Değişken Açılı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskopi (VA-TIRFM) üzerine Hücre yapışma Nanotopology

Bu prosedürün genel amacı, bir substrat üzerindeki hücre adezyon topolojisini nanometre hassasiyetinde ölçmektir. Bu işlem, öncelikle hücrelerin şeffaf cam lamlar üzerinde kültüre edilmesi ve floresan bir işaretleyici ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, mikroskobun ayarlanabilir aynasının açısal konumu kalibre edilir ve bu konum ayna konumlandırma programına kaydedilir.

Bir sonraki adım, yaklaşık 10 farklı açıda ışınlama sonrası floresan görüntülerini kaydetmektir. Son adım ise hücre-substrat mesafelerini birkaç nanometrelik bir hassasiyetle hesaplamaktır. Nihai olarak, substrat üzerindeki hücre adezyon topolojisinin sonuçları, örneğin kanser hücreleri ile daha az malign hücreler gibi çeşitli hücre hatları arasındaki adezyon farklılıklarını göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin konfokal mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, gerçek çözünürlüğün yalnızca birkaç nanometre aralığında olmasıdır. Bu yöntem hücre membranları hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, küçük veziküller veya nanomalzemeler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Deneyi, hücre örneklerini hazırlayacak olan doktora sonrası araştırmacımız Petra ve deneyi yürütecek olan mühendisimiz Michael Wagner gerçekleştirecektir. Değişken açılı toplam iç yansıma floresans mikroskobu için hücreleri hazırlamak amacıyla, hücreleri %10 fetal dana serumu ve antibiyotikler ile desteklenmiş kültür ortamında, bir cam lam üzerine milimetrekare başına 100 hücre yoğunluğunda ekin. Hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde 72 saat boyunca büyütün.

Ardından, hücrelere kültür ortamında 8 µM konsantrasyonda floresan membran markörü 6-DAPI (decano two, dimethyl amino naphthalene veya lorane) uygulayın ve floresan mikroskobisi öncesinde 60 dakika inkübe edin. Hücreleri PBS ile yıkayın; ortamı uzaklaştırmak için tampon çözeltiyi nesne lamının üzerine pipetleyin, ardından tampon çözeltiyi nesne lamının arka tarafından silerek temizleyin. Değişken açılar için, arka aydınlatmalı ve/veya exon E-M-C-C-D kamera ile donatılmış Zeiss Axio plan gibi dik bir mikroskop kullanılır.

T-I-R-F-M, kondansatörünü, nesne lamına optik olarak bağlanmış yarı silindirik bir cam prizmaya sahip özel yapım bir aydınlatma cihazı ile değiştirir. Lazer ışını, kolime edilmiş bir tek modlu fiberden gelir; cam prizma ve diğer optik bileşenler tarafından görüntülendikten sonra, numunenin yüzeyinde tekrar paralel bir ışın oluşturur. Elektrik alan vektörünün, geliş düzlemine dik olarak polarize edildiğinden emin olun.

Bu konum, fiberin çıkış kuplörü üzerinde işaretlenmiştir. Kondansatörün içinde yer alan, örnek düzlemine görüntülenen ve örneği değişken bir geliş açısı veya nesne ışını altında aydınlatan ayarlanabilir bir ayna kullanın. Ayarlanabilir ayna, yazılım tarafından kontrol edilen bir step motor ile sürülebilir.

Her bir konum, go metrik prosedürlü ölçümlerle belirlenen iyi tanımlanmış bir geliş açısına karşılık gelir. Ayarlanabilir aynanın açısal konumunu kalibre etmek için, suda çözünmüş bir milimolar flavin nükleotid gibi floresan bir boya kullanın. Geliş açısının değiştirilmesi üzerine kritik açıyı görselleştirmek için, cam-su geçişi için 61,3 derece olan kritik açıyı sabit bir değer olarak kullanın; geliş açısının kritik açıya eşit olduğu aynanın açısal konumu, ayna konumlandırma programına kaydedilmiştir.

Kamera yazılımını kullanarak; sıcaklık kazancı, kayıt süresi ve kaydırma hızı dahil olmak üzere E-M-C-C-D kameranın parametrelerini ayarlayın. Numunenin optik temasını sağlamak için immersiyon yağı kullanın. Bir cam prizma ile, hücreler için uygun büyütmeye ve orta düzeyde sayısal açıklığa sahip bir objektif lens seçin.

Nesneyi mikroskop altında görüntülemek için, floresans deteksiyonuna uygun bir uzun geçiren veya bant geçiren filtre kullanın. Aydınlatma açısını değiştirerek aynı numunelerin floresans görüntülerini kaydedin. Geliş açıları, kritik açıya eşit veya ondan daha büyük olmalıdır.

Hücre-cam arayüzü için kritik açının 64,5 derece olduğu göz önüne alındığında, 0,5 veya bir derecelik adımlarla 66 derece ile 74 derece arası bir açı aralığı önerilir. Veri analizine başlamak için; çeşitli açılarda kaydedilen görüntülerin yanı sıra kamera ayarlarını, eksitasyon dalga boyunu ve kırılma indislerini okumak amacıyla LabVIEW programını kullanın. Verilerin uygun şekilde değerlendirilmesi için cam için 1,52 ve hücreler için 1,37 olan ayarlar içe aktarılır.

Her parametre seti için, prosedürün başarısı adına penetrasyon derinliği ve transmisyon faktörü otomatik olarak hesaplanır. Görüntülerin dikkatle kaydedilmesi ve analiz için seçilmesi önemlidir. Hücre-substrat mesafelerinin değerlendirilmesinde kullanılacak görüntüleri denklem doğrultusunda seçiniz.

Bir membran belirteci için, bu örnekte gösterildiği gibi, homojen aydınlatma altındaki münferit görüntüler hariç tutulabilir. Hücre substrat topolojisi görüntülerini hesaplayın ve değerlendirme sırasında görüntüleme için uygun bir renk kodu seçin. Münferit piksellerin profilleri, bu şekilde betimlendiği gibi görüntülenebilir.

Bu profiller, uyum kalitesi için bir gösterge olarak kullanılabilir. Son olarak, değerlendirme protokolünü kaydedin. Bu şekil, aktive edilmiş bir TP 53 tümör baskılayıcı gene sahip U2 51 mg glioblastoma hücrelerinin toplam internal yansıma görüntülerini betimlemektedir.

Çeşitli geliş açılarıyla yapılan inkübasyon sırasında; yaklaşık 140 nanometrelik bir evanesan elektromanyetik alan penetrasyon derinliğine karşılık gelen 66 derece, 75 nanometrelik penetrasyon derinliğine karşılık gelen 69 derece ve azalan penetrasyonla 60 nanometrelik penetrasyon derinliğine karşılık gelen 73 derece kaydedilmiştir. Penetrasyon derinliği azaldıkça floresans yoğunluğu azalmakta ve hücrelerin kenarlarındaki fokal temaslar gibi daha yüzeysel bölgelerden kaynaklanmaktadır. Hücre-substrat mesafeleri, Panel D'de burada görüldüğü gibi sıfırdan 600 nanometreye kadar değişen bir renk koduyla betimlenmiştir.

Hücre-substrat mesafeleri, beyaz ile sarı arasında temsil edilen sadece birkaç nanometreden, koyu kırmızı ile temsil edilen 250 ile 300 nanometreye kadar hücreler arasında büyük farklılıklar göstermektedir. Bu durum, fokal temasların ve daha geniş hücre-substrat mesafelerinin birbirine yakın olduğunu göstermektedir. Benzer bir hücre-substrat mesafesi varyasyonu, aktive edilmiş bir tümör baskılayıcı gen P 10 içeren U2 51 mg glioblastoma hücreleri için de hesaplanmıştır.

Buna karşılık, sarı ile temsil edilen U2 51 mg kontrol hücreleri ve turuncudan kırmızıya kadar temsil edilen yabani tip hücreler için hücre-substrat mesafeleri, gelişim sonrasında oldukça sabittir. Bu teknik, hücre-substrat topolojisi alanındaki araştırmacıların tümör hücrelerini ve lazer tedavisi sonrası meydana gelen morfolojik değişiklikleri incelemelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, canlı organizmalar tarafından kolayca tolere edilebilen düşük ışık maruziyeti altında, nanometre aralığında gerçek bir çözünürlükle yüzeylerin nasıl görselleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.