Ekzositik olayların görselleştirilmesi için toplam iç yansıma floresan mikroskobu

Toplam iç yansıma floresan veya TIRF mikroskobu aşamasında embriyonik kortikal nöronlar içeren cam tabanlı bir tabakla başlayın.

Bu nöronlar, nötr hücre dışı pH'da floresan alan ancak asidik veziküllerde floresan olmayan pH'a duyarlı yeşil floresan proteini veya GFP etiketli vezikül markörü eksprese eder.

Plazma zarı ile vezikül füzyonu üzerine, hücre dışı pH'a maruz kalma, ekzositoz olayını işaretleyerek floresanı indükler.

Hedefi seçin ve kırılma indisini nöronla eşleşecek şekilde ayarlayın.

Lazer ışınını cama belirli bir açıyla yönlendirin, bu da toplam iç yansımaya neden olur ve ani bir dalga oluşturur. Bu dalga, plazma zarının yakınındaki GFP belirteçlerini seçici olarak uyarır.

Buharlaşma alanının üzerindeki GFP işaretleyicilerini hariç tutmak için TIRF penetrasyon derinliğini ayarlayın.

İlk olarak, GFP eksprese eden nöronları bulmak için geniş alan epifloresan aydınlatmasını kullanın.

Ardından, membrana özel uyarma için TIRF aydınlatmasına geçin.

Vezikül füzyon olayını kaydetmek ve ekzositozu görselleştirmek için hızlandırılmış görüntüler elde edin.

TIRF mikroskobunu ve numuneyi kurduktan ve metin protokolüne göre bir nöronal odak düzlemi bulduktan sonra, lazer yazılımını başlatın v