Name: Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Öğrenin canlı hücrelerde SNARE protein kompleks oluşumunu FLIM ile görüntülemeyi. HeLa hücreleri kullanılarak membran trafik mekanizmalarını inceleyin ve hücre içi organel taşınmasının dinamiklerini keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser için bilimsel araştırma (NWO; Hypatia bursu Radboud Üniversitesi Tıp Merkezi, kariyer geliştirme Ödülü insan sınır bilim programı, yerçekimi programı 2013 Hollanda organizasyon tarafından desteklenmiştir ICI-024.002.009), bir VIDI vermek NWO (ALW VIDI 864.14.001) ve bir başlangıç Grant Avrupa Birliği'nin yedinci çerçeve programı (hibe sözleşmesi numarası 336479) altında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) üzerinden.

1. mikroskop örnekleri hazırlanması
<ol>
	<li>Qa-tuzak sözdiziminin 4 ifade mCitrine (sözdiziminin 4-mCitrine; donör fluorophore) erimiş ve R-tuzak VAMP3 mCherry (VAMP3-mCherry) erimiş Not: Diğer tuzaklarına onların C-terminal transmembran sarmal erimiş floresan proteinler ile de kullanılabilir. MCitrine-mCherry yerine hayalice ayrı fluorophores diğer donör-alıcısı çiftlerini de kullanılan (örneğin, CFP-YFP) olabilir.<ol>
		<li>HeLa hücreleri büyümek ve üç 35 mm çaplı cam alt yemekleri mikroskopi için uygun üzerinden 900.000 HeLa hücreleri bölmek. Not: ilke olarak, bu iletişim kuralı diğer ökaryotik hücre tipleri ve mikroskopi yemekleri için adapte edilebilir.<ol>
			<li>T75 Şişeler 10 mL Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM), % 10 fetal buzağı serum (FCS) ve % 1 antibiyotik antimycotic (içeren Amfoterisin B, penisilin ve streptomisin) 37 ° C'de ve % 5 ile desteklenmiş yüksek glikoz ile HeLa hücre kültürleri korumak CO 2 hücre kültür kuluçka.</li>
			<li>Orta haftada iki kez doldurmak ve hücreleri 1:10 haftada bir kez veya hücreleri confluency yeni T75 şişeler (500.000 hücreler/flask, ortalama) % 85-90 ulaştığınız zaman bölünmüş.</li>
			<li>DMEM kaldırmak ve HeLa monolayers 8 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) 3 dakika ile iki kez yıkayın.</li>
			<li>PBS kaldırın ve PBS 2 mL 2 mM ethylenediaminetetraacetic asitle (EDTA) ekleyin.</li>
			<li>Hücreleri hücre kültür kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 5 min için kuluçkaya ve daha sonra hafifçe şişeye HeLa hücreleri balonun altından ayırmak için tahrik.</li>
			<li>Orta 10 mL ile hücreleri temizlemek, süspansiyon 15 mL tüp aktarmak ve sayımı için 10 µL aliquot kaldırmak.</li>
			<li>Aliquot 1: %0,4 trypan mavi leke ile 1 sulandırmak ve Bürker hemasitometre9hücreleri saymak. Not: 10.000 hücre/mL sayısı için tarafından iki 4 x 4 kareler ve birden çok hücre sayı saymak.</li>
			<li>Sonra sayım 15 mL tüp almak 900.000 hücreleri hücre (bkz. Adım 1.1.1) 3 cam alt yemekleri onları bölmek ve transfection için hazır olun.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Hücre çoğalmasıyla10 tarafından transfect ( Tablo malzemelerigörmek) sahip sözdiziminin 4-mCitrine yapı (yalnızca, donör Örnek #1), sözdiziminin 4-mCitrine VAMP3-mCherry (örnek 2) ve sözdiziminin 3 ile birlikte erimiş mCitrine ve mCherry () için Örnek 3). Not: Diğer hücre transfection yöntemleri de kullanılan11olabilir. Örnek #3 tandem inşa kısa ömrü expectable (Yani, maksimal expectable perde) tahmin etmek için olumlu bir denetimdir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Yüksek glikoz % 10 FCS ve antibiyotik-antimycotic % 5 CO2 hücre kültür kuluçka 37 ° C'de % 1 ile birlikte gelen DMEM hücreleri gecede kültür.</li>
	<li>DMEM Aspire edin ve bir kez canlı hücre orta Imaging hücrelerle yıkayın (140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH 7.4, mOsm = 300 =; Tablo reçetesibakın) 2 min için ve daha sonra hücreleri taze görüntülemede yer Orta.</li>
</ol>
2. veri yazmak için FLIM
<ol>
	<li>Yer Örnek #2 saat-alan FLIM confocal mikroskop altında pulsed uyarma kaynağı ile donör fluorophore (örneğin, mCitrine) ve zaman çözülmüş veri toplama için. Isıtmalı bir sahne ile 37 ° C'de hücreler tutmak. Not: Bu protokol için kullanılan confocal mikroskop bir 63 X 1,20 NA su daldırma amacı ile de, bir beyaz ışık lazer bulunuyor (80 MHz darbe, &lt; 100 ps darbe süresi), bir foton çarpanı tüp (PMT) ve bir Time-Correlated tek foton sayma (TCSPC ) sistemi ( Tablo malzemeler kullanılan özel kurulum için bakınız). Diğer FLIM mikroskoplar kullanılan (örneğin, PMTs, tek dalga boyu pulsed lazerler bir beyaz ışık pulslu lazer yerine yerine tek foton çığ diyotlar (SPAD)) da olabilir.</li>
	<li>MCitrine ve mCherry etiketli SNARE proteinler görünür ifadesi içeren bir hücreyi seçin ve her FLIM ölçü önce her iki fluorophores aynı anda uyarma 256 × 256 piksel olan confocal bir resmi kaydetmek. Yaklaşık 2 kat kırınım mikroskop Uzaysal çözünürlük sınırlı daha küçük bir piksel adım (~ 200 nm) kullanılmalıdır. 516 nm ve 521-565 nm toplamak emisyon mCitrine için heyecanlandırmak; 613-668 nm 610 nm ve toplamak emisyon, mCherry için heyecanlandırmak. Not: görüntüleme uçak çok yakın çanak alt konum yapmak (içinde ~ 2 µm mesafe), bu bir yansıma tepe Floresans ömür boyu histogram da yol açar. Bu örnek hareket olası sorunu aşmak için donör ve alıcısı fluorophores eşzamanlı uyarma tercih edilen, önemlidir. Ancak, sıralı uyarma de kullanılabilir.</li>
	<li>Kayıt aynı boyutlara ve confocal resmi olarak Uzaysal çözünürlük ile kaydedilen FLIM görüntü ile Çalıştırmak FLIM tıklayarak bir FLIM görüntü adım 2.2. Bütün hücre FLIM çözümleme veya en az 400 fotonlar/piksel görüntü en az 50.000 fotonlar kaydedin. Sadece mCitrine donör fluorophore ve değil mCherry alıcısı fluorophore heyecanlandıracak ve böylece 521-565 nm 516 nm ve toplamak emisyon, heyecanlandırmak.</li>
	<li>Çoklu hücrelerdeki ve diğer örnek #1 (sadece donör) ve örnek #3 (mCitrine-mCherry tandem yapı) 2.1-2.3 adımları yineleyin.</li>
	<li>Bir enstrüman yanıt işlevi (IRF) kaydedin. Uyarma dalga boyu (örneğin, 510-550 nm kayıt emisyon) için emisyon dedektörü monokromatör ayarlamak ve sonra geri bir temiz cam kapak kayma FLIM Çalıştırdüğmesini tıklatarak saçılma ile bir FLIM görüntü kaydetmek. Aynı uyarma dalga kullanın (516 nm) ve lazer gibi adımlar 2,1-2.4 hücre veri kaydetmek için kullanılan güç. Not: birden fazla doruklarına IRF içinde görünür durumdaysa ya da emisyon monochromators ayarlı, IRF da floresan boya ile ultrafast ömür boyu, bir çözüm ile örneğin bir organik boya ile doymuş bir sulu Floresans Şoklama tarafından ölçülebilir Potasyum iyodür çözüm. Ayrıca, Floresans histogramlar çürüme eğimi de IRF deconvolution monte edilebilir çünkü bir IRF kaydetmek için kesinlikle gerekli değildir. Ancak, bir IRF kullanılan foton dedektörü zamanlama özellikleri için düzeltmek için sağlar ve böylece ömür boyu histogramlar krizleri daha doğru olmasını sağlar.</li>
</ol>
3.Foton kayıtları FLIM görüntülere dönüştürme
<ol>
	<li>Karşıdan yükleyip PT32ICS dönüşüm yazılım5. Not: Ömür boyu veri da bilgisayar yazılımı--dan çeşitli mikroskop satıcılar da dahil olmak üzere diğer yazılımlar tarafından analiz edilebilir.</li>
	<li>PT32ICS yazılım yapılandırın.<ol>
		<li>256 × 256 piksel görüntü boyutu Ayarları üzerinden boyutu ayarlamak | Boyutu.</li>
		<li>2 ayarları kanal ayarla | Boyutu. Not: Kanal mCitrine emisyon sadece mikroskop yapılandırmasına bağlıdır. Hatalı bir kanal bir FLIM görüntü yok fotonlar (Yani, siyah görüntü) ve sonuç olarak boş bir 'LifetimeTable.txt' neden olur-dosya. Doğru kanal deneme-yanılma tarafından tespit edilebilir.</li>
		<li>ImageJ (xyz) için Çıkış ayarla (veya TRI2 (xyt)) FLIM görüntüleri (Adım 3.4) oluşturmak için.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Convert tuşuna basın ve bir veya daha fazla foton izlemeler (.pt3 dosyaları) yükleyin. Birden fazla foton izleme seçmek için Ctrl tuşunu basılı tutun. Not: Daha yeni 64 bit .ptu biçimi de dönüştürülebilir.</li>
	<li>PT32ICS yazılım pt3 dosyalarının kaydedildiği yer olarak aynı klasörde aşağıdaki dosyaları oluşturur emin olmak: bir foton yığın .pt3 foton izlemesinde resim sitometresi standart biçimi (.ics), .pt3 foton izleme (.bmp) her bir bit eşlem dosyası, metin dosyası dönüşüm başına ücret (_Report.txt) içeren bilgi içeren toplam foton istatistikleri (Yani, her .pt3 foton izleme, zaman çözünürlüğü Dedektör fotonlar toplam sayısı) ve ikinci bir metin dosyası dönüştürme (_LifetimeTable.txt) başına Floresans ömür boyu çubuk grafikler her .pt3 foton izleme için sekmeyle ayrılmış biçimde. Not: .ics dosyası FLIM görüntülerle, örneğin TRI2 yazılım12,13 ya da Kütüphane FIJI ImageJ14,15dakika sonra uygun ince eğri oluşturmak için uygun tek piksel için kullanılabilir. Bu dosyayı da Fazör analiz16için örneğin FIJI Spechron üzerinden zaman Gated Fazör eklentisi ile kullanılabilir. Bit eşlem dosyası ömür boyu bilgiler içermez. İkinci metin dosyası 4. adımda bütün hücreli FLIM analizi için kullanılır.</li>
</ol>
4. uygun floresan ömür boyu histogramlar bütün hücreli FLIM analizi için
Not: Bu adımı (deconvoluted provası IRF) yazılımı deconvoluted provası kapasitesine sahiptir gerektirir. IRF deconvolution olmadan Floresans histogramlar yamaçları uygun diğer yazılımlar ile de yapılabilir.
<ol>
	<li>Veri analizi yazılım programı deconvolution (Malzeme tablo) ile uygun yetenekli açın ve her foton izleme (_LifetimeTable.txt) dosya üzerinden için çubuk içeren metin dosyası alma | Alma | Tek ASCII.</li>
	<li>IRF ( Kopyala ve Yapıştırkullanarak) tablonun ikinci sütununda öyle ki tabloyu yeniden düzenlemek. IRF ikinci sütununda B a ilk sütunundaki zaman değerleri yanında yer</li>
	<li>Ctrl + A tuşlarına basıp arsa seçerek tüm sütunları seçerek kaydedilen foton izlemeler kalitesini belirlemek | Paneli çoklu | 9 paneli. Foton izleri bir yüksek yansıma tepe (şekil 4F) ile analiz etmiyorsun.</li>
	<li>Seçin Ctrl kullanarak B sütunundaki IRF yanı sıra monte edilebilir kalite kontrollü ömür boyu çubuk grafikler içeren tüm sütunları anahtar ve doğrusal olmayan uydurma analiz üzerinden yüklemek | Uygun | Doğrusal olmayan eğri Fit | Açık iletişim.</li>
	<li>Analiz yazılımı için bu işlev ekleyerek deconvoluted uygun işlev ( ek dosya 1' kullanılabilir) yük ( Kategori üzerinden | Kullanıcı tanımlı | İşlev | Ekle). 'FLIM_convoluted_IRF.fdf' uygun işlev dosyayı seçin. Bu işlev uygun floresan ömür boyu histogramlar bir mono üstel çürüme fonksiyonu ile deconvoluted (Yani, tabloda ikinci sütun B) IRF ile (Denklem 1): 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq1.jpg">(Denklem 1) t ile belgili tanımlık zaman, τ belirgin Floresans ömür boyu, A genlik ve y0 uzaklık. Not: Başka bir ömür boyu histogramlar BI üstel uygun fonksiyon (Denklem 2) ile uygun seçenektir: 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq2.jpg">(Denklem 2) Donör tek şart yavaş bileşenine (τ1) ömrünü sabitleme tarafından (Adım 1.1.2: Örnek #1) ve hızlı bileşeninin (τ2) tandem yapı (örnek 3) için bu kısmını tahmini sağlar TUZAK protein kompleksi (F) üzerinden genlikleri yavaş (A1) ve hızlı bileşenleri (A2; bkz: tartışma; Denklem 3): 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq3.jpg">(Denklem 3) Deconvoluted BI üstel uygun 'FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf' için uygun fonksiyon dosyası ek dosya 2' kullanılabilir.</li>
	<li>Seçin donatılmış eğrileri | Veri türü x olarak giriş veri olarak aynı. Not: Bu xuygun yol açar-monte eğrileri eksen ölçeklendirme.</li>
	<li>Eğrileri uygunbasarak uygun. Not: Bu uygun dönüştürmek ve bir 'raporu sayfası' dizisinde Floresans yaşam süreleri, ofset ve genlikleri içeren bir tabloyla birlikte oluşturmak. Ayrıca monte eğrileri ve fazlalıklar uygun veri sayfasıyla oluşturacaktır.</li>
</ol>

<ol><li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREs+-+engines+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SNAREs - engines for membrane fusion.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (9), 631-643 (2006).</li>
<li>Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167488905000571">SNAREs and traffic.</a> Biochim Biophys Acta. 1744 (2), 120-144 (2005).</li>
<li>van den Bogaart, G., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+the+SNAREs+needed+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Counting the SNAREs needed for membrane fusion.</a> J Mol Cell Biol. 3 (4), 204-205 (2011).</li>
<li>Bethani, I., Werner, A., Kadian, C., Geumann, U., Jahn, R., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+fusion+upon+SNARE+knockdown+is+maintained+by+residual+SNARE+activity+and+enhanced+docking%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Endosomal fusion upon SNARE knockdown is maintained by residual SNARE activity and enhanced docking.</a> Traffic. 10 (10), Copenhagen, Denmark. 1543-1559 (2009).</li>
<li>Verboogen, D. R. J., González Mancha, N., Ter Beest, M., van den Bogaart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+reveals+rerouting+of+SNARE+trafficking+driving+dendritic+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging microscopy reveals rerouting of SNARE trafficking driving dendritic cell activation.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Degtyar, V., Hafez, I. M., Bray, C., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dance+of+the+SNAREs%3A+assembly+and+rearrangements+detected+with+FRET+at+neuronal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dance of the SNAREs: assembly and rearrangements detected with FRET at neuronal synapses.</a> J Neurosci. 33 (13), 5507-5523 (2013).</li>
<li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li>
<li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).</li>
<li>JoVE Science Education Database Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> JoVE. , (2017).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/en/filelibrary/cell-culture/neon-protocols.par.0780.file.dat/hela-cervix.pdf">NEON transfection system cell protocols HeLa</a>. , (2017).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J. D., Edens, R. J., Ezike, I., Vojnovic, B. <a target="_blank" href="http://spie.org/Publications/Proceedings/Paper/10.1117/12.590510">Global and pixel kinetic data analysis for FRET detection by multi-photon time-domain FLIM.</a> Proc. SPIE. 5700, 171(2005).</li>
<li>Barber, P., et al. <a target="_blank" href="http://rsif.royalsocietypublishing.org/content/6/Suppl_1/S93">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> J R Soc Interface. 6 (Suppl 1), S93-S105 (2009).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hinde, E., Digman, M. A., Welch, C., Hahn, K. M., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+detection+by+the+phasor+approach+to+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Biosensor Förster resonance energy transfer detection by the phasor approach to fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Microsc Res Tech. 75 (3), 271-281 (2012).</li>
<li>Stein, A., Weber, G., Wahl, M. C., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helical+extension+of+the+neuronal+SNARE+complex+into+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Helical extension of the neuronal SNARE complex into the membrane.</a> Nature. 460 (7254), 525-528 (2009).</li>
<li>Barstow, B., Ando, N., Kim, C. U., Gruner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+citrine+structure+by+hydrostatic+pressure+explains+the+accompanying+spectral+shift%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Alteration of citrine structure by hydrostatic pressure explains the accompanying spectral shift.</a> PNAS. 105 (36), 13362-13366 (2008).</li>
<li>Shu, X., Shaner, N. C., Yarbrough, C. A., Tsien, R. Y., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chromophores+and+buried+charges+control+color+in+mFruits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel chromophores and buried charges control color in mFruits.</a> Biochemistry. 45 (32), 9639-9647 (2006).</li>
<li>Veale, K. J., Offenhäuser, C., Lei, N., Stanley, A. C., Stow, J. L., Murray, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VAMP3+regulates+podosome+organisation+in+macrophages+and+together+with+Stx4%2FSNAP23+mediates+adhesion%2C+cell+spreading+and+persistent+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">VAMP3 regulates podosome organisation in macrophages and together with Stx4/SNAP23 mediates adhesion, cell spreading and persistent migration.</a> Exp Cell Res. 317 (13), 1817-1829 (2011).</li>
<li>Gómez-Jaramillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin-4+is+implicated+in+the+secretion+of+antibodies+by+human+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Syntaxin-4 is implicated in the secretion of antibodies by human plasma cells.</a> J Leukoc Biol. 95 (2), 305-312 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı FRET-FLIM görselleştirme SNARE sözdiziminin 4 ve VAMP3 canlı HeLa hücreleri arasında bir köprü işlevi için kullanımı gösterilmiştir. Sözdiziminin 4 ağırlıklı olarak nerede ekzositozu1,2,20,21aracılık eder plazma zarı bulma Qa-tuzak bir proteindir. VAMP3 esas olarak endosomal bölmeleri geri dönüştürme bulmak için açıklanan ve diğer endosomes de plazma zarı1,2,20olarak kaçakçılığı aracılık eder R bir tuzak var. Ancak, FRET-FLIM tahlil diğer SNARE proteinler eğitimi için kolayca adapte edilebilir. Bu tuzaklarına hangi çoğu SNARE proteinler tarafından uzak1,2için geçerli bir C-terminal transmembran heliks içeren tek durumdur. Ayrıca, burada açıklanan protokol SNARE kompleksleri bitki ve Maya da dahil olmak üzere herhangi bir ökaryotik hücre tipinde görselleştirme için adapte edilebilir. Bu protokol için donör fluorophore floresan ömrünü kısalma perde ölçüsü olarak kullanılan. Tamamlayıcı bir yaklaşım olarak alıcısı fluorophore ömrünü muayene, kesin kanıt bu rezonans enerji transferi sağlayan duyarlilasmis emisyon belirgin artış faz nedeniyle oluşur.
Şu anda, FRET-FLIM tekniği lizozomal bölmeleri SNARE kompleksleri görselleştirmek mümkün olmayabilir. Sözdiziminin 3-mCitrine-mCherry tandem inşa etmek için mCherry floresan kez mCitrine sinyal içinde cep daha bol ise büyük olasılıkla lizozomal bölmeleri için karşılık gelen bir juxtanuclear alanı, daha fazla birikmiş bulunabilir çevre5. Aynı SNARE protein flüoresan bu proteinler erimiş co ifade5yaşındayken mCitrine için karşılaştırıldığında mCherry benzer bir juxtanuclear birikimi gözlenmiştir. Organellerin karakterize tarafından son derece düşük bir pH (&#60; 4) ve proteolitik enzim yüksek bir etkinlik. MCherry juxtanuclear birikimi büyük olasılıkla mCherry fluorophore mCitrine fluorophore göre lizozomal bozulması için daha yüksek bir direnç nedeniyle oluşur. MCherry juxtanuclear birikimi de hücreleri5fiksasyonu gerçekleştiği sırada için pH-Şoklama nedeniyle mCitrine, biri değil. Bu nedenle, FRET-FLIM tekniği FRET juxtanuclear (lizozomal) bölgelerde miktarı hafife ve bu organellerin sert şartları Lümen içinde hayatta diğer floresan muhabir proteinler gerektirir.
FRET-FLIM ilke (yarı-) kantitatif tahmin karmaşık5tuzaklarına fraksiyonunun elde etmek için izin verir. Bu protokol için açıklandığı gibi bu gerektirir Floresans ömür boyu histogramlar (Denklem 2), çift üstel çürüme işlevleriyle uygun hızlı bileşeni genliği tuzaklarına kısmını orantılı nerede karmaşık () içinde Denklem 3). Ancak, böyle uygun bir iki model ile teknik olarak zordur. Montaj birden fazla ücretsiz uygun parametreleri (iki floresan hayat ve iki genlikleri) ile çok sayıda fotonlar, özellikle parametreleri birbirlerini etkiler ve ömür boyu küçük hataları genlikleri ve Yardımcısı etkiler gerektirir çok yönlü. Bu uydurma sorunların üstesinden gelmek için Floresans yaşam süreleri yavaş bileşeninin donör tek şart (Yani, hiçbir FRET; sadece mCitrine mevcut) ömür boyu sabit olabilir ve bu tandem ömrünü hızlı bileşenine () inşa maksimal expectable perde). Floresans yaşam süreleri bu denetim durumları ile aynı olmayabilir ve birden çok nedenlerle (kendi kendine Şoklama, dipol yönlendirme, microenvironment değişimler) sapma çünkü ancak, bu aynı zamanda bakım ile yorumlanmalıdır. Yakın bir konumda birden fazla tuzak kompleksleri (&#60; 10 nm) mesafe bağımlı perde, perde "moleküler cetvel" kullanılmak üzere izin verir aynı ilke sonuç ama bu durumda, gizlemektedir SNARE kompleksleri miktar. Çünkü etiketli tuzaklarına endojen (etiketsiz) tuzaklarına ile rekabet Ayrıca, nicel bir tahmin her zaman anlamlı değildir. Sonuç olarak, ifade mCherry etiketli SNARE yüzdesinin FRET5temel belirleyici düzeydir. Bu uyarılar yüzünden bu mono üstel çürüme fonksiyonu (Denklem 1) ile floresan ömür boyu histogramlar sığdırmak için tavsiye edilir. Bu yaşam bir temanın herhangi bir bilgi gerektirmez ve elde edilen belirgin ortalama floresan ömür boyu sağlam bir ölçü için tuzak kompleks5sağlar avantajı vardır.
Yine de, bu iki bileşenli uygun modelleri tarafından nicel FRET-FLIM görüntüleme güçlü gelecekteki uygulamalar olacaktır bekleniyor. TUZAK-encoding genlerin kromozom içinde floresan muhabir proteinler ile örneğin CRISPR/CAS9 tarafından erimiş. Bu endojen protein düzeyleri ve etiketsiz tuzaklarına, hiçbir arka plan ile endojen SNARE proteinlerin floresan etiketleme içinde neden olur ve böylece SNARE kompleksleri tarafından FRET-FLIM fraksiyonunun anlamlı bir nicel tahmini için sağlar. Endojen tuzaklarına ifade düzeyleri oldukça düşük olabilir ve vermek floresan sinyallerini nispeten düşük, bu fotonlar yeterli sayıda, özellikle tüm cep telefonu için (ki sadece birkaç 1.000 s fotonlar, gerektirir) FLIM elde edilebilir olduğunu bekleniyor. Ayrıca, bu perde-FLIM ölçümler de daha yüksek floresan sinyallerini ve daha iyi foton istatistikleri neden olur daha duyarlı çığ fotodiyot dedektörleri ile gerçekleştirilebilir.

Membran kaçakçılığı nerede membran veziküller kapalı bir donör organel bud ve sonra taşımak ve bir hedef organel1,2ile sigorta ökaryotik hücrelerin merkezi bir özelliktir. Mitokondri hariç, tüm bu membran füzyon adımları SNARE proteini aile1,2üyeleri tarafından katalize. Memeli hücrelerinde yaklaşık 36 üye ve Maya2yaklaşık 20 üye SNARE proteini aile oluşur. TUZAK proteinler SNARE-motifler denilen bir veya iki ~ 52 artıkları-uzun, yerel olarak yapılandırılmamış bölgeler, içerir. TUZAK proteinler kez bir C-terminal transmembran heliks1,2tarafından membranlar için gergin. Tuzaklarına katkıda bulundukları karmaşık tuzak arginin (R) ve glutamin (Q) tuzaklarına1,2olarak Merkezi artıkları göre sınıflandırılabilir. Membran füzyon birlikte 4 SNARE-motifler katkıda bulunmak ve üzerinde donör ve alıcısı membran1,2dağıtılan 3 ya da 4 soydaş tuzaklarına etkileşim tarafından tahrik edilmektedir. Bir tuzak kompleks bir R-tuzak motif ve üç Q-tuzak motifleri (kalite güvence, oyun kurucu ve Qc olarak adlandırılan) oluşur. Karmaşık oluşumu başlar SNARE-motifler, sözde transşekillendirme termini N-tuzak-karmaşık ve CISdenilen bir sıkı α-Helisel dolandı-bobin paket oluşturan C termini doğru gelirleri-tuzak-karmaşık. Hatta tek bir tuzak karmaşık karmaşık oluşumu donör ve alıcısı membranlar birlikte sürükler ve membran fusion3için enerji bariyeri üstesinden gelir.
Hücrelerin içindeki belirli ulaşım yolları ayrı SNARE kompleksleri atama kez teknik olarak zordur. Tuzaklarına açıkça kaçakçılığı membran özgüllük katkıda rağmen önüne gelenle yatıp kalkan, işlevsel olarak gereksiz olduğu ve bunların işlevlerini1,2örtüşmesi. Bu nedenle, pertürbasyon deneyler tuzaklarına, gibi hedefleyerek gen nakavt, RNA müdahale, tanıtım antikorlar engelleme ya da baskın negatif hareket çözünür SNARE parçaları ile sık sık diğer açık fenotipleri neden değil Tuzaklarına telafi etmek2,4. Ayrıca, tuzaklarına birden çok taşıma yolları2' dahil belirli membran füzyon adımları ters yönde kaçakçılığı olaylardan ayırt etmek zordur. Tuzaklarına yerelleştirme çalışmalarının mikroskobu yaklaşımlarla, immunolabeling veya floresan muhabir proteinler, genetik fusion kullanarak sorunları muzdarip bu: (i) tuzaklarına bulmak için birden fazla organelleri kez birden çok kaçakçılığı adımları ve (ii) arabuluculuk gibi onların yerelleştirmeler otomatik olarak işlevsel olarak tuzak karmaşık oluşumunda nişanlandıklarını anlamına gelmez. Son olarak, tuzak kompleksleri tuzaklarına birini kullanarak yem ve diğer tuzaklarına hedef olarak immunoprecipitation deneyler kullanılarak belirlenebilir ama bu özel organelleri veya ticaret yolları bu komplekslerin atama izin vermez. Böylece, şu anda, tuzak kompleksleri ile organellar kararlılık görselleştirmek için alternatif hiçbir tekniği yoktur. Ayirt SNARE etkileşimleri kanıtlamak mümkün değil ama sadece varlığı ya da yokluğu co yerelleştirme gösterebilir, immunoprecipitation sadece gösterebilir iken SNARE etkileşimler tüm hücre nüfus ama organelleri atamak değil nerede bunlar etkileşimler meydana gelir.
Bu sınırlamayı aşmak için tuzak kompleksleri organellar çözünürlük ile canlı hücrelerdeki nicel görselleştirme için izin veren bir roman yöntemi son zamanlarda Verboogen ve ark. tarafından geliştirildi 5 bu yöntemi C-ölümcül onların transmembran sarmal erimiş hayalice değiştirdi floresan proteinler ile tuzaklarına çiftlerini ifade üzerinde temel alır. Membran fusion ve CISoluşumu tamamlanmasından sonra-karmaşık tuzak, bu fluorophores C-termini transmembran sarmal, hemen birbirine bitişik. Fluorophores sonra iyi Förster mesafesindedir (genellikle &#60; 5 nm), sonuçlanan FRET yeşil kaymıştır donör fluorophore gelen kırmızı kaymıştır alıcısı fluorophore5,6. Donör fluorophore ve donör ve alıcısı emisyon (ratiometric perde) oranları ölçülebilir alıcısı fluorophore artan bir emisyon Şoklama sonuçlarındaki FRET. Ancak, ratiometric iki farklı molekül arasında perde, Floresans donör ve alıcısı tuzaklarına farklı organelleri ve hücreleri7,8arasında çapraz-hadis ve farklı düzeylerde nedeniyle meydan okuyor. PERDE uyarma ve bir foton emisyon arasındaki zamanı Floresans Lifetime ölçülebilir. Donör fluorophore enerjisini tarafından serbest bırakabilirsiniz Eğer FRET, belirgin bir kısalma Floresans ömür boyu rakip bu işlem sonucu. Bu FLIM7,8tarafından ölçülebilir. Ömür boyu perde perde ratiometric çok daha sağlam Floresans ömür boyu bir fluorophore, içsel bir özelliktir ve onun konsantrasyon için büyük küçük harf duyarlı olarak iki farklı molekül, arasındaki etkileşimler ölçmek için. Ayrıca, FRET yaklaşım nicel, çünkü FRET verimliliğini donör ve alıcısı fluorophores (aslında bir basamak fonksiyonu) arasındaki mesafe altıncı gücüne ters orantılıdır. Bu nedenle, bir çift bileşenli çürüme modeli ile FLIM tarafından kaydedilen Floresans ömür boyu histogramlar yaklaştırarak, FRET-FLIM (yarı-) kantitatif tahmini SNARE karmaşık oluşumu5' te nişanlı SNARE moleküllerin fraksiyonunun için sağlar.
Son zamanlarda, bu perde-FLIM yöntemi Verboogen vd tarafından kullanıldı SNARE karmaşık oluşumu birincil dendritik hücreler bağışıklık sistemi5görselleştirmek için. Bu patojen bir uyarıcı gelince, dendritik hücreler kendi membran ile özellikle, Qa-tuzak sözdiziminin 4 R-tuzak vezikül ilişkili membran proteini (VAMPİR) 3 artan bir kompleks eşliğinde ticareti yeniden yönlendirme olduğunu gösterildi Plazma zarı. Bu artan SNARE karmaşık oluşumu büyük olasılıkla İnterlökin-65gibi inflamatuar sitokinlerin salgılanmasını artmış salgı kapasitesini karşılamak için gereklidir. Bu iletişim kuralı SNARE kompleksleri görselleştirme ve (yarı-) kantitatif ölçüm için FRET-FLIM veri edinimi için deneysel adımları açıklar.Bu nasıl için bütün hücreli Floresans ömür boyu histogramlar SNARE etkileşimlerine belirgin Floresans ömür boyu nicel bir tahmin olarak sonuçlanan mono ve BI üstel çürüme işlevleriyle uygun açıklanmıştır. Bu iletişim kuralı, yaygın olarak kullanılan HeLa hücre örnek olarak kullanılır, ancak yöntem SNARE kompleksleri diğer ökaryotik hücrelerde çalışma için kolayca genişletilebilir.

<table><tbody><tr><td>Plazmid DNA 'sözdizimi'4-mSitrin'Addgene</td><td></td> <td>ID 92422</td><td>C-terminal transmembran sarmallarına kaynaşmış floresan proteinleri olan diğer SNARE'ler de kullanılabilir. mSitrin-mCherry yerine, spektral olarak ayrılmış floroforların diğer donör-alıcı çiftleri de kullanılabilir (ör., CFP-YFP).</td></tr><tr><td>Plazmid DNA 'VAMP3-mCherry'Addgene</td><td></td> <td>ID 92423</td><td>C-terminal transmembran sarmallarına kaynaşmış floresan proteinleri olan diğer SNARE'ler de kullanılabilir. mSitrin-mCherry yerine, spektral olarak ayrılmış floroforların diğer donör-alıcı çiftleri de kullanılabilir (ör., CFP-YFP).</td></tr><tr><td>Plazmid DNA 'sözdizimi 3-mSitrin-mCherry'Addgene</td><td></td> <td>ID 92426</td><td>Maksimum ulaşılabilir FRET için pozitif kontrol.</td></tr><tr><td>Hela hücreleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm cam tabanlı tabaklar&nbsp;</td><td>Willco Wells</td><td>HBST-3522</td><td>Diğer canlı hücre görüntüleme odaları,</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unun</td> yerine geçecek <td>Gibco, Life Technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>Greiner Bio-one</td><td>758093</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-antimikotik solüsyon</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Pen/Strep ikame olarak çalışacak</td></tr><tr><td>Canlı hücre görüntüleme orta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14291DJ</td><td>Ortamdan floresan önlendiği sürece başka herhangi bir canlı hücre görüntüleme çözümü işe yarayacaktır</td></tr><tr><td>63x 1.20 NA suya daldırma objektifli Leica SP8 konfokal mikroskop</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Zaman alanlı FLIM yapabilen diğer konfokal mikroskoplar da kullanılabilir</td></tr><tr><td>Darbeli beyaz ışık lazeri</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Diğer darbeli lazer kaynakları da kullanılabilir</td></tr><tr><td>Zamanla İlişkili Tek Foton Sayma (TCSPC) sistemi</td><td>PicoQuant</td><td>PicoHarp 300</td><td></td></tr><tr><td>PT32ICS dönüştürme yazılımı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evrişimi çözme yeteneğine sahip www.membranetrafficking.com veri analizi yazılım programının</td> 'Yazılım' bölümünde mevcuttur <td>Originlabs OriginPro</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yoğunluk Fiji ImageJ ile FLIM görüntüsünün evrişimi için özel yapım Fiji ImageJ</td><td></td><td></td><td>makrosu www.membranetrafficking.com B&uuml'un 'Yazılım' bölümünde mevcuttur</td></tr><tr><td>; rker Hemositometre</td><td>VWR</td><td>630-1541</td><td></td></tr><tr><td>HeLa hücreleri</td><td>ATCC</td><td>ATCC&nbsp; CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B Braun Melsungen&nbsp; AG</td><td>362 3140</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 2 mM</td><td>Merck</td><td>108417</td><td>CAS: 60-00-4</td></tr><tr><td>15 mL tüpler</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595</td><td>CAS: 72-57-1</td></tr><tr><td>NEON hücre elektroporasyon cihazı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr></tbody></table>

hücre içi snare mikroskobu imaging floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Ökaryotik hücrelerde membran füzyon katalizler çözünür N- ethylmaleimide hassas füzyon proteini (NSF) ek protein reseptörü (tuzak) proteinler membran kaçakçılığı için anahtar şunlardır. SNARE proteini aile 36 farklı üyeleri için oluşur. Belirli hücre içi ulaşım yolları böylece özgüllük katkıda 3 ya da 4 SNARE proteinler belirli kümelerini ve membran ticareti sadakat tarafından katalize. Çünkü tuzaklarına birden fazla olması ve işlevleri üst üste çoğu tuzaklarına ile son derece bol ve işlevsel olarak gereksiz, ancak, tuzak proteinlerin hassas işlev eğitim teknik olarak, meydan okuyor. Bu protokol için görselleştirme canlı hücrelerdeki SNARE karmaşık oluşumu için yeni bir yöntem açıklanır. Bu yöntem SNARE protein C-ölümcül floresan proteinler için erimiş ifade üzerinde temel alır ve onların etkileşim Förster rezonans enerji tarafından ölçme transfer (FRET) istihdam Floresans ömür mikroskobu (FLIM) görüntüleme. Floresans ömür boyu histogramlar özellikli bir uygulamasının çürüme yaklaştırarak, FRET-FLIM farklı veziküller (yarı-) kantitatif tahmini SNARE karmaşık oluşumu kısmını sağlar. Bu iletişim kuralı SNARE karmaşık oluşumu plazma zarı ve endosomal bölmeleri memeli hücre satırları ve birincil bağışıklık hücreleri görselleştirmek için başarıyla uygulandı ve SNARE işlevler diğer organelleri, çalışmaya kolayca genişletilebilir Hayvan, bitki ve mantar hücreleri.

SNARE etkileşimler tarafından FRET-FLIM ölçmek için tahlil mantığı şekil 1' de gösterilen. C-termini soydaş SNARE proteinlerin transmembran sarmal hayalice değiştirdi floresan proteinler (örneğin, mCitrine ve mCherry) bir çift için erimiş. CISoluşumu-hemen birbirine bitişik olmak floresan bu proteinler membran füzyon sonuçlarında üzerine karmaşık tuzak ve YIPRATMAK. Şekil 2 SNARE proteinler fluorescently etiketli ifade HeLa hücreleri temsilcisi confocal görüntüleri gösterir. Bir hücre (alıcısı fluorophore), VAMP3-mCherry ile ifade sözdiziminin 4-mCitrine (donör fluorophore) yanı sıra denetim koşulları sadece sözdiziminin 4-mCitrine yapý (donör sadece; hiçbir perde) ve her iki mCitrine için erimiş sözdiziminin 3 ifade hücre gösterilen ve tandem (maksimal expectable perde) mCherry. Şekil 3 eşlik eden floresan ömür boyu ve ömür boyu histogramlar mono üstel çürüme fonksiyonları (şekil 3A-B) ve BI üstel çürüme işlevleri () ile her pikselin yaklaştırarak oluşturulan FLIM görüntüler gösterir Şekil 3 c - D). şekil 4A bir mikroskop cam arka saçılma tarafından ölçülen bizim ayarlarına IRF gösterir. Şekil 4B-E, temsilcisi Floresans ömür boyu histogramlar tüm cep telefonu ile birlikte uyum eşlik eden FLIM analiz, mono-üstel çürüme işlevleri için eğrileri gösterilmektedir. Şekil 4F bir önde gelen yansıma zirveye çıkan mikroskop kapak cam yüzeye çok yakın yansıma bir deney floresan ömür boyu histogramını gösterir. Şekil 4 g ile BI üstel çürüme işlev sığdırmak temsilcisi ile ömür boyu histogramını gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig1.jpg"> 
Şekil 1: tuzak kompleksleri perde tarafından görüntülenmesi için mantığı düzeninin. (A)yapısal model nöronal tuzaklarına (protein veritabanı 3HD717) vezikül ilişkili membran proteini (VAMPİR) 2 (mavi; R), sözdiziminin 1 (kırmızı; Qa-SNARE) ve SNAP25 (yeşil; her iki bir oyun kurucu ve Qc SNARE motif içerir). C-terminus transmembran heliks sözdiziminin-1, mCitrine (donör fluorophore; protein veritabanı 3DQ118) Birleşik. C-terminus VAMP2 transmembran heliks, mCherry (alıcısı fluorophore; protein veritabanı 2H5Q19) Birleşik. (B) düzeni SNARE perde içinde sonucu membran füzyon aracılık. Membran füzyon oluşumu bir CIStarafından sonra-tuzak karmaşık, tuzaklarına hemen perde içinde kaynaklanan birbirine bitişik. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig2.jpg"> 
Şekil 2: ifade SNARE proteinlerin erimiş floresan proteinler için. İlk sütun: donör fluorophore, 516 heyecanlı nm. İkinci sütun: alıcısı fluorophore, 610 heyecanlı nm. (A)donör sadece durumu. Bir HeLa hücre ifade sözdiziminin 4-mCitrine (donör fluorophore; yeşil birleştirmede) temsilcisi confocal görüntüsü. Alıcısı kanal (ikinci sütun) floresan çapraz-talk gösterir. (B) negatif kontrol (FRET). Her iki sözdiziminin 4-mCitrine VAMP3-mCherry (alıcısı fluorophore; kırmızı mektup birleştirme işleminde) ile ifade bir HeLa hücre temsilcisi confocal görüntüsü. (C) pozitif kontrolü (maksimal expectable perde). Bir HeLa hücre ifade sözdiziminin 3-mCitrine-mCherry tandem temsilcisi confocal görüntüsünü oluşturun. MCitrine ve mCherry Floresans sinyalinin değil tamamen örtüşme, mCitrine mCherry için karşılaştırıldığında lizozomal bozulması için daha düşük bir direnç nedeniyle büyük olasılıkla sinyalleri Not (tartışma bölümüne bakın). BF: parlak alan. Ölçek çubukları, 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig3.jpg"> 
Şekil 3: FLIM görüntüleri SNARE karmaşık oluşumu. (A)temsilcisi Floresans ömür boyu görüntüleri Şekil 2' de gösterilen hücre. Görüntüleri bir TCSPC sistemi (.pt3) tarafından kaydedilen foton izlemeler dönüştürerek PT32ICS yazılımını kullanarak görüntü sitometresi için standart (.ics) oluşturuldu. Tek piksel görüntüleri daha sonra TRI2 yazılım12,13 eşik 15-0 yoğunluğu, 7 piksel dairesel binning ve monoexponential uygun algoritması (başta) ile kullanarak oluşturulan Floresans ömür boyu donatılmış. Rengi ortalama belirgin floresan ömür boyu gösterir. (B) FLIM görüntüleri nerede Floresans ömür boyu görüntüleri (gösterildiği Masası A) ( Şekil 2' de gösterilen) mCitrine donör fluorophore floresan yoğunluklarda ile kıvrık. Evrişim FIJI özel yapım bir makro kullanarak ImageJ ile gerçekleştirildi ( Tablo malzemelerigörmek). (C) floresan ömür boyu ve sözdiziminin 4-mCitrine ve VAMP3-mCherry A-B panelleri, ama şimdi BI üstel çürüme eğrileri ile uygun ile ifade HeLa hücre FLIM görüntüleri (bkz: ömürleriyle denetim koşulları için; sabit 4,4 inç adım iletişim kuralı). Tahmini kesirler F sözdiziminin 4 kompleks içinde VAMP3 ile piksel rengi belirtir (Denklem 3). (D) aynı panel B olarak ama BI üstel için uygun. Evrişim FIJI özel yapım bir makro kullanarak ImageJ ile gerçekleştirildi ( Tablo malzemelerigörmek). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig4.jpg"> 
Şekil 4: tüm cep telefonu FLIM analiz. (A) kurulum aracı yanıt fonksiyonu (IRF). IRF geri saçılma (su içeren bir temiz cam mikroskobu yemek kullanarak) cam-su arabirimi kullanılarak ölçüldü.(B-E) Bütün ömür boyu histogramlar Şekil 2 ve şekil 3' te gösterilen hücrelerin hücre. Tüm fotonlar görüntüleri mevcut havuzlu. Eğrileri ile IRF deconvoluted ve mono-üstel çürüme fonksiyonları (Denklem 1) ile donatılmış. Bu hücreler için 2,82 Floresans yaşam süreleri elde edilmiştir ns (ifade tek sözdiziminin 4-mCitrine; sadece donör; panel B hücreleri), 2.09 ns (sözdiziminin 4-mCitrine VAMP3-mCherry ile birlikte ifade hücreleri; Masası C) ve 2.08 ns (hücreleri ifade sözdiziminin 3 - mCitrine-mCherry tandem oluşturmak; maksimal expectable perde kontrolü; Panel D). Dişlerin ama şimdi y ekseni logaritmik ölçekleme ile aynı grafikler gösterirken. Panel E bir bindirme panelleri B-d çürüme eğrilerinin gösterir Bir floresan ömür boyu çubuk grafik örneği (F) mikroskop kapak notu yüzeye çok yakın kaydetti. Bir büyük yansıma tepe (sarı gölgeli alan tarafından tasvir) sonuçlanır. (G) şimdi ile yaşam süreleriyle BI üstel çürüme eğri uydurma ama C, panel gibi (bkz. Adım 4.4 protokolündeki) denetim koşulların sabit. Hızlı (A1) ve yavaş (A2) bileşenlerinin genlikleri 14.42 ve 0,01, sırasıyla, tuzaklarına karmaşık F 0,99 (Denklem 3) tahmini bir kısmını sonuçlanan idi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 1. İşlevi dosya FLIM_convoluted_IRF <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF.FDF">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosyası 2. İşlevi dosya FLIM_convoluted_IRF_biexp <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF_biexp.FDF">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Bu protokol bırakmak Förster rezonans enerji transferi ve floresan mikroskopi Imaging ömür boyu göre SNARE proteinlerin karmaşık oluşumu nicel görselleştirme için yeni bir yöntem açıklanır.

Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Bu deneyin genel amacı, canlı hücrelerde SNARE proteinlerinin karmaşık oluşumunu görselleştirmektir. Bu yöntem, belirli organella kaçakçılığı adımlarını katalize eden SNARE protein setlerinin tanımlanması gibi membran kaçakçılığı alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, SNARE'lerin karmaşık oluşumlara girdiği hücresel konumların doğrudan görselleştirilmesine izin vermesidir.Bu deneyde, transfeksiyon için üç Eppendorf tüpü arasında bölünmüş 900.000 HeLa hücresi kullanılmıştır. Hücreleri, metin protokolünde açıklandığı gibi aşağıdaki yapılarla transfekte edin. Syntaxinin-4 mSitrin yapısına sahip bir numaralı örnek, syntaxinin-4 mSitrin ve VAMP3-mCherry ile iki numaralı numune ve hem mSitrin hem de mCherry ile kaynaşmış sözdizimin-3 ile üç numaralı örnek.Transfekte edilmiş hücreleri, gece boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe %5 CO2 ile 37 santigrat derecede %10 FCS ve %1 antibiyotik antimikotik ile sağlanan yüksek glikozlu DMEM'de kültürleyin. Ertesi gün, ortamı aspire edin ve hücreleri iki dakika boyunca canlı hücre görüntüleme ortamı ile bir kez yıkayın. Bundan sonra, hücreleri taze görüntüleme ortamına yerleştirin.Bu prosedüre başlamak için, iki numaralı numuneyi 37 santigrat derecede, ısıtılmış bir sahneye, donör florofor ve zamanla çözülmüş veri toplama için darbeli bir uyarma kaynağına sahip bir zaman alanı floresan ömür boyu görüntüleme konfokal mikroskobunun altına yerleştirin. Her floresan yaşam süresi görüntüleme mikroskobu veya FLIM ölçümünden önce, mSitrin ve mCherry etiketli SNARE proteinlerinin görünür ifadesine sahip bir hücre seçin ve her iki floroforun aynı anda uyarılmasıyla 256 x 256 piksellik bir konfokal görüntü kaydedin. FLIM görüntüsü, daha önce kaydedilen konfokal görüntüyle aynı boyutlarda ve uzamsal çözünürlükle kaydedilmiş FLIM görüntüsüyle FLIM'i çalıştır'ı tıklatarak bir FLIM görüntüsü kaydedin.Görüntüyü, tüm hücre FLIM analizi için en az 50.000 foton veya piksel başına en az 400 foton ile kaydedin. Yansıma görüntüsünü önlemek için FLIM ölçümlerini cam yüzeyinden en az bir mikrometre uzakta kaydetmek önemlidir. Görüntülemeyi iki numaralı numunedeki birden fazla hücreden ve bir numaralı numune ve üç numaralı numunedeki hücreler için tekrarlayın.Ardından, bir cihaz yanıt fonksiyonunu veya IRF'yi kaydetmek için mikroskop aşamasına temiz bir cam kapak fişi yerleştirin. Emisyon dedektörünün monokromatörünü uyarma dalga boyuna ayarlayın ve cam kapak kaymasından geri saçılma ile bir FLIM görüntüsü kaydetmek için FLIM'i çalıştır düğmesine tıklayın. Fotoğraf kayıtları, PT32ICS dönüştürme yazılımı ile FLIM görüntülerine dönüştürülecektir.Yazılımı yapılandırın. FLIM görüntüleri oluşturmak için çıktıyı ImageJ olarak ayarlayın. Görüntü boyutunu 256 x 256 piksel ve kanalı iki piksel olarak ayarlayın.Dönüştür düğmesine basın ve bir veya daha fazla foton izi yükleyin. Birden fazla foton izi seçmek için kontrol tuşunu basılı tutun. FLIM görüntüleri, foton izlerinin kaydedildiği aynı klasörde oluşturulmalıdır.Dekonvolüsyon ile uyum sağlayabilen veri analizi yazılım programını açarak başlayın. Her foton izi için histogramı içeren metin dosyasını içe aktarın. Tabloyu, IRF tablonun ikinci sütununda, A sütunundaki zaman değerlerinin yanında olacak şekilde yeniden düzenleyin.Tüm sütunları seçerek kaydedilen foton izlerinin kalitesini belirleyin.Yüksek yansıma zirvesine sahip foton izlerini analiz etmeyin. Burada bir örnek gösterilmiştir. Takılacak kalite kontrollü ömür boyu histogramları içeren tüm sütunları ve B sütunundaki IRF'yi seçmek için kontrol tuşunu kullanın ve doğrusal olmayan bağlantı parçasını yükleyin.Bu işlevi analiz yazılımına ekleyerek evrişimden arındırılmış uyum işlevini yükleyin. Sığdırma işlevi dosyasını seçin. Bu fonksiyon, IRF ile evrişimden arındırılmış bir mono üstel bozunma fonksiyonu ile floresan ömrü histogramlarına uyar.Takılan eğrilerin X ekseni ölçeklemesini gerçekleştirin. Fit tuşuna basarak eğrileri sığdırın. Bu, uyumu dönüştürecek ve floresan ömürlerini, ofsetleri ve genlikleri içeren tabloyla birlikte dizide bir rapor sayfası oluşturacaktır.Ayrıca, takılan eğrileri ve uyumun kalıntılarını içeren bir veri sayfası oluşturacaktır. Gösterilenler, yalnızca sözdiziminde dört mSitrin, snytaxin dört mSitrin ile VAMP3 mCherry veya sözdiziminde üç mSitrin mCherry tandem yapısını ifade eden helosellerin temsili konfokal görüntüleridir. Eşlik eden bu floresan ömrü görüntülerinde renk, ortalama görünür floresan ömrünü gösterir.Görüntüler daha sonra mSitrin donörü floroforunun floresan yoğunlukları ile birleştirildi. Daha sonra, iki üstel bozunma fonksiyonlarına uyan aynı görüntüler var. Piksel renkleri, VAMP3 ile karmaşık olarak dörtte tahmini sözdizimi kesirlerini gösterir.Kurulumun cihaz tepki fonksiyonu, cam su arayüzündeki geri saçılma kullanılarak ölçüldü. Tüm hücre ömrü histogramları, yalnızca dört mSitrin'de sözdizimini ifade eden, dört mSitrin'de VAMP3 mCherry ile birlikte sözdizimini ifade eden ve üç mSitrin mCherry tandem yapısında sözdizimini ifade eden hücreler için gösterilir. Panel E, B, C ve D panellerinin bozunma eğrilerinin bir kaplamasını gösterir.Kakmalar aynı grafikleri gösterir, ancak Y ekseninin logaritmik ölçeklemesi ile.Mikroskop kapak kaymasının yüzeyine çok yakın kaydedilen bir floresan ömrü histogramı, sarı gölgeli alanla gösterilen büyük bir yansıma zirvesi ile sonuçlandı. Son olarak, iki üstel bozunma fonksiyonu ile temsili uyuma sahip bir ömür boyu histogram gösterilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa iki ila dört saat içinde yapılabilir.Bu prosedürü denerken, donörün ve önleyicinin SNARES'in ekspresyon seviyeleri kullanım ömrünü etkileyebilirken birden fazla hücreyi kaydetmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, SNARE aracılı membran trafiğinin yeniden köklendirilmesi ile ilgili hücre tipine özgü soruları yanıtlamak için hücreler aktive edilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, zar kaçakçılığı alanındaki araştırmacıların tüm ökaryotik hücrelerde organella trafiğinin hücreler arası yollarını keşfetmelerinin yolunu açtı.Bu videoyu izledikten sonra, FLIM verilerinin nasıl kaydedileceğini ve analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Genetiği değiştirilmiş organizmalar ve yüksek güçlü lazerlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü denerken her zaman eldiven ve göz koruması gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

visualizing-intracellular-snare-trafficking-fluorescence-lifetime

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, nöronal veziküllerin hareketlerini görselleştirmek için belirli floresan proteinlerle nasıl etiketlendiğini gösterir. İlk olarak, bir floresan proteini kodlayan bir plazmit, bir transfeksiyon ajanı ile inkübe edilir ve daha sonra bir nöron kültürüne sokulur. Daha sonra, veziküllerin hareketini izlemek için nöronların görüntüleri elde edilir ve analiz edilir.

Floresan Görüntüleme Kullanılarak Nöronlardaki Vezikül Motilitelerinin Görselleştirilmesi

Kaynak: Pigazzini, M. L., et. al. Yaşlanmada Amiloid Yapıların Karakterizasyonu C. elegans{{}}. J. Vis. Uzm.  (2020). Bu video, C. elegans nöronlarında poliQ protein agregasyonunu değerlendirmek için floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobunun (FLIM) kullanımını göstermektedir, kontrol ve şaperon protein eksikliği olan solucanları karşılaştırır. Şaperon eksikliği olan solucanlarda artan agregasyon, kümelenmiş floroforlar arasında enerji transferini teşvik ederek floresan ömrünü azaltır. FLIM...

Caenorhabditis elegans Nöronlarında PolyQ Protein Agregasyonunun Floresan Ömür Boyu Görüntülenmesi

Klatrin aracılı endositoz, hızlı ve oldukça dinamik bir süreç, sinyal reseptörleri de dahil olmak üzere birçok proteini içselleştirir. Burada açıklanan protokol, bireysel endositik olayların kinetiğini doğrudan görselleştirir. Bu, endositik makinenin çekirdek üyelerinin birbirleriyle nasıl koordine olduğunu ve protein yükünün bu süreci nasıl etkilediğini anlamak için gereklidir.

TIRF Mikroskopi ile Tek olay ebatları da G protein-bağlanmış alıcılar üzerinden Klatrin dolayımlı endositoz görselleştirme

Bu makale, bir sinaptobrevin2-pHluorin yapısı ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanarak nöroblastom hücrelerinde nörotransmitter vezikül dinamiklerini araştırmak için bir yöntem sağlar. Görüntü işleme ve veri analizi için geliştirilen strateji de raporlanmaktadır.

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Burada, tek bir molekül duyarlılık ve ~ 15 msn zaman çözünürlüğü ile polarize TIRFM kullanılarak lipozomlar ve mikroakışkan kanallarda desteklenen iki katmanlı arasındaki tek tuzak aracılı füzyon olayları tespit etmek için bir protokol mevcut. Lipid ve çözünür kargo sürümü aynı anda tespit edilebilir. Lipozom boyutu, lipit yayınım ve füzyon gözenek özellikleri ölçülmüştür.

Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion

pH'ya duyarlı bir florofor ile bir membran proteinin hücre dışı alanını Etiketleme, superecliptic pHluorin (SEP), hücre içi lokalizasyonu, sentezleme ve trafik saptanmasına olanak sağlamaktadır. Görüntüleme toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) proteinleri Eylül-etiketli periferal ER ve plazma membranı protein seviyelerinin ölçümü sağlar.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Burada biz göstermek tek molekül fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu canlı Drosophila melanogaster motor sinir terminal üzerinde yürütülen olabilir nasıl üçüncü larva biçim.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

Bir prosedür protein kinaz görselleştirmek için sunulmuştur baş-sabit, davranan fareler bir aktivite. Gelişmiş A-kinaz aktivite muhabiri, tAKARα, kortikal nöronlar içinde ifade edilir ve kafatası penceresinden görüntüleme için erişilebilir hale gelmiştir. İki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskopisi, uygulanan lokomotif sırasında PKA etkinliklerini görselleştirmek için kullanılır.

In vivo Iki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskobu kullanarak kafa-sabit davranan fareler Içinde bir aktivite, protein kinaz görselleştirme

Görüntüleme kaynaklı ortalama kare yer değiştirme (iMSD) analizi, makropinozomlara yapısal ve dinamik özellikler açısından içsel zaman evrimleşen doğalarını vurgulamak için uygulanır. Makropinozomlar daha sonra zaman değişmez ortalama yapısal / dinamik özelliklere sahip hücre altı yapılar için bir referans olarak insülin salgı granülleri (ISG'ler) ile karşılaştırılır.

Spatiotemporal Dalgalanma Spektroskopisi ile Kaçakçılık Yapan Hücre Altı Nanoyapıların Yapısal ve Dinamik Özelliklerinin İncelenmesi

Makale, canlı bir nematoda tek nöron çözünürlüğünde endojen etiketli kargoların aksonal taşınmasını görselleştirmek için floresan mikroskobu edinim parametrelerinin optimizasyonunu açıklamaktadır.

Canlı Caenorhabditis elegans'ta Floresan Mikroskobu ile Endojen Yükün Aksonal Taşınmasının Görüntülenmesinin Optimize Edilmesi

Öğrenin canlı hücrelerde SNARE protein kompleks oluşumunu FLIM ile görüntülemeyi. HeLa hücreleri kullanılarak membran trafik mekanizmalarını inceleyin ve hücre içi organel taşınmasının dinamiklerini keşfedin.

Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet