişken açı, toplam iç yansıma için hazırlamak. Floresan mikroskobu, %10 fetal buzağı, serum ve antibiyotiklerle desteklenmiş kültür ortamında bir cam slayt üzerinde milimetre kare başına 100 hücre yoğunluğunda tek tek hücreleri tohumlar. Hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatörde 72 saat büyütün.

Daha sonra, hücrelere floresan membran, işaretleyici altı D, dekano iki, dimetil amino naftalin veya loran kültürde sekiz mikromolar konsantrasyonda uygulayın, floresan mikroskobundan önce 60 dakika boyunca orta inkübe edin. Hücreleri PBS ile yıkayın, daha sonra ortamı çıkarmak için tampon çözeltisini nesne slaytının üzerine pipetleyin, tampon solüsyonunu nesne slaytının arka tarafından silin. Değişken açı için arkadan aydınlatmalı ve/veya ekzon E-M-C-C-D kamera ile donatılmış Zeiss Axio planı gibi dik bir mikroskop kullanılır.

T-I-R-F-M, kondansatörünü, nesne kızağına optik olarak bağlanmış yarım silindirik bir cam prizmaya sahip özel yapım bir aydınlatma cihazı ile değiştirin. Lazer ışını, cam prizma ve diğer optik bileşenler tarafından görüntülendikten sonra, numunenin yüzeyinde tekrar paralel bir ışın ile sonuçlanan, harmanlanmış bir mono modlu fiberden gelir. Elektrik alan vektörünün, olay düzlemine dik olarak polarize olmasına dikkat edin.

Bu konum, fiberin çıkış kuplörü üzerinde işaretlenmiştir. Kondansatörün içinde bulunan, numune düzleminde görüntülenen ve numuneyi değişken bir olay açısı veya nesne ışını altında aydınlatan ayarlanabilir bir ayna kullanın. Ayarlanabilir ayna, yazılım tarafından kontrol edilen bir step motor tarafından tahrik edilebilir.

Her pozisyon, go metrik ilerlemeli ölçümlerle belirlenen iyi tanımlanmış bir olay açısına karşılık gelir. Ayarlanabilir aynanın açısal konumunu kalibre etmek için, suda çözünmüş bir milimolar flavin nükleotidi gibi bir floresan boya kullanın. Geliş açısının değişmesi üzerine kritik açıyı görselleştirmek için, sabit bir değer olarak bir cam su geçişi için 61,3 derecelik kritik açıyı kullanın, olay açısının kritik açıya eşit olduğu aynanın açısal konumu ayna konumlandırma programında saklanır.

Kamera yazılımını kullanarak, sıcaklık kazancı, kayıt süresi ve vites değiştirme hızı dahil olmak üzere EMCD kameranın parametrelerini ayarlayın. Numunenin optik temasını sağlamak için daldırma yağı kullanın. Bir cam prizma ile, hücreler için uygun büyütme oranına sahip bir objektif mercek ve orta sayısal açıklık seçin.

Nesneyi mikroskopta görselleştirmek için, floresan tespiti için uygun bir uzun geçiren veya bant geçiren filtre kullanın. Aydınlatma açısının değişmesi üzerine aynı numunelerin floresan görüntülerini kaydedin. Olayların açıları, kritik açı ile aynı veya daha büyük olmalıdır.

Bir hücre camı arayüzü için 64,5 dereceye karşılık gelen kritik açı ile, 0,5 derece veya bir derecelik adımlarla 66 derece ila 74 derece arasında bir açısal aralık önerilir. Veri analizine başlamak için, çeşitli açılarda kaydedilen görüntülerin yanı sıra kamera ayarlarını, uyarma dalga boyunu ve kırılma indislerini okumak için laboratuvar görünümü programını kullanın. 1,52 olan cam ve 1,37 olan hücreler için, verilerin uygun şekilde değerlendirilmesi için ayarlar içe aktarılır.

Her bir parametre seti için, penetrasyon derinliği ve iletim faktörü otomatik olarak hesaplanır Prosedürün başarısı için. Görüntülerin dikkatli bir şekilde kaydedilmesi ve analiz için seçilmesi önemlidir. Denkleme göre hücre substrat mesafelerinin değerlendirilmesi için kullanılan görüntüleri seçin.

Bir membran işaretleyicisi için, bu örnekte gösterildiği gibi homojen aydınlatma içindeki tek tek görüntüler hariç tutulabilir. Hücre substrat topolojisinin görüntülerini hesaplayın ve değerlendirme sırasında görüntülenmek üzere uygun bir renk kodu seçin. Tek tek piksellerin profilleri bu şekilde gösterildiği gibi görüntülenebilir.

Bu profiller, uyum kalitesi için bir gösterge olarak kullanılabilir. Son olarak, değerlendirme protokolünü saklayın. Bu şekil, aktive edilmiş bir TP 53 tümör baskılayıcı geni olan U2 51 mg glioblastoma hücrelerinin toplam iç yansıma görüntülerini göstermektedir.

Luan ile inkübasyon üzerine, çeşitli açılarda kaydedilen olaylar, yaklaşık 140 nanometre, 69 derece, 75 nanometre penetrasyon derinliğine karşılık gelen 69 derece ve azalan penetrasyon ile 60 nanometre penetrasyon derinliğine karşılık gelen 73 derece olan 66 derece. Derinlik floresansının yoğunluğu azalır ve hücrelerin kenarlarındaki odak kontakları gibi daha yüzeysel bölgelerinden kaynaklanır. Hücre substrat mesafeleri, burada görüldüğü gibi sıfır ile 600 nanometre arasında değişen bir renk kodu ile Panel D'de gösterilmiştir.

Hücre substrat mesafeleri, beyazdan sarıya temsil edilen sadece birkaç nanometre ve koyu kırmızı ile temsil edilen 250 ila 300 nanometre arasında hücreler üzerinde büyük farklılıklar gösterir. Bu, odak temaslarının ve daha büyük hücre substrat mesafelerinin yakın çevrede olduğunu gösterir. Hücre substrat mesafelerinde benzer bir varyasyon, aktive edilmiş bir tümör baskılayıcı gen P 10'a sahip U2 51 mg glioblastoma hücreleri için hesaplanır.

Buna karşılık, hücre substrat mesafeleri, sarı ile temsil edilen U2 51 mg kontrol hücreleri ve turuncu ile temsil edilen vahşi tip hücreler için oldukça sabittir. Bu teknik, hücre substrat topolojisi alanındaki araştırmacıların tümör hücrelerini ve lazer tedavisi üzerindeki morfolojik değişiklikleri keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, canlı organizmalar için iyi tolere edilebilen düşük ışığa maruz kaldığında nanometre aralığında gerçek bir çözünürlüğe sahip yüzeylerin nasıl görselleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.