Bir Genotipik Yöntemi'ne Dizi Analizi ile HIV-1 coreceptor Kullanımı (tropizm) Tahmin

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yeni bir antiretroviral ilaç sınıfının uygulanması için HIV 1'in ko-reseptör kullanımını tahmin etmektir. Bu işlem, zarf bölgesinin amplifikasyonunu takiben hastanın kanından viral genomik nükleik asitlerin, viral RNA'nın veya proviral DNA'nın izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Tropizm için temel belirleyici olan viral V üç bölgesi, nested PCR ile amplifiye edilir.

Ardından, bir fasta dosyası oluşturmak amacıyla V3 amplikonu farklı primerler kullanılarak dizilenir. Çevrimiçi yorumlama aracı geno to pheno coreceptor tarafından elde edilen yalancı pozitiflik oranı veya FPR'ye dayalı olarak viral tropizm ve koreseptör antagonist duyarlılığını gösteren sonuçlar elde edilir. KORESEPTÖR kullanımına bağlı olarak, HIV virüsleri R5 veya X4 olarak sınıflandırılır.

Maraviroc, CCR5 reseptörüne bağlanarak R5 virüslerinin hedef hücreye girişini inhibe eder. Hastalık seyri sırasında X4 virüsleri ortaya çıkabilir ve R5 virüslerinden daha baskın hale gelebilir. Bu nedenle, EMA ve FDA tarafından talep edildiği üzere, maraviroc uygulaması öncesinde tropizm olarak da adlandırılan reseptör kullanımının belirlenmesi zorunludur.

Bu tekniğin temel avantajı, diğer antiretroviral ilaç sınıflarına karşı direncin paralel olarak çok kolay bir şekilde belirlenebilmesidir. Tropizm sonuçları için kesme değerlerinin hastanın ihtiyaçlarına göre düzenlenebilmesi, bu yöntemin çok daha kişiselleştirilmiş bir tıp uygulamasına olanak sağlamasını sağlar. Bu yöntemle ilgili fikir, doksanlı yılların başında, HIV suşlarının farklı hücre kültürü büyüme hızlarının ve hastalardaki seyirlerinin moleküler temelini öğrenmek istediğimizde ortaya çıktı; prosedürü grubumuzdan bir teknisyen protokolün başlangıcından önce gösterecektir.

Örnekler klinik sahada EDTA'lı kan olarak toplanır ve MagPure Compact sistemi ile nükleik asit izolasyon kitini üretici talimatlarına uygun şekilde kullanarak, 1000 µL tüm kan serumu veya plazmasından HIV nükleik asitlerini izole etmek üzere laboratuvara gönderilir. Elde edilen RNA veya DNA, ardından 50 µL TE tamponunda çözülür. Bir sonraki adım, metinde belirtildiği üzere RNA için ters transkripsiyon PCR veya DNA için sadece PCR ile nükleik asidin zarf bölgesini amplifiye etmektir; reaksiyon, zarf protein bölgesinin çoğunu içeren 1.245 baz çifti uzunluğunda bir ürün oluşturmalıdır. Zarf proteininin V3 bölgesini amplifiye etmek için, ilk PCR reaksiyonundan 5 µL'yi kalıp olarak kullanarak nested PCR uygulayın.

Reaksiyonları, metinde açıklandığı şekilde kurum içi nested PCR için hazırlanan master mix kullanarak hazırlayın. Nested PCR çalıştırma parametreleri de orada belirtilmiştir. V3 bölgesinin amplifikasyonunun ardından, dizileme öncesinde, jel elektroforezi ile 902 baz çifti uzunluğundaki beklenen ürünün doğruluğunu kontrol etmek için PCR ürününü analiz edin.

PCR ürününü yazılı protokolde açıklandığı şekilde saflaştırın. PCR ürünü saflaştırıldıktan sonra, reaksiyon tamamlandığında metinde belirtildiği gibi dizileme reaksiyonunu gerçekleştirin. Saflaştırılmış ürünü dizilemek için, bu prosedürün yazılı kısmındaki talimatları izleyerek dizileme örneklerini cidex G 50 superfine ve durapore membrana sahip çoklu elek filtre plakası kullanarak saflaştırın; polimeri kontrol ederek ve tamponu değiştirerek dizileme cihazını hazırlayın.

Ardından numuneleri yükleyin, koşulları ayarlayın ve çalışmayı başlatın. Sekanslama işleminin ardından, sekansları hizalamak ve düzenlemek için DNA STAR laser gene programı kullanılabilir.

V3 amplikonu, en az bir ileri ve bir geri primer ile sekanslanır. Lasergene, sekans cihazından elde edilen ABI dosyalarını referans sekanslarla hizalar. Lasergene; V3, consensus B ve envelope için, referansları kullanmadan mevcut tüm ham verileri kullanarak analiz edilen örneğin bir konsensüs sekansını oluşturur ve bunu bir FASTA dosyası olarak kaydeder.

FASTA dosyası, örneğin adını içeren bir başlık ve nükleotit dizisini içeren bir metin dosyasıdır. Veri yorumlama ve tropizm tahminine başlamak için FASTA dosyasını web tabanlı yorumlama sistemine yükleyin. Geno Tono ko-reseptörü için, virüsün R beş olarak sınıflandırıldığı FPR eşik değerini seçin.

Alman kılavuzları kullanılarak virüs, FPR %20'ye eşit veya daha büyük olduğunda R beş, FPR %12,5'ten küçük olduğunda ise X dört olarak sınıflandırılır. Varsa ek klinik parametreleri seçin, ardından "align and predict" (hizala ve tahmin et) seçeneğini belirleyin. Bu sunucu, nükleotid dizisini amino asitlere çevirir, V üç konsensüs B dizisi ile hizalar ve bir alt tip sınıflandırması oluşturur. Ek olarak, FPR olarak ifade edilen ko-reseptör kullanımı tahmini üretir.

Çıktı, ko-reseptör kullanım olasılığına bağlı olarak kademeli bir yorum sunar. Yüksek FPR değerleri için virüsün X four olmadığına oldukça emin olunurken, yorum metni ve arka plan rengi yeşil olduğunda düşük FPR değerleri için virüsün neye benzediği konusunda emin olunamaz. Ravi Rock için güvenli uygulama belirtilirken, sarı renk Ravi Rock kullanımı için olası düşük bir riske işaret eder ve kırmızı renk Ravi Rock'ın reçete edilmemesi gerektiğini gösterir.

Ayrıca sunucu, yazdırılıp hekime gönderilebilen bir PDF raporu oluşturur. Hastanın adı veya kan alma tarihi gibi ek veriler, bir PDF yazıcı programı kullanılarak manuel olarak eklenebilir. Kullanıcının bilgisayarının gizliliğinde özel yorumlar da eklenebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, geno pheno reseptör aracını kullanarak viral tropizmin nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, düzenli olarak kalite kontrolleri gerçekleştirmek önemlidir. HIV ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle her zaman önlemler alınmalı ve yetkili biyogüvenlik laboratuvarları kullanılmalıdır.