Ekzositik olayların görselleştirilmesi için toplam iç yansıma floresan mikroskobu

Toplam iç yansıma floresan veya TIRF mikroskobu aşamasında embriyonik kortikal nöronlar içeren cam tabanlı bir tabakla başlayın.

Bu nöronlar, nötr hücre dışı pH'da floresan alan ancak asidik veziküllerde floresan olmayan pH'a duyarlı yeşil floresan proteini veya GFP etiketli vezikül markörü eksprese eder.

Plazma zarı ile vezikül füzyonu üzerine, hücre dışı pH'a maruz kalma, ekzositoz olayını işaretleyerek floresanı indükler.

Hedefi seçin ve kırılma indisini nöronla eşleşecek şekilde ayarlayın.

Lazer ışınını cama belirli bir açıyla yönlendirin, bu da toplam iç yansımaya neden olur ve ani bir dalga oluşturur. Bu dalga, plazma zarının yakınındaki GFP belirteçlerini seçici olarak uyarır.

Buharlaşma alanının üzerindeki GFP işaretleyicilerini hariç tutmak için TIRF penetrasyon derinliğini ayarlayın.

İlk olarak, GFP eksprese eden nöronları bulmak için geniş alan epifloresan aydınlatmasını kullanın.

Ardından, membrana özel uyarma için TIRF aydınlatmasına geçin.

Vezikül füzyon olayını kaydetmek ve ekzositozu görselleştirmek için hızlandırılmış görüntüler elde edin.

TIRF mikroskobunu ve numuneyi kurduktan ve metin protokolüne göre bir nöronal odak düzlemi bulduktan sonra, lazer yazılımını başlatın ve lazer kontrol yazılımına bağlanın. Aydınlatmayı geniş alana ayarlayın ve hedefi seçin. Ardından numunenin kırılma indisini ayarlayın ve 491 lazer için TTL'nin işaretini kaldırarak lazer yoğunluğunu ayarlayın.

Görüntüleme parametresi optimizasyonu, analiz için yeterli yüksek sinyal-gürültü oranına sahip görüntüler üretirken odak kaymasını ve fototoksisiteyi önlemek için zemindeki sağlam ekzositik veziküllerin görüntülenmesi sırasında önemlidir.

Kaydırıcıyı 100 olarak ayarlayın ve ardından 20 ile 40 arasında bir değere geri getirin. Ardından TTL'yi yeniden kontrol edin. Ardından, iletilen ışık aydınlatmasında tekrar örneğe odaklanın.

Ardından görüntüleme yazılımında 491 lazer aydınlatmasını seçin ve deklanşörü açın. Lensi çizmemek için kondansatörü optik tezgahın üzerine baş aşağı yerleştirin. Lazerin tavandaki odak noktasını ince bir şekilde ayarlayın.

Ve kondansatör çıkarıldığında, noktayı kapalı alan diyaframının merkezine ortalayın. Ardından kondansatörü değiştirin. Ve TIRF yazılımında penetrasyon derinliğini 110 nanometre olarak ayarlayın. Ardından görüntüleme için geniş alan aydınlatmasından TIRF aydınlatma moduna geçin.

Şimdi, geniş alan epifloresan kullanarak, oküler aracılığıyla VAMP2 florin eksprese eden hücreleri bulun. Ardından, fotoağartmayı ve fototoksisiteyi azaltmak için, minimum pozlama süresi ve lazer yoğunluğu kullanarak sinyal-gürültü oranını ve dinamik aralığı en üst düzeye çıkarmak için görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Hücre başına sürekli otomatik odaklamayı ayarlayın. Ardından, 5 dakika boyunca her 0,5 saniyede bir gerçekleşen çekim ile hızlandırılmış bir görüntü seti elde edin.