Görüntüleme Feromon Fare Vomeronasal Akut Doku Dilim Hazırlama içinde Algılama

Bu prosedürün genel amacı, canlı dokudaki alt popülasyonlar ve/veya bireysel nöronlar üzerinde kalsiyum görüntüleme deneyleri yapmak için fare RO burun organının veya VNO'nun akut doku dilimi hazırlığını oluşturmaktır. Bu, önce VNO'nun farenin burnundan çıkarılması ve daha sonra soğuk A BOS'ta bir diseksiyon mikroskobu altında kıkırdaklı kapsülünden mikro diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, izole edilen VNO bir agar bloğuna dikey olarak yerleştirilir ve doku bütünlüğünü doğrulamak için bir mikrotom kullanılarak akut koronal doku dilimleri kesilir.

Konfokal mikroskop altında immünohistokimya sonrası birkaç kesit izlenir. Diğer dilimler kalsiyuma duyarlı bir boya ile yüklenir ve daha sonra varsayılan feromon ligandları ile perfüze edilir ve kalsiyum görüntüleme kullanılarak nöronal aktivasyon gözlenir. Bu yöntem, koku alma alanındaki temel sorunların çözülmesine yardımcı olabilir.

Örneğin, romo nazal organında yüzlerce feromon reseptörü eksprese edilir, ancak bunların çok azı ligandları tanımlamıştır. Feromon reseptörlerinin heterolog bir sistemde ifade edilmesi çok zordur. Belirli bir reseptöre spesifik feromonlar atamak için etkili bir in vivo test geliştirmemiz gerekiyordu.

Belirli bir nöron alt popülasyonunun bilinmeyen reseptörleri eksprese ettiği ve GFP'nin ekspresyonu ile tanımlanabildiği incelikli fareleri kullanabiliriz. Bu testi, prosedürü gösteren Fairmont transdüksiyon kaskadında yer alan iyon kanallarını ve enzimleri farmakolojik olarak araştırmak için de kullanabiliriz. Bugün Julian ve Fabian bir, iki araştırmacı diseksiyona başlamadan önce laboratuvarımdan olacaklar.

Kalsiyum klorür dışındaki tüm malzemeleri birleştirerek taze, soğuk, yapay beyin omurilik sıvısı, oksi karbonhidrat ile doyurulmuş bir BOS hazırlayın. Çözeltiyi doğrudan oksi karbonhidrat ile köpürterek doyurun. Daha sonra kalsiyum klorürü ekleyin ve çift damıtılmış su ile istenen hacme ayarlayın.

A BOS çözeltisini kullanana kadar buz üzerinde tutun. Ötenazi ve yetişkin bir farenin başının kesilmesini takiben, soğuk ve sürekli oksi, karbonatlı A BOS içeren bir Petri kabı hazırlayın. Alt çeneyi çıkardıktan sonra, fare kafasını Petri kabına yerleştirin.

Paleti görselleştirmek için fare kafasını diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Daha sonra mikro makasla damağın üst kısmında yatay olarak bir kesi yapın ve ardından mikro diseksiyon forsepsleri ile damak zarını çıkarın. Açıkta kalan boşluğu A BOS ile nemlendirin ve temizleyin.

Nazal septumun üst ve alt kısmını kesin. Daha sonra VNO'yu içeren nazal septumu nazikçe çıkarın ve doğrudan dikey olarak temiz A BOS'a yerleştirin. Mikro diseksiyon forsepsleri kullanarak VNO'nun iki parçasını ayırın.

VNO'nun kıkırdaklı kapsülünü tanımlayın ve ardından tüm kıkırdaklı parçaların çıkarıldığından emin olarak hassas bir şekilde çıkarın. İzole edilen VNO, kıkırdaklı parçalar ve diseke olmayan VNO, önce burada belirtilir, %3 düşük erime helezonu hazırlanır ve ardından çalışma alanını gerekli aletlerle monte edilir. Gömme kalıbını burgu ile doldurun ve diseke VNO'yu suya batırmadan önce sıcaklığın 41 santigrat derecenin altında olduğundan emin olun. Koronal dilimler elde etmek için dokuyu dikey olarak konumlandırın.

Gömme kalıbını, burgu katılaşana kadar bir dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Bir dakika sonra, burgu bloğunu çıkarın, agarı parametal bir şekle kesin ve daha sonra saniyede 0.5 milimetre hızda, 0.7 milimetre genlikte ve soğukta 100 mikrometre kalınlığında mikrotom kesilmiş koronal VNO dilimlerini kullanarak mikrotom desteğine yapıştırın. Bir CSF.

Doku dilimlerini bir fırça ile toplayın ve toplanan doku dilimlerinin yapısal bütünlüğünü doğrulamak için soğuk bir BOS ile doldurulmuş bir doku kültürü plakasına yerleştirin, böylece sabitlenebilir ve daha sonra hücre iskeleti bileşenleri veya diğer ilgili proteinler için immün boyama yapılabilir. Burada, mor renkteki asetillenmiş tübüline karşı immün boyama, doku diliminin yapısal bütünlüğünü gösterir. Ayrıca, belirli bir feromon reseptörünün GFP tarafından etiketlendiği belirli bir nöronal popülasyonun gözlemlenmesi, korunmuş nöronal morfoloji nöronlarının, küçük oval hücre gövdelerine ve mikrovilluslarla biten lümen yüzeyine ulaşan uzun dendritlere sahip nöronların karanlık bir odada çalışırken gözlemlenebileceğini gösterir.

VNO dilimlerini, bir saat sonra 37 santigrat derecede bir saat boyunca yedi mikromolar URA 2:00 ve% 0.1 onik ile soğuk A CSF yükleme solüsyonunda inkübe edin. Yüklenen dilimleri kullanana kadar oksi karbonatlama ile buz üzerinde tutun. Yüklenen slaytları BOS içeren bir perfüzyon odasına yerleştirmek için bir boya fırçası kullanın ve slaytları bir doku dilimi ankrajı ile sabitleyin.

Perfüzyon odasını bir kalsiyum görüntüleme kurulumunun mikroskop aşamasına yerleştirin ve oda sıcaklığında oksi karbonatlı A BOS ile sürekli perfüze edin. Dört O 2:00 için üç 40 ila üç 80 nanometre olan boyaya karşılık gelen floresan dalga boylarını kullanarak yüklenen VNO dilimlerini gözlemleyin. Hücre içi kalsiyum oranı değişikliklerini kaydetmek için uygun yazılımı kullanın. Kemoterapi stimülasyonunu indüklemek için bir perfüzyon sistemi gereklidir.

Burada, V bir RB iki feromon reseptörünü eksprese eden nöronların alt popülasyonunun aynı zamanda GFP'yi eksprese ettiği bir fareden alınan bir vno dokusunun koronal dilimi, mor ile gösterilen asetillenmiş tübulin proteinine karşı immünoyla boyanmıştır. Dilimin daha yüksek güç görünümleri, doku bütünlüğünün korunduğunu gösterir. Uzun dendritli nöronların lümen yüzeyine ulaştığı gösterilir ve kalsiyum görüntüleme için dendritik topuzlarda ve mikrovilluslarda yapısal proteinin ekspresyonu görülebilir.

FU yüklü doku dilimleri ilk olarak Hoffman faz kontrastı kullanılarak kan damarından başlayarak ilgi alanını bulmak için görüntülenir, ilk beyaz ok, gözlemci yavaşça lümene doğru ilerler, ikinci beyaz ok ve nöro epitel bölgesi. RO nazal nöronunun oval hücre gövdesi. Üçüncü beyaz ok, uzun ve ince dite ile tanımlanabilir.

Lümene uzanan dördüncü beyaz ok, nöronal dendritik topuz. Beşinci beyaz ok, feromonlarla temas halinde mikrovilluslar taşır Burada üç 80 nanometrede gösterilen RA yüklü hücreler daha sonra sırayla üç 40 ve üç 80 nanometrede aydınlatılır ve bu floresan dalga boyu oranı, seçilen nöronlardaki hücre içi kalsiyum değişikliklerine karşılık gelen grefttir, siyah, kırmızı ve mavi daireler. Nöronların canlılığını belirlemek için bir TP kullanılır.

Seçilen üç nöron boyunca sergilenen kalsiyum tepkilerinin aralığına ve iki numaralı kırmızı dairenin bir TP'ye yanıt vermediğine ve bu nedenle daha fazla analizden atılacağına dikkat edin. Kemoterapi stimülasyonu daha sonra hem idrar hem de doku diliminin derinliğine bakan fare feromonlarının bir karışımı kullanılarak elde edilir. Hem GFP'yi hem de V bir RRB iki reseptörünü eksprese eden bir nöron alt popülasyonu lokalize edilebilir.

Burada, hem GFP'yi hem de V bir RB iki reseptörünü eksprese eden bir nöron, V olmayan bir RB iki eksprese eden nöron ile birlikte gösterilmiştir. Her iki hücre de URA 2:00 ile yüklenir ve V bir RB iki eksprese eden nöron, reseptörün ligand ikisinin perfüzyonuna yanıt olarak bir kalsiyum artışı gösterir. İlginç bir şekilde, V olmayan bir RB iki eksprese eden nöron, VNO'daki feromon kaplamanın karmaşıklığını gösteren iki hep olarak bilinen nörona da yanıt verir.

Bu videoyu izledikten sonra, akut doku dilimi hazırlığı yapmak için fareyi mar hücre organı için nasıl çıkaracağınızı ve mikrodiseksiyon yapacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bu protokol aynı zamanda alternatif kalsiyum boyaları ve mikroskop kurulumları kullanılarak fizyolojik inceleme için de uyarlanabilir. Denemenizde iyi şanslar.