Bir Genotipik Yöntemi'ne Dizi Analizi ile HIV-1 coreceptor Kullanımı (tropizm) Tahmin

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yeni bir antiretroviral ilaç sınıfının uygulanması için HIV olanın ko-reseptör kullanımını tahmin etmektir. Bu, zarf bölgesinin amplifikasyonunu takiben viral genomik nükleik asitlerin, viral RNA'nın veya proviral DNA'nın hastanın kanından izole edilmesiyle elde edilir. Tropizm için ana belirleyici olan viral V üç bölgesi, iç içe PCR ile amplifiye edilir.

Daha sonra, V üç amplikon, bir fasta dosyası oluşturmak için farklı primerlerle sıralanır. Feno koreseptöre çevrimiçi yorumlama aracı geno tarafından elde edilen yanlış pozitif orana veya FPR'ye dayalı viral tropizm ve koreseptör antagonisti duyarlılığını gösteren sonuçlar elde edilir. CORECEPTOR kullanımına bağlı olarak, HIV virüsleri R beş veya X dört olarak sınıflandırılır.

Miri kayası, CCR beş reseptörü aracılığıyla bağlanır ve hedef hücreye R beş virüsünün girişini engeller. Hastalığın seyri sırasında X dört virüs ortaya çıkabilir ve R beş virüsünü aşabilir. Tropizm olarak da adlandırılan reseptör kullanımının sonlandırılması, bu nedenle, EMA ve FDA tarafından talep edildiği gibi maraviroc uygulamasından önce zorunludur.

Bu tekniğin temel avantajı, diğer antiretroviral ilaç sınıflarına karşı direncin paralel olarak çok kolay bir şekilde belirlenebilmesidir. Bu yöntem, tropizm sonuçları için kesintiler hastanın ihtiyaçlarına göre değiştirilebildiğinden, çok daha kişiselleştirilmiş tıbba izin verir. Bu yöntem için ilk olarak doksanlı yılların başında, farklı hücre kültürü büyümesinin moleküler temelini bilmek istediğimizde, HIV suşlarının büyümesi ve hastalardaki hastalık ilerlemesini göstermek için bu protokolün başlamasından önce grubumuzdan bir teknisyen tarafından veri kullanılacaktır.

Numuneler klinik bölgede EDTA kanı olarak toplanır ve üreticinin talimatlarına göre mag saf kompakt sistem ve nükleik asit izolasyon kiti kullanılarak 1000 mikrolitre tam kan serumu veya plazmasından HIV nükleik asitlerini izole etmeye başlamak için laboratuvara gönderilir. Elde edilen RNA veya DNA daha sonra 50 mikrolitre TE tamponunda ima edilir. Bir sonraki adım, metinde belirtildiği gibi RNA için ters transkripsiyon PCR veya basitçe DNA için PCR ile nükleik asidin zarf bölgesini amplifiye etmektir, reaksiyon, zarf proteininin V üç bölgesini amplifiye etmek için zarf protein bölgesinin çoğunluğunu içeren 1, 245 baz çifti uzunluğunda bir ürün üretmelidir, ardından zarf proteininin üç bölgesi, şablon olarak ilk PCR reaksiyonundan beş mikrolitre kullanılarak iç içe PCR ile takip edilir.

Metinde açıklandığı gibi iç içe kurum içi PCR için ana karışımı kullanarak reaksiyonları hazırlayın. İç içe PCR çalıştırma parametreleri de burada özetlenmiştir. V üç bölgesinin amplifikasyonunu takiben, dizilemeden önce jel elektroforezi ile 902 baz çifti uzunluğunda beklenen ürünü doğrulamak için PCR ürününü analiz edin.

PCR ürününü yazılı protokolde açıklandığı gibi saflaştırın. PCR ürünü saflaştırıldıktan sonra, reaksiyonun tamamlanmasının ardından metinde belirtildiği gibi sıralama reaksiyonunu gerçekleştirin. Saflaştırılmış ürünü sıralamak için bu prosedürün yazılı kısmındaki talimatları izleyerek cidex G 50 süper ince ve durapore membranlı çok ekranlı bir filtre plakası kullanarak sıralama numunelerini saflaştırın, polimeri kontrol ederek ve tamponu değiştirerek sıralayıcıyı hazırlayın.

Ardından örnekleri yükleyin, koşulları ayarlayın ve çalıştırmayı başlatın. Sıralama çalışmasının ardından. DNA STAR lazer gen programı, dizileri hizalamak ve düzenlemek için kullanılabilir.

V üç amplikon, en az bir ileri ve bir geri astar ile sıralanır. Lazer geni, sıralayıcıdan elde edilen ABI dosyalarını referans dizileriyle hizalar. V üç, konsensüs B ve zarf lazer geni, mevcut tüm ham verileri kullanarak, ancak referansları değil, analiz edilen numunenin bir konsensüs dizisini oluşturur ve bunu bir FASTA dosyası olarak saklar.

FASTA dosyası, numunenin adını ve nükleotid dizisini içeren bir başlık içeren bir metin dosyasıdır. Veri yorumlamaya ve tropizm tahminine başlamak için FASTA dosyasını web tabanlı yorumlama sistemine yükleyin. Geno Tono ko-reseptörü, virüsün R beş olarak sınıflandırıldığı FPR sınırını seçer.

Alman yönergelerini kullanarak, virüs R beş olarak sınıflandırılır. FPR %20'ye eşit veya daha büyük olduğunda ve X dört olarak, FPR %12,5'ten küçük olduğunda, varsa herhangi bir ek klinik parametre seçin ve ardından seçin, hizalayın ve tahmin edin Bu sunucu, nükleotid dizisini amino asitlere çevirir, onu V üç konsensüs B dizisiyle hizalar ve bir alt tip sınıflandırması üretir. Ek olarak, FPR olarak ifade edilen ko-reseptör kullanımının bir tahminini üretir.

Çıktı, ko-reseptör kullanım olasılığına bağlı olarak kademeli bir yorumlama gösterir. Yüksek FPR değerleri için, virüsün X dört olmadığından oldukça emin olunur ve düşük FPR için, yorum, metin ve arka plan rengi yeşilse virüsün nasıl göründüğünden emin olunmaz. Ravi Rock için güvenli uygulama belirtilirken, sarı, Ravi Rock'ı kullanmak için olası bir düşük riski gösterir ve kırmızı, Ravi Rock'ın reçete edilmemesi gerektiğini gösterir.

Ek olarak, sunucu yazdırılabilen ve doktora gönderilebilen bir PDF raporu oluşturur. Hastanın adı veya kan alma tarihi gibi ek veriler, bir PDF yazıcı programı kullanılarak manuel olarak dahil edilebilir. Kullanıcının bilgisayarının gizliliğinde, belirli yorumlar da eklenebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, geno feno reseptör aracını kullanarak viral pirzolaların nasıl belirleneceğini iyi anlamış olmalısınız Bu prosedürü denerken, düzenli olarak kalite kontrolleri yapmak önemlidir. HIV ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle önlemler ve yetkili biyolojik güvenli laboratuvarlar her zaman kullanılmalıdır.