Polimer Microspheres ve Fiber-optik Paketler kullanma İnsan Tükürük Protein Analiz için çoklu Floresan Microarray

Bu prosedürün genel amacı, mikroküre bazlı floresan dizileri kullanarak insan tükürük örneklerinde birden fazla proteini analiz etmektir. İlk olarak, mikro küreleri farklı miktarlarda iki floresan boya ile kodlayın. Farklı proteinler için yakalama antikorlarını kodlanmış mikroküreler üzerine birleştirin.

Daha sonra, test tükürük örneklerinde birden fazla protein için birleştirilmiş mikrodiziler testi üzerindeki sandviç immünolojik testleri kullanarak çoğullanmış protein mikrodizisini fiber optik demet üzerinde birleştirin. Sonuç olarak, floresan mikroskobu ile yapılan analiz, tükürük örneklerindeki farklı proteinlerin sinyal tepkilerini ölçebilir. Bu tekniğin Eliza'nınki gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, karmaşık biyosıvılardaki birden fazla proteinin aynı anda analiz edilmesini sağlamasıdır.

Bu yöntem insan tükürük analizi hakkında fikir verebilse de, serum idrarı ve balgam gibi diğer biyo griplere de uygulanabilir. Afyon TTA'yı bir Amber Cam şişede tartın ve tetra hidro Furin'de 200 milimolar bir stok çözeltisi hazırlayın. Pipetleme ile nazikçe karıştırın ve boyanın tamamen çözündüğünü görsel olarak doğrulayın.

Benzer şekilde, pipetleme ile hafifçe karıştırılmış 12 milimolar bir Coumarin 30 stok çözeltisi hazırlayın. Görsel. D'nin mikroküre süspansiyonuna tamamen çözünmüş girdap olduğunu doğrulayın ve ardından 60 mikrolitreyi 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Mikroküreleri yıkamak için, 20 kez pipetleyerek karıştırılmış 600 mikrolitre PBS ekleyin ve üç dakika boyunca 10.000 RPM'de santrifüjleyin.

Tetra hidro furin çözeltisi ile üç yıkamadan sonra, süpernatanı çıkarın, damağı 600 mikrolitre çalışma solüsyonunda yeniden süspanse edin ve karışımı yeni bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Mikro santrifüj tüpünü para film ile kapatın ve bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan koruyun.

Güvenli bir kilit, 1.5 mililitre mikro santrifüj tüpüne 200 mikrolitre kodlanmış mikroküre süspansiyonu ekleyin. Damla damla 150 mikrolitre, taze hazırlanmış bir EDC çözeltisi ekleyin Hemen 150 mikrolitre sülfa NHS çözeltisi ekleyin. Pipetleyerek iyice karıştırın ve süspansiyonun homojen olduğunu doğrulayın.

Tüpü kapatın, paraform ile kapatın ve bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan koruyun. Üç yıkama P-B-S-S-D-S tampon reusundan sonra, peleti 200 mikrolitre P-B-S-S-D-S tampon karışımı içinde askıya alın.

Daha sonra çözeltiyi, 60 mikrogram yakalama antikoru içeren 300 mikrolitre P-B-S-S-D-S tamponuna aktarın. Her tür protein yakalama mikroküreciklerinden 50 mikrolitreyi yeni bir otoklav mikro santrifüj tüpüne karıştırın. Stok mikroküre havuzunu 7.000 RPM'de üç dakika boyunca santrifüjleyin ve 100 mikrolitre süpernatan hariç hepsini çıkarın.

Şimdi fiber optik demetleri yaklaşık beş santimetre uzunluğunda elle kesin, her iki ucunu da elmas alıştırma filmleri kullanarak sırayla parlatın. Daha sonra cilalı demeti deiyonize suda iki dakika boyunca sonikleştirin. Herhangi bir parçacığı çıkarmak için, 0,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne küçük bir manyetik karıştırma çubuğu koyun.

400 mikrolitre protein içermeyen PBS tamponu ekleyin ve manyetik bir karıştırma plakası üzerinde 30 dakika karıştırın. Hava kabarcıklarını çıkarmak için, cilalı elyaf demetinin bir ucunu 0.025 normal hidrojen klorür çözeltisi içinde 150 saniye aşındırın. Kazınmış N'yi hemen bir dakika boyunca deiyonize suya batırın ve sonikleştirin.

Daha sonra elyaf demetlerini basınçlı hava ile kurutun, elyaf demetini bir elyaf tutucuya monte edin ve kazınmış ucu kabarcıksız protein içermeyen PBS tamponunda bir saat boyunca bloke edin, depolanan mikroküre süspansiyonunun bir mikrolitre ALI dörtlüsünü fiber optik demetin kazınmış ucuna bırakın. Alüminyum folyo ile sarılmış bir kutu ile kurulumu ışıktan koruyun. 15 dakika sonra, süspansiyonun hacmi buharlaşma ile azalacak ve mikro küreleri kazınmış mikro kuyucuklara zorlayacaktır.

Mikro kuyucuklarda sıkışıp kalmamış mikro küreleri çıkarmak için numune çözeltisine doyurulmuş bir çubuk kullanın. Protein mikrodizisini kullanıma hazır hale getirmek için, 0,5 mililitrelik bir otoklav mikro santrifüj tüpüne 200 mikrolitre numune çözeltisi ekleyin. Lif üzerine yüklenen protein mikrodizisini çözeltiye batırın ve bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.

Alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan koruyunuz. Daha sonra, protein mikrodizisini 200 mikrolitre yıkama tamponu içeren yeni bir otoklav mikro santrifüj tüpüne batırın ve iki dakika boyunca 600 RPM'de çalkalayın. Şimdi mikrodiziyi, biyotinile edilmiş tespit antikorları ve bir PBS bloke edici tampon içeren 100 mikrolitrelik bir tespit antikor kokteyli çözeltisinde 30 dakika inkübe edin.

Karanlıkta oda sıcaklığında, lif demetinin uzak ucunu mutlak etanol ile doyurulmuş bir çubukla temizleyin. Daha sonra elyafın her iki ucunu basınçlı hava ile kurutun, elyafı bir epi floresan mikroskoba monte edin ve fiberin distal ucundan görüntü alın, afyon TTAC 30 ve SAP floresan emisyon yoğunluklarına karşılık gelen mikroküre görüntülerini elde edin. Yedi mikroküre türünün kodlama görüntüleri burada gösterilmiştir.

UTTA kodlama görüntüsünde, farklı miktarlarda UTTA kalıbı ile kodlanmış mikro küreler anlamına gelen iki yoğunluk seviyesi gözlenir C 30 kodlama görüntüsünde de benzer sonuçlar gözlenir. MATLAB görüntü analizi, sinyal görüntüsündeki farklı mikro kürelerin floresan yoğunluklarının hesaplanmasına izin verir. Kod çözme sonuçları şekil 2D yedi'de gösterilmiştir.

Farklı mikro küreler başarıyla çözülür. Mikroküreler, tahlil tamponu ile inkübe edildiğinde yanıt vermez. İnsan tükürük örnekleri ile inkübe edildiğinde, önemli floresan tepkileri gözlenir.

Daha iyi bir karşılaştırma için, bu iki figürdeki kontrastlar aynı seviyeye ayarlanmıştır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu yöntem insan tükürük örneklerinde farklı proteinlerin tekrarlanabilir analizini sağlar. Aynı numune üzerinde üç bağımsız tespitin sonuçları gösterilir.

Bu videoyu izledikten sonra, mikroküre tabanlı bir multipleks protein mikrorayının nasıl hazırlanacağını ve karmaşık biyo sıvı analizi için nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü takiben. Farklı kompleks biyosıvılardaki diğer protein biyobelirteçleri de analiz edilebilir.