Görüntüleme Feromon Fare Vomeronasal Akut Doku Dilim Hazırlama içinde Algılama

Bu prosedürün genel amacı, canlı dokudaki alt popülasyonlar ve/veya bireysel nöronlar üzerinde kalsiyum görüntüleme deneyleri gerçekleştirmek için fare RO nazal organının veya VNO'sunun akut doku kesit hazırlığını oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle VNO'nun farenin burnundan çıkarılması ve ardından bir diseksiyon mikroskobu altında soğuk A CSF içinde kıkırdak kapsülünden mikro diseksiyonla ayrılmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, izole edilen VNO bir agar bloğa dikey olarak yerleştirilir ve doku bütünlüğünü doğrulamak için bir mikrotom kullanılarak akut koronal doku kesitleri alınır.

İmmünohistokimya sonrası birkaç kesit konfokal mikroskop altında incelenir. Diğer kesitler kalsiyuma duyarlı bir boya ile yüklenir ve ardından muhtemel feromon ligandları ile perfüze edilir; nöronal aktivasyon ise kalsiyum görüntüleme kullanılarak gözlemlenir. Bu yöntem, koku alma alanıyla ilgili temel sorunların çözülmesine yardımcı olabilir.

Örneğin, romo nazal organda yüzlerce feromon reseptörü eksprese edilmektedir ancak bunlardan çok azının ligandları tanımlanmıştır. Feromon reseptörlerini heterolog bir sistemde eksprese etmek oldukça zordur. Spesifik feromonları spesifik reseptörlerle eşleştirmek için etkili bir in vivo analiz yöntemi geliştirmemiz gerekiyordu.

Nöronların belirli bir alt popülasyonunun bilinmeyen reseptörler eksprese ettiği ve GFP ekspresyonu ile tanımlanabildiği taktik fareleri kullanabiliriz. Ayrıca bu testi, prosedürü göstererek Fairmont transdüksiyon kaskasında yer alan iyon kanallarını ve enzimleri farmakolojik olarak incelemek için de kullanabiliriz. Bugün, diseksiyon işlemine başlamadan önce laboratuvarımdan iki araştırmacı olan Julian ve Fabian ile birlikte olacağız.

Kalsiyum klorür hariç tüm bileşenleri birleştirerek taze, soğuk, yapay beyin omurilik sıvısı, oxy carb ile doyurulmuş bir CSF hazırlayın. Çözeltiyi, içine doğrudan oxy carb kabarcıkları göndererek doyurun. Ardından kalsiyum klorürü ekleyin ve çift distile su ile istenen hacme tamamlayın.

A CSF çözeltisini kullanıma kadar buz üzerinde tutun. Yetişkin bir farenin ötanazisi ve başının kesilmesinin ardından, soğuk ve sürekli olarak oksijenle karbondioksitle doyurulmuş A CSF içeren bir Petri kabı hazırlayın. Alt çeneyi çıkardıktan sonra, fare başını Petri kabına yerleştirin.

Paleti görselleştirmek için fare başını diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Ardından, mikro makasla damağın üst kısmına yatay bir kesi yapın ve damak membranını mikro diseksiyon pensetiyle çıkarın. Açığa çıkan boşluğu A CSF ile nemlendirin ve temizleyin.

Nazal septumun üst ve alt kısımlarını kesin. Ardından, VNO'yu içeren nazal septumu dikkatlice çıkarın ve doğrudan temiz A CSF içerisine dikey olarak yerleştirin. Mikro diseksiyon pensi kullanarak VNO'nun iki kısmını birbirinden ayırın.

VNO'nun kıkırdak kapsülünü tanımlayın ve ardından tüm kıkırdak parçalarının çıkarıldığından emin olarak kapsülü hassas bir şekilde uzaklaştırın. İzole edilmiş VNO, kıkırdak parçaları ve diseke edilmemiş VNO burada gösterilmektedir; öncelikle %3 düşük erime noktalı agar hazırlayın ve ardından çalışma alanını gerekli araçlarla düzenleyin. Gömme kalıbını agarla doldurun ve diseke edilmiş VNO'yu daldırmadan önce sıcaklığın 41 °C'nin altında olduğundan emin olun. Koronal kesitler elde etmek için dokuyu dikey olarak konumlandırın.

Auger donana kadar gömme kalıbını bir dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Bir dakika sonra, auger bloğunu çıkarın, agarı parametal şeklinde kesin ve ardından mikrotom desteğine yapıştırın; soğuk CSF içerisinde koronal VNO kesitlerini 0,5 milimetre/saniye hızda, 0,7 milimetre genlikte ve 100 mikrometre kalınlıkta mikrotom ile kesin.

Toplanan doku dilimlerinin yapısal bütünlüğünün doğrulanması, fikse edilmesi ve ardındanle hücre iskeleti bileşenleri veya ilgilenilen diğer proteinler için immün boyanması amacıyla, dilimleri bir fırça ile toplayıp soğuk A CSF ile doldurulmuş bir doku kültürü plağına yerleştirin. Burada, mor renkteki asetillenmiş tübüline karşı yapılan immün boyama, doku diliminin yapısal bütünlüğünü göstermektedir. Ayrıca, belirli bir feromon reseptörünün GFP ile işaretlendiği spesifik bir nöronal popülasyonun gözlemlenmesi, korunmuş nöronal morfolojiyi ortaya koymaktadır; karanlık bir odada çalışılarak, küçük oval hücre gövdelerine ve lümen yüzeyine ulaşan, mikrovillilerle sonlanan uzun dendritlere sahip nöronlar gözlemlenebilir.

VNO dilimlerini, 7 µM URA 2:00 AM ve %0,1 onic içeren soğuk A CSF yükleme solüsyonunda 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Yüklenen dilimleri kullanıma kadar buz üzerinde oksikarbonasyon altında tutun. Yüklenmiş dilimleri A CSF içeren bir perfüzyon kamarasına yerleştirmek için bir boya fırçası kullanın ve dilimleri bir doku dilimi sabitleyicisi ile sabitleyin.

Perfüzyon haznesini bir kalsiyum görüntüleme düzeneğinin mikroskop tablasına yerleştirin ve oda sıcaklığındaki oksijenle karbonatlı A CSF ile sürekli olarak perfüze edin. Yüklenmiş VNO kesitlerini, kullanılan boyaya karşılık gelen floresan dalga boyları ile gözlemleyin (Fluo-4 için 400 ila 480 nanometre). Hücre içi kalsiyum oranı değişimlerini kaydetmek için uygun yazılımı kullanın. Kemostimülasyonu başlatmak için bir perfüzyon sistemi gereklidir.

Burada, V1R2 feromon reseptörü eksprese eden nöron alt popülasyonunun aynı zamanda GFP eksprese ettiği bir fareden alınan vno dokusunun koronal kesiti, mor renkte gösterilen asetillenmiş tübülin proteine karşı immün boyanmıştır. Kesitin daha yüksek büyütmeli görünümleri, doku bütünlüğünün korunduğunu göstermektedir. Uzun dendritlere sahip nöronların lümen yüzeyine ulaştığı görülmekte ve yapısal proteinin ekspresyonu, kalsiyum görüntüleme için dendritik nodüllerde ve mikrovillilerde izlenebilmektedir.

FU yüklü doku kesitleri, önce kan damarından (birinci beyaz ok) başlayarak ilgi alanı belirlenmek üzere Hoffman faz kontrastı kullanılarak görselleştirilir; gözlemci yavaşça lümene (ikinci beyaz ok) ve nöroepitelyal bölgeye doğru ilerler. RO burun nöronunun oval hücre gövdesi, uzun ve ince dendritiyle (üçüncü beyaz ok) tanımlanabilir.

Lümene doğru uzanan dördüncü beyaz ok, nöronal dendritik yumruyu göstermektedir. Beşinci beyaz ok, burada 80 nanometre ile gösterilen, feromon RA yüklü hücrelerle temas halindeki mikrovillüsleri belirtmektedir; ardından sırasıyla 40 ve 80 nanometre ile aydınlatılırlar ve bu floresan dalga boyu oranı, seçilen nöronlardaki (siyah, kırmızı ve mavi daireler) hücre içi kalsiyum değişikliklerine karşılık gelir. Nöronların canlılığını belirlemek için ATP kullanılır.

Seçilen üç nöron genelinde sergilenen kalsiyum yanıt aralığını ve iki numaralı nöronun (kırmızı daire) TP'ye yanıt vermediğini, bu nedenle sonraki analizlerden hariç tutulacağını fark edin. Ardından, doku kesitinin derinliğine bakılarak hem idrar hem de fare feromonları karışımı kullanılarak kemostimülasyon gerçekleştirilir. Hem GFP hem de V1RRB2 reseptörünü eksprese eden bir nöron alt popülasyonu lokalize edilebilir.

Burada, hem GFP hem de V1RB2 reseptörü eksprese eden bir nöron, V1RB2 eksprese etmeyen bir nörona eşlik eder halde gösterilmiştir. Her iki hücre de URA-2:00 AM ile yüklenmiştir ve V1RB2 eksprese eden nöron, reseptörün ligandı olan 2-hepnon perfüzyonuna yanıt olarak bir kalsiyum piki göstermektedir. İlginç bir şekilde, V1RB2 eksprese etmeyen nöron da 2-hepnona yanıt vermekte olup, bu durum VNO'daki feromon kodlamasının karmaşıklığını kanıtlamaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, akut doku dilimi hazırlığı gerçekleştirmek amacıyla fareden mar hücre organının nasıl çıkarılacağı ve mikrodiseksiyonunun nasıl yapılacağı konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız. Bu protokol, alternatif kalsiyum boyaları ve mikroskop düzenekleri kullanılarak yapılacak fizyolojik incelemeler için de uygundur. Deneyinizde başarılar dileriz.