Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Bu deneyin genel amacı, canlı hücrelerde SNARE proteinlerinin karmaşık oluşumunu görselleştirmektir. Bu yöntem, belirli organella kaçakçılığı adımlarını katalize eden SNARE protein setlerinin tanımlanması gibi membran kaçakçılığı alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, SNARE'lerin karmaşık oluşumlara girdiği hücresel konumların doğrudan görselleştirilmesine izin vermesidir.

Bu deneyde, transfeksiyon için üç Eppendorf tüpü arasında bölünmüş 900.000 HeLa hücresi kullanılmıştır. Hücreleri, metin protokolünde açıklandığı gibi aşağıdaki yapılarla transfekte edin. Syntaxinin-4 mSitrin yapısına sahip bir numaralı örnek, syntaxinin-4 mSitrin ve VAMP3-mCherry ile iki numaralı numune ve hem mSitrin hem de mCherry ile kaynaşmış sözdizimin-3 ile üç numaralı örnek.

Transfekte edilmiş hücreleri, gece boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe %5 CO2 ile 37 santigrat derecede %10 FCS ve %1 antibiyotik antimikotik ile sağlanan yüksek glikozlu DMEM'de kültürleyin. Ertesi gün, ortamı aspire edin ve hücreleri iki dakika boyunca canlı hücre görüntüleme ortamı ile bir kez yıkayın. Bundan sonra, hücreleri taze görüntüleme ortamına yerleştirin.

Bu prosedüre başlamak için, iki numaralı numuneyi 37 santigrat derecede, ısıtılmış bir sahneye, donör florofor ve zamanla çözülmüş veri toplama için darbeli bir uyarma kaynağına sahip bir zaman alanı floresan ömür boyu görüntüleme konfokal mikroskobunun altına yerleştirin. Her floresan yaşam süresi görüntüleme mikroskobu veya FLIM ölçümünden önce, mSitrin ve mCherry etiketli SNARE proteinlerinin görünür ifadesine sahip bir hücre seçin ve her iki floroforun aynı anda uyarılmasıyla 256 x 256 piksellik bir konfokal görüntü kaydedin. FLIM görüntüsü, daha önce kaydedilen konfokal görüntüyle aynı boyutlarda ve uzamsal çözünürlükle kaydedilmiş FLIM görüntüsüyle FLIM'i çalıştır'ı tıklatarak bir FLIM görüntüsü kaydedin.

Görüntüyü, tüm hücre FLIM analizi için en az 50.000 foton veya piksel başına en az 400 foton ile kaydedin. Yansıma görüntüsünü önlemek için FLIM ölçümlerini cam yüzeyinden en az bir mikrometre uzakta kaydetmek önemlidir. Görüntülemeyi iki numaralı numunedeki birden fazla hücreden ve bir numaralı numune ve üç numaralı numunedeki hücreler için tekrarlayın.

Ardından, bir cihaz yanıt fonksiyonunu veya IRF'yi kaydetmek için mikroskop aşamasına temiz bir cam kapak fişi yerleştirin. Emisyon dedektörünün monokromatörünü uyarma dalga boyuna ayarlayın ve cam kapak kaymasından geri saçılma ile bir FLIM görüntüsü kaydetmek için FLIM'i çalıştır düğmesine tıklayın. Fotoğraf kayıtları, PT32ICS dönüştürme yazılımı ile FLIM görüntülerine dönüştürülecektir.

Yazılımı yapılandırın. FLIM görüntüleri oluşturmak için çıktıyı ImageJ olarak ayarlayın. Görüntü boyutunu 256 x 256 piksel ve kanalı iki piksel olarak ayarlayın.

Dönüştür düğmesine basın ve bir veya daha fazla foton izi yükleyin. Birden fazla foton izi seçmek için kontrol tuşunu basılı tutun. FLIM görüntüleri, foton izlerinin kaydedildiği aynı klasörde oluşturulmalıdır.

Dekonvolüsyon ile uyum sağlayabilen veri analizi yazılım programını açarak başlayın. Her foton izi için histogramı içeren metin dosyasını içe aktarın. Tabloyu, IRF tablonun ikinci sütununda, A sütunundaki zaman değerlerinin yanında olacak şekilde yeniden düzenleyin.Tüm sütunları seçerek kaydedilen foton izlerinin kalitesini belirleyin.

Yüksek yansıma zirvesine sahip foton izlerini analiz etmeyin. Burada bir örnek gösterilmiştir. Takılacak kalite kontrollü ömür boyu histogramları içeren tüm sütunları ve B sütunundaki IRF'yi seçmek için kontrol tuşunu kullanın ve doğrusal olmayan bağlantı parçasını yükleyin.

Bu işlevi analiz yazılımına ekleyerek evrişimden arındırılmış uyum işlevini yükleyin. Sığdırma işlevi dosyasını seçin. Bu fonksiyon, IRF ile evrişimden arındırılmış bir mono üstel bozunma fonksiyonu ile floresan ömrü histogramlarına uyar.

Takılan eğrilerin X ekseni ölçeklemesini gerçekleştirin. Fit tuşuna basarak eğrileri sığdırın. Bu, uyumu dönüştürecek ve floresan ömürlerini, ofsetleri ve genlikleri içeren tabloyla birlikte dizide bir rapor sayfası oluşturacaktır.

Ayrıca, takılan eğrileri ve uyumun kalıntılarını içeren bir veri sayfası oluşturacaktır. Gösterilenler, yalnızca sözdiziminde dört mSitrin, snytaxin dört mSitrin ile VAMP3 mCherry veya sözdiziminde üç mSitrin mCherry tandem yapısını ifade eden helosellerin temsili konfokal görüntüleridir. Eşlik eden bu floresan ömrü görüntülerinde renk, ortalama görünür floresan ömrünü gösterir.

Görüntüler daha sonra mSitrin donörü floroforunun floresan yoğunlukları ile birleştirildi. Daha sonra, iki üstel bozunma fonksiyonlarına uyan aynı görüntüler var. Piksel renkleri, VAMP3 ile karmaşık olarak dörtte tahmini sözdizimi kesirlerini gösterir.

Kurulumun cihaz tepki fonksiyonu, cam su arayüzündeki geri saçılma kullanılarak ölçüldü. Tüm hücre ömrü histogramları, yalnızca dört mSitrin'de sözdizimini ifade eden, dört mSitrin'de VAMP3 mCherry ile birlikte sözdizimini ifade eden ve üç mSitrin mCherry tandem yapısında sözdizimini ifade eden hücreler için gösterilir. Panel E, B, C ve D panellerinin bozunma eğrilerinin bir kaplamasını gösterir.Kakmalar aynı grafikleri gösterir, ancak Y ekseninin logaritmik ölçeklemesi ile.

Mikroskop kapak kaymasının yüzeyine çok yakın kaydedilen bir floresan ömrü histogramı, sarı gölgeli alanla gösterilen büyük bir yansıma zirvesi ile sonuçlandı. Son olarak, iki üstel bozunma fonksiyonu ile temsili uyuma sahip bir ömür boyu histogram gösterilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa iki ila dört saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, donörün ve önleyicinin SNARES'in ekspresyon seviyeleri kullanım ömrünü etkileyebilirken birden fazla hücreyi kaydetmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, SNARE aracılı membran trafiğinin yeniden köklendirilmesi ile ilgili hücre tipine özgü soruları yanıtlamak için hücreler aktive edilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, zar kaçakçılığı alanındaki araştırmacıların tüm ökaryotik hücrelerde organella trafiğinin hücreler arası yollarını keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, FLIM verilerinin nasıl kaydedileceğini ve analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Genetiği değiştirilmiş organizmalar ve yüksek güçlü lazerlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü denerken her zaman eldiven ve göz koruması gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.