Name: Bir Genotipik Yöntemine Dizi Analizi ile HIV-1 coreceptor Kullanımı (tropizm) Tahmin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Öğrenin HIV-1 coreceptor kullanımını dizi analizi ile tahmin etmeyi. V3 bölgesi amplifikasyonu ve geno2pheno aracıyla R5/X4 tropizmi belirlenir. Bu yöntem kişiselleştirilmiş antiretroviral tedavi kararlarını destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Corus, MedSys Hücre Girişi, ZİNCİR ve Resina projeleri finanse edilmektedir.

Protokol Şekil 'de özetlenmiştir. 4. 1. Kan numuneleri <ol><li> Klinik yerinde EDTA tüpleri içinde en azından 3 ml kan toplanır. </li><li> Numuneler 4 ° C'de bir haftaya kadar saklanabilir </li><li> Normal posta ile kısa sürede laboratuvara mümkün EDTA-kan örnekleri gönderin. </li></ol> 2. HIV RNA ve / veya DNA izolasyonu <ol><li> MagNA Pure Compact Nükleik Asit İzolasyon Ben kiti ve MagNA Pure Kompakt Sistem kullanarak, 1000 ul tam kan, serum veya plazma viral RNA ve / veya DNA edinin. </li><li> 50 ul TE tamponunda elde RNA veya DNA Zehir. Alternatif olarak, diğer nükleik asit saflaştırma prosedürleri kullanılabilir. </li></ol> 3. Env bölgenin Amplifikasyon Plazma RNA ya da DNA ya da proviral gelen env bölgesi (Şekil 2 ve 4) yükseltin. Env proteini çoğunluğunu kapsayan bir 1245 bp uzunluğunda bir ürün (nt 6556-7811 accordinHXB2 g) oluşturulur. <ol><li> RNA örnekleri: RT-PCR tepkimesinde <ol><li> Viral RNA'nın RT reaksiyonu engelleyebilir çok karmaşık bir ikincil yapı (Şekil 4) sunuyor. Bu sorunu önlemek için, 10 dakika (önceden PCR tüp içinde ve PCR makine) için 65 ° C 'de 10 ul RNA inkübe edilir ve daha sonra da 50 ° C' ye sıcaklığını düşürmek </li><li> Primerler Env-F ve Env-R içeren PCR ana karışımı 40 ul ekle. -House-Sistemi RT-PCR Master Mix: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> hacim / reaksiyon (ul) </td><td> nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> RNase içermeyen H2O </td><td> 14.4 </td><td></td></tr><tr><td> 5x Buffer (Qiagen OneStep RT-PCR Kit) </td><td> 10 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 5x Q-Çözüm </td><td> 10 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> dNTP Mix (10 mM her biri) </td> &lt;td&gt; 2 <td> Her bir dNTP 400 uM </td></tr><tr><td> Enzim-Mix (Qiagen OneStep RT-PCR Kit) </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Primer Env-F (100 uM) </td><td> 0.3 </td><td> 0.6 uM </td></tr><tr><td> Primer Env-R (100 uM) </td><td> 0.3 </td><td> 0.6 uM </td></tr><tr><td> RNaz İnhibitör (RNasin) </td><td> 1 </td><td> 5 adet / reaksiyon </td></tr></tbody></table> Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(nt 6556 → 6586 HXB2 göre) Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(← 7811 nt 7785) </li><li> 30 dakika için 50 ° C'da RT reaksiyon çalıştırın. </li><li> Aşağıdaki gibi ilk PCR: <table border="1"><tbody><tr><td> 95 ° C, 15 dakika </td><td> 1 x </td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 saniye 50 ° C, 30 saniye 72 ° C, 2 dakika </td> 1 x </tr><tr><td> 95 ° C, 30 saniye 56 ° C, 30 saniye 72 ° C, 2 dakika </td><td> 38 x </td></tr><tr><td> 72 ° C, 10 dak 4 ° C ∞ </td><td></td></tr></tbody></table></li></ol></li><li> DNA örnekleri: PCR reaksiyonu Proviral DNA örnekleri için, başlangıçta herhangi bir RT reaksiyonu tabi ve PCR reaksiyonu doğrudan başlayabilirsiniz. <ol><li> Provial DNA'nın 10 ul PCR Master Mix 40 ul ekleyin. -House-Sistemi PCR Master Mix: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> hacim / reaksiyon (ul) </td><td> nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> RNase içermeyen H2O </td><td> 15.4 </td><td></td></tr><tr><td> 5x Buffer (HotStarTaq DNA Polimeraz) </td><td> 10 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 5x Q-Çözüm </td><td> 10 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> dNTP Mix (10 mM her biri) </td><td> 2 </td><td> Her bir dNTP 400 uM </td></tr><tr><td> Enzim-Mix (HotStarTaq DNA Polimeraz) </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Primer Env-F (100 uM) </td><td> 0.3 </td><td> 0.6 uM </td></tr><tr><td> Primer Env-R (100 uM) </td><td> 0.3 </td><td> 0.6 uM </td></tr></tbody></table> Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(→ 6586 nt 6556) Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(← 7811 nt 7785) </li><li> Daha önce RNA örnekleri (Adım 3.1.4) için tarif edildiği gibi PCR koşulları çalıştırın. </li></ol></li></ol> 4. V3 bölgenin Amplifikasyon: nested PCR <ol><li> Nested PCR için şablon olarak ilk PCR reaksiyonu (agaroz jel önceki analizi olmadan) 5 ul kullanın ve PCR Mas 95 ul ekleyinter karıştırın. İç içe-In-House PCR Master Mix <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> hacim / reaksiyon (ul) </td><td> nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> H2O </td><td> 61.9 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PCR Tamponu </td><td> 10 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 5x Q-Çözüm </td><td> 20 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> dNTP Mix (10 mM her biri) </td><td> 2 </td><td> Her bir dNTP 200 uM </td></tr><tr><td> Primer Env-2F (100 uM) </td><td> 0.3 </td><td> 0.6 uM </td></tr><tr><td> Primer Env-2R (100 uM) </td><td> 0.3 </td><td> 0.6 uM </td></tr><tr><td> HotStarTaq DNA Polimeraz </td><td> 0.5 </td><td> 2,5 ünite / reaksiyon </td></tr></tbody></table> Env-2F: 5'-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3 '(nt 6838 → 6864) <li> Aşağıdaki gibi PCR: <table border="0"><tbody><tr><td> 93 ° C, 15 dakika </td><td> 1 x </td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 saniye 50 ° C, 30 saniye 72 ° C, 90 saniye </td><td> 1 x </td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 saniye 56 ° C, 30 saniye 72 ° C, 90 saniye </td><td> 43 x </td></tr><tr><td> 72 ° C, 10 dak 4 ° C ∞ </td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Bir% 1 agaroz jeli (Şek. 4) PCR ürünü analiz edin. Beklenen ürün 902 bp-uzun. </li><li> Sıralama örnekleri saflaştırılması. <ol><li> Tedarikçi tarafından sağlanan protokolü, çözümler ve mikro-kolon kullanarak Qiagen PCR Arıtma kiti ile PCR ürünü arındırın. Bant yoğunluğuna bağlı olarak, 30-100 ul PE tampon Zehir. </li><li> Alternatif olarak, numune eksonükleaz ile daha da arıtılabilirBen ve Hızlı AP (Termo alkalen fosfataz). Bu amaç için, 15 ul PCR ürünü ile 6 ul Exo-AP karışımı ekleyin ve 37 dakika 15 ° C'de inkübe <table border="1"><tbody><tr><td> 580 ul H 2 O </td></tr><tr><td> 66 ul hızlı AP </td></tr><tr><td> 13.4 ul Exo I </td></tr></tbody></table></li></ol></li></li></ol> 5. V3 Amplikon sekans reaksiyonu <ol><li> Sıra reaksiyon, aşağıdaki primerler yalnızca biri kullanılarak bir PCR reaksiyonu oluşur: Env-2: 5'-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3 (→ 6980 nt 6959) Env-5: 5'-AAAATTCCCCTCCACAATTA - 3 '(nt 7352 ← 7371) Env-6: 5'-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - 3 '(nt 6979 → 7000) Env-7: 5'-TGTCCACTGATGGGAGGGGC - 3 '(nt 7530 ← 7549) Env-10: 5 '- GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC - 3' (nt 7478 ← 7507) Env-11: 5 '- TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC - 3' (nt 7638 ← 7664) İlk tercih primerler şunlardır: Env-2, Env-6 veya Env-7, Env-11 </li><li> Şablon olarak saflaştırılmış V3 Amplikon 1 ul kullanın ve PCR master mix 9 ul ekleyin. Master Mix Sıralama: <table border="1"><tbody><tr><td> 4 ul dizisi karışımı (HIV-Genotiplendirme Takımı) </td></tr><tr><td> 4 ul H 2 O </td></tr><tr><td> 1 ul Astar (100 pmol / ul) </td></tr></tbody></table></li><li> Aşağıdaki gibi dizi tepkime çalıştırın: <table border="0"><tbody><tr><td> 96 ° C, 10 saniye </td><td></td></tr><tr><td> 50 ° C, 10 saniye </td><td> 36 x </td></tr><tr><td> 60 ° C, 45 saniye </td><td></td></tr><tr><td> 4 ° C ∞ </td><td></td></tr></tbody></table></li></ol> 6. Dizi analizi örnekleri saflaştırılması Dizileri USI Purifyng Sephadex G-50 ince. <ol><li> Sephadex G-50 ince olan "sütununda loader" kuyuların uygun sayıda doldurun. Çevirerek filtre plakası MAHVN4510 için Sephadex aktarın. </li><li> Filtre plakası içinde her bir oyuğa 300 ul Milli-Q H2O ekleyin ve en azından 2-8 3h için inkübe ° C </li><li> 910Xg ve 4-15 ° C sıcaklıkta 5 dk için levha santrifüje Flow-through atın. </li><li> Sıra ürün ve sonra şişmiş Sephadex plaka üzerinde pipeti sıra ile 10 ul H2O ekleyin. </li><li> Arıtılmış ürün elde etmek için, 5 dakika boyunca plaka santrifüj. 910Xg ve 4-15 ° C ve akan toplamak. </li></ol> 7. Sequencer ABI Prism 3130 XL saflaştırılmış örnekleri Sıralama <ol><li> Her çalışma öncesinde, tampon değiştirmek ve polimer (POP7) hacmini kontrol edin. Gerekirse, yeni bir ile eski polimer şişeyi değiştirin. </li><li> 18 saniyelik bir enjeksiyon süresi de dahil olmak üzere kaydedilen çalışma koşulları, kullanın. </li><li> Bu makine, 16 dizisi örnekleri ile bir run sinyal verilerinin toplanması yaklaşık 60 dk (36 cm kapiller) veya 150 dakika (50 cm kapiller) alır. </li></ol> 8. Sıra düzenleme <ol><li> Dizileri (Şekil 5) hizalamak ve düzenlemek için program Lasergene (DNA-Yıldız) kullanın. Diğer dizi düzenleme programları da kullanılabilir. Bir "V3-Konsensus B" ve referans olarak env uzlaşma dizisi kullanın. </li><li> Lasergene mevcut ve FASTA dosyası olarak depolamak tüm ham veriler kullanılarak analiz örnek bir konsensüs dizisini oluşturur. FASTA dosya örnek adını ve nükleotid sekansı içeren bir başlık, bir metin dosyası. </li></ol> 9. Veri yorumlama ve tropizm tahmin Dizileme <ol><li> Verileri yorumlama Sıralama web tabanlı yorumlama sistemi tarafından gerçekleştirilir geno2pheno [coreceptor] ( <a href="http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php">http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/</a>index.php). Tropizm tahmin için, farklı FPR ayarlar seçilebilir. Varsayılan ayar Alman-Avusturya tedavisi kurallarına göre yapılır. FPR ≥% 20 için, virüs R5 olarak sınıflandırılır zaman FPR ≥ 20 ve% FPR &lt;% 12.5 için X4. </li><li> Sunucuya FASTA dosya yükleyin. Bu sunucu, amino asitler haline nükleotid sekansı tercüme V3-Konsensüs dizisi B ile hizalanır ve bir alt sınıflandırma üretir. Buna ek olarak, yanlış pozitif oran (FPR) olarak ifade edilir (Şek. 4) coreceptor bir kullanım tahmin oluşturur. </li></ol> 10. Temsilcisi Sonuçlar Geno2pheno [coreceptor] çıkış tropizm bir kademeli yorumunu gösterir. Coreceptor kullanımı olasılığını bağlı olarak yorumlanması metin ve arka plan rengini olası bir, düşük riskli düşündüren ve nihayet kırmızı, sarı, MVC için güvenli bir yönetim düşündüren, yeşil (&lt;% 20 FPR) arasında değişir. Kırmızı öneririz renktirMVC reçete değil ing. Buna ek olarak, sunucu hasta ve örnek veri ile doldurulur basılabilir bir pdf raporu oluşturur ve hekim gönderildi. Geno2pheno [coreceptor] çıkışı örnekleri Şekil tasvir edilmektedir. 6. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil. 1. HIV şematik çoğaltma. Virion reseptörü olarak hücresel CD4 bağlamak gerekir ve coreceptor olarak CCR5 veya CXCR4 birine. Coreceptor CCR5 Maraviroc gibi CCR5 antagonistleri (MVC, Celsentri, Selzentry) ile bloke edilebilir. Viral ve hücresel membran füzyon sonra, viral nükleokapsit sitoplazma içinde serbest bırakılır. Nükleokapsid demonte ve virüs RNA'sının, kompleks sitoplazma içine serbest kalır. Viral ters transkriptaz (RT) sonra çekirdek taşınır ve HIV integraz göre ev sahibi genom içine entegre edilmiştir proviral DNA içine genomik RNA aktarır. Hücresel RNA polimeraz traproviral genomdan viral genomik ve haberci RNA'lar nscribe. Virüs proteinleri sitoplazmada üretilir ve hücre yüzeyine taşınır. Hücreleri olgunlaşmamış bulaşıcı olmayan virionlar gibi virüs partikülleri tomurcuk. HIV proteaz bulaşıcı parçacıklara üreten proteinleri parçalayarak. Adımlardan biri inhibisyonu replikasyon döngüsünün bir ara yol açar. Onlar inhibe ettiği antiretroviral ilaçlar ve çoğaltma adım kırmızı olarak işaretlenmiştir. Viral RNA ve DNA proviral (malzeme tropizm veya direnç analizi için kullanılan) yeşil işaretlenir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2,"> Şekil 2. HIV proviral genom. HIV partikül farklı yapısal proteinleri ve evler viral ve hücresel kaynaklı hem çeşitli enzimler ve proteinler ile inşa edilmiştir. Şekil gösterisiviral genom içerisindeki genin yerini s. Yüzey gp120 ve gp41 viryonunun yüzeyi üzerinde sivri oluşturan ve membran füzyon gerçekleştirmek için insan hücre temas proteinleri. Şeklin alt kısmında, PCR amplifikasyon ürünleri ve protokolünde kullanılan primerler gösterilmiştir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Viral yükü düşük (VL) olan hastaların oranı Köln Viroloji, Üniversitesi (Almanya) Enstitüsü'nde ilaç direnci ya tropizm belirlenmesi için analiz ölçümleri. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4,"> Şekil 4. Deneme Genel şeması .. Lütfen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3264/3264fig4_lg.jpg">buraya tıklayın</a> Bu rakam bir büyük halini görmek için. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5,"> Şekil 5,. Sıra Lasergene ile düzenleme. V3 Amplikon en az bir ileri ve bir geri astar ile sıralı. Lasergene referans sekanslar "V3-Konsensus B" sequencer elde edilen ve env ". Abi" dosyaları alignes. Lasergene tüm satır veri mevcut kullanarak bir uzlaşma dizisi oluşturur. Onlar örnek uzlaşma dizisi katkıda kalmamak referans dizileri (ve daha sonra gri renkli görüntülenir) işaretlenebilir. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6. Geno2pheno tarafından oluşturulan tropizm tahmin raporları [coreceptor] tool.The raporları kaydedilir ve bilgisayarda tamamlanması pdf dosyaları olarak oluşturulur. Ek veriler gibi bize hastanın adı, kan çıkarma tarihi, vb, elle bir pdf yazar program kullanılarak eklenebilir. Özgül yorum da eklenebilir. These veri kullanıcının bilgisayarında değil geno2pheno [coreceptor] sunucusunda özeldir. Lütfen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3264/3264fig6_lg.jpg">buraya tıklayın</a> Bu rakam bir büyük halini görmek için.

<ol><li>Heger, E., Schuelter, E., Klimkait, T., Lengauer, T., Kaiser, R., Walter, H., Sierra, S. European coreceptor proficiency panel test. 9th European Workshop on HIV & Hepatitis Treatment Strategies & Antiviral Drug Resistance, Paphos, Cyprus, , (2011).</li>
<li>Lengauer, T., Sander, O., Sierra, S., Thielen, T., Kaiser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+prediction+of+HIV+coreceptor+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotech%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic prediction of HIV coreceptor usage.</a> Nature Biotech. 25 (12), 1407-1410 (2007).</li>
<li>McGovern, R., Dong, W., Zhong, X., Knapp, D., Thielen, A., Chapman, D., Lewis, M., James, I., Valdez, H., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population-based+Sequencing+of+the+V3-loop+Is+Comparable+to+the+Enhanced+Sensitivity+Trofile+Assay+in+Predicting+Virologic+Response+to+Maraviroc+of+Treatment-na+ve+Patients+in+the+MERIT+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Population-based Sequencing of the V3-loop Is Comparable to the Enhanced Sensitivity Trofile Assay in Predicting Virologic Response to Maraviroc of Treatment-na ve Patients in the MERIT Trial.</a> 17th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, San Francisco, USA, , (2010).</li>
<li>Reuter, S., Braken, P., Jensen, B., Sierra-Aragon, S., Oette, M., Balduin, M., Kaiser, R., Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+in+treatment-experienced+patients+with+HIV-1+infection+-+experience+from+routine+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Med.+Res%22%5BJournal%5D)">Maraviroc in treatment-experienced patients with HIV-1 infection - experience from routine clinical practice.</a> Eur. J. Med. Res. 15 (6), 231-237 (2010).</li>
<li>Recordon-Pinson, P., Soulie, C., Flandre, P., Descamps, D., Lazrek, M., Charpentier, C., Montes, B., Trabaud, M. A., Cottalorda, J., Schneider, V., Morand-Joubert, L., Tamalet, C., Desbois, D., Mace, M., Ferre, V., Vabret, A., Ruffault, A., Pallier, C., Raymond, S., Izopet, J., Reynes, J., Marcelin, A. G., Masquelier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+genotypic+prediction+of+HIV-1+coreceptor+use+versus+a+phenotypic+assay+and+correlation+with+the+virological+response+to+maraviroc%3A+the+ANRS+GenoTropism+study%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the genotypic prediction of HIV-1 coreceptor use versus a phenotypic assay and correlation with the virological response to maraviroc: the ANRS GenoTropism study.</a> Antimicrob. Agents. Chemother. 54 (8), 3335-3340 (2010).</li>
<li>Swenson, L. C., Knapp, D., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+and+accuracy+of+the+geno2pheno+co-receptor+algorithm+for+predicting+HIV+tropism+for+single+and+triplicate+measurements+of+V3+genotype%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Calibration and accuracy of the geno2pheno co-receptor algorithm for predicting HIV tropism for single and triplicate measurements of V3 genotype.</a> 10th International Congress on Drug Therapy in HIV Infection, Glasgow, UK, , (2010).</li>
<li>Macartney, M. J., Cameron, J., Strang, A., García, A., Booth, C., Marshall, N., Johnson, M., Geretti, A. M. Use of a genotypic assay for the prediction of HIV-1 coreceptor tropism and guiding the use of CCR5 antagonists in clinical practice. 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).</li>
<li>Sierra, S., Thielen, A., Reuter, S., Jensen, B., Esser, S., Fätkenheuer, G., Lengauer, T., Pfister, H., Sichtig, N., Kaiser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropism+determination+and+clinical+outcome+of+61+patients+under+MVC+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Tropism determination and clinical outcome of 61 patients under MVC treatment.</a> 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).</li>
<li>Obermeier, M., Carganico, A., Bieniek, B., Schleehauf, D., Dupke, S., Fischer, K., Freiwald, M., Neifer, S., Schuler, C., Mayr, C., Klausen, G., Köppe, S., üünsche, T., Berg, T., Baumgarten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropism+testing+from+proviral+DNA+-+analysis+of+a+subgroup+from+the+Berlin+Maraviroc+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Tropism testing from proviral DNA - analysis of a subgroup from the Berlin Maraviroc cohort.</a> 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).</li>
<li>Vandekerckhove, L. P., Wensing, A. M., Kaiser, R., Brun-Vezinet, F., Clotet, B., De Luca, A., Dressler, S., Garcia, F., Geretti, A. M., Klimkait, T., Korn, K., Masquelier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+guidelines+on+the+clinical+management+of+HIV-1+tropism+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">European guidelines on the clinical management of HIV-1 tropism testing.</a> Lancet Infect Dis. 11 (5), 394-407 (2011).</li>
<li>Walter, H., Eberle, J., Möller, H., Noah, C., Wolf, E., St rmer, M., Braun, P., Krn, K., D umer, M., Berg, T., Obermeier, M., Thielen, A., Kaiser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Empfehlung+zur+Bestimmung+des+HIV-1-Korezeptor-Gebrauchs+%28DAIG+Recommendations+for+the+HIV-1+tropism+testing%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Empfehlung zur Bestimmung des HIV-1-Korezeptor-Gebrauchs (DAIG Recommendations for the HIV-1 tropism testing).</a> , (2011).</li>
<li>Obermeier, M. J., Carganico, A., Dupke, S., Schranz, D., Cordes, C., Freiwald, M., Klausen, G., Köppe, S., Schuler, C., Mayr, C., Schleehauf, D., Berg, T., Krznaric, I., Baumgarten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+genotypic+co-receptor+tropism+testing+from+viral+RNA+and+proviral+DNA%3A+week+24+analysis+of+the+Berlin+maraviroc+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+International+AIDS+Society%22%5BJournal%5D)">Clinical application of genotypic co-receptor tropism testing from viral RNA and proviral DNA: week 24 analysis of the Berlin maraviroc cohort.</a> Journal of the International AIDS Society. 13, Suppl . 4. 129-129 (2010).</li>
<li>Toma, J., Frantzell, A., Hoh, R., Martin, J., Deeks, S., Petropoulos, C., Huang, W. Determining HIV-1 Co-receptor Tropism Using PBMC Proviral DNA Derived from Aviremic Blood Samples. 18th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, San Francisco, USA, , (2010).</li>
</ol>

Bu video makalede ViiV Sağlık ve GlaxoSmithKline tarafından desteklenmektedir.

3-9 klinik deneylerinde gösterildiği gibi V3 sekans, güvenilir bir viral tropizm tahmin sağlar. Aslında, genotipik belirlenmesi mevcut Avrupa ve Alman-Avusturya yönergelere 10 düşünülmektedir. Fenotipik testi ile karşılaştırıldığında, sadece kısa bir devir süresi (dayanıklılık testi için eşdeğer) değil, aynı zamanda maliyeti daha yüksektir. Buna ek olarak, genotipik test önemli bir avantaj sonuçlar FPR olarak sınıflandırılır ve bu yüzden, hastanın ihtiyaçlarına göre uyarlanabilir olmasıdır. Trofile sonuçlar, diğer yandan, sadece R5 veya X4 rapor vardır ve ham verilere erişimi verilmez. Avusturya-Alman esaslarına her bir hastanın ihtiyaçlarına 11 cut-off özel FPR adapte izin verirken, şu anda, Avrupa yönergeleri, 20% 10 bir FPR kesme öneririz. Bu doğrultuda, antiretroviral ilaçlar seçenekleri geniş bir yelpazede, yüksek FPR cut-off (&gt;% 20) olan hastalar için recomm vardırsona erdi. Tersine, sınırlı tedavi seçenekleri ile ağır ön tedavi edilen hastalarda, düşük FPR cut-off (&gt;% 5) kullanılabilir. Tedavisi rehberlik Bu tür şu anda kısmen-aktif ilaçlar azaltılmış tedavi seçenekleri olan hastalar için tedavi dahil edilebilir NRTIs, NNRTI&#39;ler, işlem yönergeleri ve Inis için test direnç ile devam etmektedir. Buna ek olarak, genotipik güdümlü terapi değişiklikleri, artan sayıları ile klinik-ilgili FPR kesilmelerine sürekli bioinformaticians, virologlar ve klinisyenlerin bir panel tarafından ayarlanır edilmektedir. Genotipik tropizm testi diğer önemli bir avantajı çok düşük hatta saptanamayan viral yük (VL) ile klinik örneklerin analiz olasılığıdır. Bu durumda, RNA plazma amplifiable olmadığı zaman, proviral DNA dizilimini edilebilir ve güvenilir 9,12 tahmin etmek için kullanılır. Unutmayın ki, düşük veya belirlenemeyen viral yükü olan hastaların sayısı hızla son yıllarda artmıştır. , T Bugünerofile tahlil sadece VL olan hastalarda &lt;1000 kopya / ml &#39;den, numunelerin analizine izin verir. Ancak, ön çalışmalar proviral DNA ayrıca Trofile 13 tarafından test edilmesi adecuate olabileceğini göstermiştir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> MagNA Pure Compact Nükleik Asit İzolasyon Kiti I </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 04 802 993 001 </td><td></td></tr><tr><td> MagNA Pure Kompakt Sistem </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 03731146001 </td><td></td></tr><tr><td> T3000 termalcycler </td><td> Biometra </td><td> 050-723 </td><td></td></tr><tr><td> One Step RT-PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 210215 </td><td></td></tr><tr><td> HotStarTaq Master Mix Takımı </td><td> Qiagen </td><td> 203445 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick PCR Arıtma Kiti </td><td> Qiagen </td><td> 28106 </td><td></td></tr><tr><td> Ekzonükleaz I (Exo I) </td><td> Fermentas </td><td> EN0582 </td><td></td></tr><tr><td> Termosensitif Alkalin Fosfataz Fastap </td><td> Fermentas </td><td> EF0651 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> BigDye Terminator v3.1 Cycle Dizileme Takımı </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4337457 </td><td></td></tr><tr><td> Sephadex G-50 Superfine </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0041-01 </td><td></td></tr><tr><td> ABI Prism 3130 XL kılcal sıralayıcı </td><td> Applied Biosystems </td><td> 3130XL </td><td></td></tr></tbody></table>

bir genotipik yöntemi&#39;ne dizi analizi ile hiv-1 coreceptor kullanımı (tropizm) tahmin

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) coreceptor antagonistleri sınıfından ilk lisanslı antiretroviral ilaç olduğunu. Bu, insan bağışıklık hücreleri (Şekil 1) enfekte etmek için, HIV suşu çoğunluğu tarafından kullanılan ana bilgisayar coreceptor CCR5, bağlanır. Diğer HIV izolatlarının farklı coreceptor, CXCR4 kullanabilirsiniz. Kullanıldığı reseptör, Env proteini (Şekil 2) tarafından virüs olarak belirlenir. Ikinci coreceptor bağlı olarak, sırasıyla virüs R5 veya X4 olarak sınıflandırılır. MVC inhibe CCR5 reseptör hedef hücre içine R5 virüslerin girişine bağlanır. Hastalığın seyri sırasında, X4 virüsler ortaya ve R5 virüsler büyümek olabilir. EMA ve FDA tarafından talep olarak coreceptor kullanımı (ayrıca tropizm denir) belirlenmesi, bu nedenle önceki MVC idaresi zorunludur. MVC verimliliği MOTİVE, BAŞARI ve 1029 için çalışmalara Bu sophi dayanan yüksek kaliteli bir testtir Monogram, San Francisco, ABD Trofile testi ile yapılmıştırsticated rekombinant testleri. Avrupalı ​​doktorlar değil, aynı zamanda eş zamanlı direnç testleri verin desantralize uzman laboratuarlar ile çalışmak eğilimindedir beri günlük rutin için bu test için kabul, ABD dışında oldukça düşüktür. Bu laboratuvarlar çeşitli kalite güvence değerlendirme 2011 1 sunulmadan sonuncusu uğramıştır. Şimdi birkaç yıl için, HIV env-V3 gen bölgesi (V3), 2 sıra analize dayalı tropizm tespitler gerçekleştirdik. Bu bölge güvenilir bir tahmin yapmak için yeterli bilgi taşır. Kısa ciro süresi (direnç testi eşdeğeri), daha düşük maliyetler, hastaların ihtiyaçlarına sonuçları uyum olasılığı çok düşük hatta saptanamayan viral yük (VL klinik örneklerin analiz olanağı: coreceptor kullanım genotipik belirlenmesi gibi avantajlar sunuyor ), özellikle bu yana VL ile analiz örnek sayısı, &lt;1000 kopya / ml &#39;kabaca (Şekil 3) son yıllarda artmıştır. Tropizm testi için ana adım (Şekil 4) bu video gösterilmiştir: 1. Kan örneği toplanması 2. Plazma ve / veya HIV proviral DNA kan mononükleer hücrelerin HIV RNA&#39;nın izolasyonu 3. Env bölgenin Amplifikasyon 4. V3 bölgenin amplifikasyonu 5. V3 Amplikon sekans reaksiyonu 6. Dizi analizi örnekleri saflaştırılması 7. Saflaştırılmış örnekleri Sekans 8. Sıra düzenleme 9. Veri yorumlama ve tropizm tahmin Dizileme

HIV-1 coreceptor kullanımının tahmin antiretroviral ilaçlara, örneğin coreceptor antagonistlerinin yeni bir sınıfını idaresi için gereklidir. Bu, bir dizi analizi ile yapılabilir<em&gt; Env</emInternet tabanlı bir tercüme sistemi aracılığıyla&gt; gen ve sonraki yorumlanması (geno2pheno<sub&gt; [Coreceptor]</sub&gt;).

Bir Genotipik Yöntemi&#39;ne Dizi Analizi ile HIV-1 coreceptor Kullanımı (tropizm) Tahmin

Maraviroc (MVC), koreseptör antagonistleri sınıfından ruhsatlandırılmış ilk antiretroviral ilaçtır. Konak koreseptörü CCR5'e bağlanır ve bu koreseptör ... tarafından kullanılır.

<a class="grey_button" href="http://www.jove.com/video/4153"> İspanyolca </a>

prediction-hiv-1-coreceptor-usage-tropism-sequence-analysis-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Taç bölgesi yüzeyinde HIV-1 zarf glikoprotein (gp120) farklı V3 döngü dizilerinin yapısal pozisyonları siliko katlama birçok durumda karakterize edilebilir bir state-of-the-art kullanarak döngü 10 ila...

HIV-1 V3 döngü Taç R2 Sıra immünolojik İlgili Dinamik Tersiyer Yapısal Özellikler Değerlendirilmesi Ab initio Katlanır

HIV tropizm viral zarf V3 bölge anlaşılmaktadır. V3 PCR, iç içe geçmiş RT-PCR, sıralı kullanarak üç nüsha olarak amplifiye ve biyoinformatik yazılımı kullanılarak yorumlanır. Örnekleri dizisi G2P puanları düşük olan 1 veya daha fazla (ler) ile non-R5 virüsü olarak sınıflandırılır.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

HIV-1 RNA düzeyi, plazma ve sıralama miktarının tek HIV-1 viral yük saptama sınırının altında (50-75 kopya / ml) bireylerin genomların zordur. Burada özü ve güvenilir bir şekilde HIV-1 RNA 0.3 kopya / ml tedbirler ve çok düşük viral yük örnekleri, tek bir genom sıralama viral genomların yükseltmek için nasıl bir gerçek zamanlı PCR kullanarak plazma viral RNA miktarını nasıl açıklar.

Standart Klinik Tahliller Algılama Sınırı Aşağıda Viral Yükler HIV enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve HIV-1 RNA miktarının

Antiretroviral tedavisi (ART) başarısız HIV-1 enfekte bireyler için ilaç direnci test gelecekteki tedaviler rehberlik ve tedavi sonuçlarını artırabilir. HIV yaygınlığının yüksek ama kaynak sınırlı ayarları optimize bireysel ve nüfus sağlık çıktıları sonuçta uygun fiyatlı ve erişilebilir ilaç direnci genotiplendirmesi ve yorumlama yöntemlerini gerektirir.

Kaynak Sınırlı Ayarlar için uygun bir HIV-1 İlaç Direnci İzleme Yöntemi

HIV-1 patogenezi hem viral özellikler hem de konak genetik faktörleri ile tanımlanır. Burada, gag gen dizisi varyasyonunun virüsün in vitro replikasyon kapasitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için tekrarlanabilir ölçümlere izin veren sağlam bir yöntemi açıklıyoruz.

Bir Kısıtlama Enzim Temelli Klonlama Yöntemi değerlendirin<em&gt; In vitro</em&gt; HIV-1 Tipi C Gag-MJ4 Kimerik Virüslerin Çoğaltma Kapasitesi

Neredeyse izojenik virüsler arasındaki büyüme rekabeti, göreceli replikasyon uygunluğunu belirlemek için hassas bir ölçüm sağlar. Burada açıklanan protokoller, rekombinant HIV-1 klonlarının oluşturulmasını, virüs yayılımını ve büyüme rekabetini ve hassas ve tutarlı sonuçlar elde etmek için optimize edilmiş analiz yöntemlerini içerir.

İnsan İmmün Yetmezlik Virüs çoğaltma Fitness belirlenmesi için İkili Büyüme Rekabet Analizi

Enfekte hücrelerin genomik DNA'sından retroviral entegrasyon bölgelerini amplifiye etmek, amplifiye edilmiş virüs-konak bağlantılarını dizilemek ve daha sonra bu dizileri bir referans genoma eşlemek için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, BEDTools kullanarak çeşitli genomik açıklamalara göre entegrasyon bölgelerinin dağılımını ölçmek için teknikler de açıklıyoruz.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Tam uzunlukta bireysel proviral sıralama (döndürür) amplifikasyon ve sıralama tek, tam uzunlukta (sağlam ve arızalı) HIV-1 proviruses yakınındaki bir verimli ve yüksek işlem hacmi yöntemi sağlar ve potansiyellerini belirlenmesi için izin verir çoğaltma-yetkinlik. DÖNDÜRÜR önceki deneyleri gizli HIV-1 rezervuar sıralamak için tasarlanmış sınırlamalar üstesinden gelir.

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

Burada yeni doğmakta olan 3'-termini tarafsız bir belirlenmesi yanı sıra tek iplikçikli DNA moleküllerinin mutational profilleri sağlar bir derin sıralama yaklaşım mevcut. Ana uygulama doğmakta olan retroviral tamamlayıcı DNA'lar (cDNAs), retroviral Ters transkripsiyon işlemi sırasında oluşturulan ara ürün karakterizasyonudur.

Ters transkripsiyon enfekte hücreleri içinde belirleyici 3'-Termini ve HIV-1 sırasında doğmakta olan tek iplikçikli Viral DNA moleküllerinin dizileri

RNA saç tokaları ve döngüler, sekansa özgü astarların yokluğunda ters transkripsiyon (RT) için astar işlevi görebilir ve üst üste gelen antisense transkriptlerin incelenmesine müdahale eder. İplik spesifik RNA'yı tanımlayabilen bir teknik geliştirdik ve bunu HIV-1 antisense protein ASP'yi incelemek için kullandık.

İplik Spesifik RT-PCR ile Hastalarda İnsan İmmün Yetmezlik Virüs Tip 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transkriptlerinin Saptanması

Öğrenin HIV-1 coreceptor kullanımını dizi analizi ile tahmin etmeyi. V3 bölgesi amplifikasyonu ve geno2pheno aracıyla R5/X4 tropizmi belirlenir. Bu yöntem kişiselleştirilmiş antiretroviral tedavi kararlarını destekler.

Bir Genotipik Yöntemi'ne Dizi Analizi ile HIV-1 coreceptor Kullanımı (tropizm) Tahmin

Daha fazla video keşfet