Name: Kortikal Ağları Geliştirme Fonksiyonel Kalsiyum Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: Keşfedin gelişen fare korteks dokusunda fonksiyonel kalsiyum görüntüleme yöntemini. Bu teknik, sinir ağı aktivitesini yüksek uzaysal çözünürlükle ölçmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Laboratuarda çalışmalar RMM için Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO) (917.10.372) tarafından desteklenmektedir. JD AB 7.ÇP BrainTrain programı (bağlı <a href="http://www.brain-train.nl">www.brain-train.nl</a> ). Pieter Laurens-Baljon ve Sabine Schmitz (her ikisi de CNCR, Amsterdam VU Üniversitesi) Biz FP multielectrode dizi video sekansında kullanılan dalga şekilleri ve nöronal kültürlerin görüntüler için teşekkür ederiz.

1. Yatay entorinal hipokampal beyin dilimleri yapma Entorinal-hipokampal beyin dilimleri Canto, Wouterlood &amp; Witter Sinir Plastisite kimliği 381.243 9 (2008) göre, bölgenin 3 boyutlu bir bakış ayrıntılı anatomik kılavuzları, kullanılarak yapılır . <ol><li> Carbogen gaz (% 95 oksijen,% 5 karbon dioksit) ile en az 20 dakika süreyle oksijen, dilim çözüm 500ml olun ve sonra buzlu kadar 250ml dondurma. Dilimleme önce Dakika, ezmek ve diseksiyonu ve dilimleme odasında kesmek için kullanılacak kalan 250ml köpüren dilim çözüm dilim buz karışımı. </li><li> R-ACSF 200ml (kurtarma ACSF) ve e-ACSF (deneysel ACSF) çözümü en az 500ml olun. Carbogen gaz (% 95 oksijen,% 5 karbon dioksit) ile en az 20 dakika önce doku hazırlanması için sürekli oksijen hem de çözümler. </li><li> Bu protokol, 3 hafta eski bir maksimum 0 doğum sonrası günden itibaren fareler için geçerlidir. Anima başını kesmekl, yerel etik kurul prosedürlere göre, yukarıdaki Adım 1 hazırlanan buz dilim çözüm içeren bir Petri kabındaki hızlı bir şekilde beyin teşrih (çözümleri ve reaktifler için bkz. Tablo 1 ). </li><li> Dilim çözümü ile ıslatılmış bir filtre kağıdı üzerine beyin transferi ve keskin bir jilet ile iki yarımküresinin ayrı. Bir yarımkürede buz dilim çözüm içine aktarın. </li><li> Diğer yarımkürenin beyincik çıkarın. Beyin, orta hat üzerine Flip ve rostral sonuna doğru hafif bir açı ile beynin üst kesilir. </li><li> Ters dilimleyiciyi doku tutucu üzerine kesme (dorsal) yüzey ve yapıştırıcı bu pamuklu bir çubukla hafifçe iterek üzerine beyin çevirin. </li><li> Adım 1 kalan buz soğuk dilim çözüm düşük bir frekans ve hızı kullanarak Dilim 300 mikron kalınlığında beyin dilimleri. Koşullar altında, 0.05 mm / s ve 36Hz ayarlarını az bir Thermo Fisher Scientific vibratome (Microm, HM 650V) kullanın. </li><li> Gibioda sıcaklığında, en kısa sürede bir dilim, oksijenli Yapay Cerebro Omurilik Sıvısı (ACSF) (bkz. Tablo 2 2.5mm Mg 2 +, 1,6 Ca 2 +) içeren bir dilim tutucu (batık) transfer R-ACSF yüksek magnezyum konsantrasyonu dilimleme ve deneyimlerimiz aşağıdaki NMDA reseptörleri üzerinden nöronların içine kalsiyum akışı azaltır, deneyler için daha kaliteli bir dilim açar. Gerekirse, daha sonra ikinci serebral hemisferin kesti. </li><li> Kurtarmak için bir saat dilimleri bırakın. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Dilim çözeltisi (mM) - 10 </td></tr><tr><td> 110 </td><td> kolin klorür </td></tr><tr><td> 25 </td><td> NaHCO 3 </td></tr><tr><td> 11,6 </td><td> 11,6 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> D-glukoz </td></tr><tr><td> 7 </td><td> MgCl 2 </td></tr><tr><td> 3,1 </td><td> sodiumpyruvate </td></tr><tr><td> 2,5 </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 1,25 </td><td> NaH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 0,5 </td><td> CaCl 2 </td></tr></tbody></table> Tablo 1 dilim çözümü için Reçete. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> ACSF (mM) </td></tr><tr><td> 125 </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 26 </td><td> NaHCO 3 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> D-glukoz </td></tr><tr><td> 3 </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 2.5/1.5 </td><td> MgCl 2 (kurtarma / deney) </td></tr><tr><td> 1,6 </td><td> CaCl 2 </td></tr><tr><td> 1,25 </td><td> NaH 2 PO 4 </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Tarif için hem de kurtarma (r-ACSF) ve deneysel (e-ACSF) çözümü. 2. Boyama ch hazırlanmasıkehribar Hücrelerin kalsiyum-bağımlı bir göstergesi ya da hücre-spesifik bir işaretleyici ile yüklemek için, dilimler, boyama işlemi için bir oda transfer edilmesi gerekir. Ticari odaları mevcut olsa da, bir çok az maliyet için kolayca standart laboratuar ekipmanları monte edilebilir. Böyle bir odasının temel özellikleri dilim 30 ve 35 arasında kaynaştı olduğunu ° C, sürekli oksijenli bir ortamda inkübe ve odanın ışık korumalıdır. <ol><li> Isıtılmış bir çubuk kullanarak, sadece silikon hortumun bir bölümü (çapı yaklaşık 1.5mm) geçmesine izin için yeterince büyük iki tek polistiren petri kutularının yan duvar (35 ve 100 mm çaplı) küçük bir delik olun. </li><li> Konu silikon küçük petri delikten borular ve küçük bir çanak iç duvarına içinde bir döngü oluşturur. </li><li> Hortumun açık ucunu mühür ve petri iç duvara geri kalanı boru sopa superglue kullanın. </li> Ince bir iğne kullanarak, iç petri içinde tüp eşit aralıklı aralıklarla delikler. <li> Yapıştırıcı hizalanmış iki delikli büyük içinde küçük petri,. Büyük petri duvardaki delikten silikon hortumun diğer ucunu geçirin. </li><li> Arayüz çanak için, hücre kültürü, yarı geçirgen bir zar ile de eklemek alabilir ve ısıtılmış bir neşter kullanılarak, inkübasyon sırasında dilim tutmak için sığ bir çanak terk üst 1cm uzakta kesti. </li><li> Büyük petri kapağı, bir delik yaklaşık olun. 0.5-1cm çaplı carbogen (% 95 O 2,% 5 CO 2) odasına akışına izin vermek için. </li><li> 5 veya 10 ml'lik plastik şırınga alın. Isıtılmış bir neşter kullanarak, şırınga sonuna kaldırmak ve şırınga tüpün ucu ile birkaç cm uzunluğunda tutmak için açılı kesim yapmak. Superglue kullanarak, 0.5-1 cm çapında delik üzerine, petri kapağını şırınga tüp kesme yüzeyi eklemek. </li><li> Silikon tüp ve takınşırınga ucu bağlantısı ubing. Petri kutularının temel giren silikon tüp için bir başka boru konnektörü takın. </li><li> Carbogen (% 95 O 2,% 5 CO 2) tedariki için bir regülatör hem de tüpleri bağlayın. Inkübasyon 30-35 arasında sıcak bir plaka boyama odasına ° C yerleştirin Odanın tüm kuluçka işlemi sırasında ışıktan korumalı olabilir emin olun. Boyama odasına şimdi montaj ve dilim de kuluçka alanı olarak kullanmak için hazır. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3550/3550methodologyfig1.jpg" alt="Metodoloji, Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Metodoloji, Şekil 1"> Metodoloji Şekil 1 dilim inkübasyon (üstte) ve kalsiyum hassas göstergesi (aşağıya yeşil boya, pipetle) uygulaması gösteren boyama odasının kesiti. 3. Dilimleri boyanması Floresan boyalar içeren herhangi bir taşıma boyunca, az ışık ile çalışma photobleaching önlemek ve boya ve t tutmaktaşıma arasındaki karanlık doku boyandı. <ol><li> Boyama odası, bir ısı plakası (35 ° C) koyun, bir carbogen gaz tedarik bağlamak ve dilim sahibinden yaklaşık 1.5ml r-ACSF ile doldurun. </li><li> Boyama odasında arayüz tabağına yerleştirin ve 1 ml ACSF ile doldurun. </li><li> ACSF köpüren yumuşak, sabit bir hızda tutmak için boyama odasında iyi bir carbogen layın. </li><li> Bir şişe içine 50 mg Fura 2-AM 9 ul DMSO ve 1 ul pluronic asit (% 20 DMSO stok solüsyonu, Invitrogen) ekleyin. Vortex 15 dakika boyunca boya karışımı. </li><li> Dilimleri arayüzü çanak içine aktarın ve 50mm nihai boya konsantrasyonu elde Metodoloji Şekil 1 (yukarıda) belirtildiği gibi ilgi, hipokampus ve entorhinal korteks bölgesi üzerinde, doğrudan r-ACSF içine boya pipetle. </li><li> Boyama odanın kapağını kapatın ve 20 dakika boyunca boya hayvanın yaşına göre (bkz. Tablo 3) 40 dakika inkübe edin. </li><li> Transiçine dilim dilim sahibinin ferin. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Yaş (doğum sonrası gün) </td><td> İnkübasyon süresi (dk) </td></tr><tr><td> &lt;P8 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> p8-p9 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> p10-p11 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> p12-13 </td><td> 35 </td></tr><tr><td> &gt; P13 </td><td> 40 </td></tr></tbody></table> Tablo 3 farklı yaş grubu için Kuluçka süreleri, laboratuvarda deneysel olarak belirlenir. 4. Diğer boyalar ve eski doku Belki de beyin dokusunda artan miyelinasyonun nedeniyle, büyük kemirgenler dilimleri Fura sürebilir yok o kadar kolay ester 2-AM. Cremophor EL (Sigma) kullanarak preinkübasyon adım P13 ve 11 yaşlı farelerin beyinleri için kullanılan bu boya alımını kolaylaştırmak için. Cremophor birçok ecza bir yardımcı madde olarak kullanılan bir non-iyonik yüzeyal uygulamaları. Bu adım olmadan, hücre spesifik etiketleme kortikal dilim boyunca son derece kötü ve tutarsız olduğunu bulabilirsiniz. <ol><li> 3ml r-ACSF ve 8, 35 ° C'de 3 dakika ısıtılmış ul% 0.5 cremophor (Sigma) ile dolu sığ bir preinkübasyon çanak eski dilim aktarın. </li><li> Dilim arayüzü çanak içine aktarın ve normal boyama prosedürünü takip (4-7 Adımlar, yukarıya bakınız). </li></ol> Kalsiyum boyalar dilim hazırlık nöronlar ve olmayan nöronlar hem de yük. Belirlemek ve ağ içinde bu hücre tipleri arasında ayrım sulforhodamine 101 (SR101) dilim içinde etiket astrositler kullanılan olabilir. Sulforhodamine 101 dilim boyanması (Bölüm 3) daha önce olduğu gibi, 1-3 arasındaki adımları izleyin. 1 ul sulforhodamine (Sigma) -20 ° C'de depolama 10mM stok solüsyonu ve 10 mcM bir çözüm sağlamak için 999 ul r-ACSF çözülür. Mor boya ov Pipeter dilim daha önce olduğu gibi (5-7), 15 dakikalık bir süre için kuluçka dilim bırakarak. Mikroglia ve endotel hücreleri FITC domates lektin boya etiketli. Daha önce olduğu gibi, 1-3 arasındaki adımları izleyin. 25 ul 2mg/ml Lycopersicon esculentum (domates) lektin FITC konjuge (L0401, Sigma) stok solüsyonu 20 mg / ml konsantrasyonu vermek için 2.5ml r-ACSF içine atın. (Adım 5-7) daha önce olduğu gibi dilimleri üzerinde boya Pipet bırakarak, 45 dakikalık bir süre için kuluçka dilim. Not: Bu boya Fura 2-AM veya Oregon Yeşil BAPTA-1 hem de boyalar fotonlar beri spektrumun yeşil alanda floresan (ÖGB-1) yayılan olacak gibi kalsiyum duyarlı bir göstergesi ile kombine etmek mümkün değildir çakışan dalga boylarında. Ancak, wit birleştirmek için, uygun filtreler veya Texas-Kırmızı lektin konjugatları ile birlikte kullanılmış olabilir, Kalsiyum, turuncu, Fura Kırmızı gibi diğer kalsiyum göstergesi boyalar vardıryeşil spektrum h kalsiyum göstergesi boyalar. 5. Kayıt odasına dilim takılması Sırasında görüntüleme dilim mikroskop altında kararlı olması gerekir. Genellikle bir metal arp doku basılı tutun yerleştirilir ama dengesiz odak görüntüleme için görüş alanında sadece bir bölümünü vererek, dilim yüzeyi bozabilir. Bunu önlemek için, dilim Polyethylenimine (PEI) kullanarak kayıt odasına sıkışmış. <ol><li> PEI solüsyonu (250ml borik tampon (Tablo 4) 1ml polietilenimin çözüm) hazırlayın. PEI (bir gecede heyecan), tamamen eriyene emin olun. </li><li> PEI çözüm dilim uygulamak istiyorsanız önce en az bir saat altındaki sıvı ile kaplıdır, böylece kayıt odaları doldurun </li><li> Distile su ile ve sonra holding odasından r-ACSF ile kayıt odalarına yıkayın. </li><li> Bir kayıt odasının içine bir dilim aktarın. </li><li> R-ACSF bir pipet ve pozisyon sl kaldırınBir fırça yardımıyla ortasında buz. </li><li> Filterpaper parçaları kullanarak dilim etrafında r-ACSF çıkarın. Istikrar ve bağlılık için, artık dilim etrafında hiçbir ACSF olduğunu önemlidir. </li><li> Pipet yaklaşık 0.5-1ml ACSF, dilim üzerine, kayıt odasının boyutuna bağlı. ACSF sadece dilim yüzeyini kaplayan gerekir. </li><li> Carbogen ile perfüze büyük nemlendirilmiş bir arayüz konteyner, dilim ile kayıt odasına koyun ve en az bir saat dilimleri kurtarmanızı sağlar. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> PEI çözümü </td></tr><tr><td> 1ml </td><td> Poli (ethyleneimine) çözümü </td></tr><tr><td> 250ml borik tampon </td><td></td></tr><tr><td> 40mm </td><td> asit borik </td></tr><tr><td> 10mM </td><td> sodyum tetraborat dekahidrat </td></tr></tbody></table> Tablo 4: Reçete PEI çözüm. 6. Imyaşlanma Kalsiyum bağımlı göstergesi boyalar tek veya iki foton mikroskopi kullanılarak görüntülenebilir. Iki foton görüntüleme kullanın böylece dokuda ışık saçılımı miktarını azaltarak, faiz bölgenin odak hacmi içinde sadece gösterge boya harekete geçirir. Ayrıca, bu dilim içine ışık daha derinlemesine nüfuz sağlar. Fonksiyonel kalsiyum görüntüleme için 20x objektif (NA 0.95) ve LaVision Biotec bir Trimscope sistemi, bir mikroskop Tutarlı birleştiğinde tarafından sağlanan bir Titanyum safir lazer kullanır. Trimscope sistemi aynı anda 64 küçük ışın tarama çerçeve sağlar ve bir kare hızlı tarama oranları için Hamamatsu C9100 EM-CCD kamera ile birleştirilmiştir. <ol><li> Mikroskop altında kayıt odasına yerleştirin ve daha fizyolojik bir sıcaklık minimum 30 ° C'ye kadar ısıtılır görüntüleme, e-ACSF (1.6 Ca 2 + / 1.5 Mg 2 + oranı (tablo 2)) ile istikrarlı bir perfüzyon kurmak </li><li> Focbizi bölgeye beyaz ışık aydınlatması ile faiz getirisi (ROI). Dilim gerekli olandan daha uzun süre ışığa maruz bırakmayın. </li><li> Dalga boyu, görüş görüntüleme alanında, tarama frekansı, piksel yoğunluğu ölçmek için istediğiniz doku ve biyolojik sinyaller için ek yazılım seçenekleri seçin. Fura ile kalsiyum ağ görüntüleme için 2-AM biz genellikle 820nm dalga boyu, 250x250 mikron görüntüleme alanında bir görüş, bir linescanning 1200Hz sıklığı ve 2-by-2 binning seçin. Bu sonuç bir frametime dolayısıyla yaklaşık 100ms ve 10Hz ile ilgili bir görüntüleme frekansı. </li><li> YG'nizi sürekli bir tarama modu ve laserlight seçilen dalga boyu kullanarak odak olup olmadığını kontrol edin. Görüntünün piksel doygunluk ve ağartma önlemek için odak ve lazer yoğunluğunu ayarlayın. </li><li> YG'nizi bir timelapse film yapın. Biz tipik olarak 2000 kare her iki timelapse filmleri kazanır. </li><li> Hücre algılama ve tanımlama için, 1 mikron stepSize ile görüntüleme z-yığını e + / 20, odak görüntülü düzlemi etrafında mikron. </li></ol> 7. Temsilcisi sonuçları Başarılı yükleme, kalsiyum göstergeler Fura 2-AM multiphoton görüntüleme kullanarak neokortikal ve entorhinal korteks ağları geliştirmek Şekil 1'de gösterilmiştir. Bazı boya doku değil hücre soma ve bazı durumlarda arka plan boyama olarak hala mevcut, proksimal dendritler açıkça görünür ve neuropil çevreleyen ayrı. Yükleme başarılı olmamışsa, çok az hücre spesifik boyanması gözlenen ve boya lekeleri küçük kümeleri genellikle ölü membran enkaz dilim yüzeyinde görülebilir. Bu ekran, hücre ağı, eş zamanlı olarak hücre görüntüleme için odak tek bir düzlemde açıkça görülebilir. Metal bir arp veya kayıt odasına dilim eksik yapışmasını kullanımı görüntülü, pürüzlü bir dilim yüzeye neden olabilir. 550fig1.jpg "alt =" Şekil 1 "/&gt; Şekil 1. Fura 2-AM ester yüklenmiş neokortikal gelişmekte olan (A, sol) ve (B, sağ) entorinal ağları Ölçek bar 100 mikron. Astrositler gelen nöronlar ayırmak için, sulforhodamine 101 Fura ile ortak uygulama 2-AM ester ağ içindeki hücre tiplerinin ayrımı sağlar. <img src="/files/ftp_upload/3550/3550fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Sulforhodamine 101 ile astrosit etiketleme. Fura 2-AM ester ve sulforhodamine 101 Co-etiketleme. Dalgaboyu 820nm. Bir nöron (üstte) ve astrosit (aşağıda) dalga boyu ayrılması için 560/70nm dikroik ayna ile Proje Yönetim Ekipleri Görüntü toplama B Temsilcisi floresan izleri. Ölçek bar 60 sn, mesafe kadar taşınmış 10 (au fluo). <img src="/files/ftp_upload/3550/3550fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. FITC-konjuge Lycopersicon esculentum (domates) lektin boyama Fare hipokampus (A) ve yüzeysel entorhinal korteks (B) gelişmekte olan mikroglia ve endotel hücreleri Etiketleme. Kalsiyum göstergesi boyalar, gelişmekte olan kortikal ve hipokampal ağlar aynı anda birden fazla hücrelerden faaliyet okumak için kullanılır. Şekil 4. Hipokampal ve kortikal ağları Dinamik kalsiyum transientler. Film 1: Fura 2-ikinci postnatal haftasında fare entorhinal korteks ester yükleme. <a href="/files/ftp_upload/3550/3550movie1.avi">Film 1 görmek için buraya tıklayın.</a> Movie 2: Fura 2-doğum sonrası ilk haftasında fare hipokampus ester yükleme. <a href="/files/ftp_upload/3550/3550movie2.avi">Film 2 görmek için buraya tıklayın.</a> Film 3: doğum sonrası ilk haftasında fare korteksin Fluo-4 yükleme. 50movie3.avi "&gt; 3 film izlemek için buraya tıklayın. Fura durumunda 2-AM, kalsiyum depolarizasyon indüklenen akını içeren ester, hücre aktivasyonu, boya floresan azalır. Fluo-4 gibi boyalar için, bunun tam tersi doğrudur ve hücre depolarizasyon foton emisyon artış olarak görülmektedir. Somatik kalsiyum transientler ağırlıklı olarak ölçülür ama daha çok proksimal dendritler faaliyet Movie 2 gösterildiği gibi, bazı hazırlıklar olabilir. Salt ağ etkinliği, ticari ya da in-house yazılım komut dosyalarını kullanarak belirlenebilir. Laboratuarı, hücre tanımlama ve ağ etkinliği ölçülür ve Matlab (Mathworks) in-house kodu kullanarak yarı otomatik bir şekilde analiz edilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/3550/3550fig5.jpg" alt="Şekil" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil"> Şekil 5. Tek bir nöronun 3D gösterimi (gelişmekte olan kortikal ağ senkronize kalsiyum transientler Temsilcisi analizi . (B) z-yığını otomatik nöron tespiti için bir nöron maske otomatik olarak oluşturmak için kullanılmaktadır. Kalsiyum transientler ölçümleri, tek bir nöron veri (C) okunabilir aktif hücrelerinin genlik, frekans ve # içerir . Farklı izleri arasında senkronize bir raster arsa (D) kullanılarak görüntülenebilir.

<ol><li>Katz, L. C., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+and+the+construction+of+cortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity and the construction of cortical circuits.</a> Science. 274, 1133-1138 (1996).</li>
<li>Khazipov, R., Luhmann, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+patterns+of+electrical+activity+in+the+developing+cerebral+cortex+of+humans+and+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Early patterns of electrical activity in the developing cerebral cortex of humans and rodents.</a> Trends in Neurosciences. 29, 414-418 (2006).</li>
<li>Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activity+in+early+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical activity in early neuronal development.</a> Nature. 444, 707-712 (2006).</li>
<li>Adelsberger, H., Garaschuk, O., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+calcium+waves+in+resting+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical calcium waves in resting newborn mice.</a> Nat. Neurosci. 8, 988-990 (2005).</li>
<li>Garaschuk, O., Linn, J., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+oscillatory+calcium+waves+in+the+immature+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale oscillatory calcium waves in the immature cortex.</a> Nat. Neurosci. 3, 452-459 (2000).</li>
<li>Lamblin, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroencephalography+of+the+premature+and+term+newborn.+Maturational+aspects+and+glossary%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophysiol.+Clin%22%5BJournal%5D)">Electroencephalography of the premature and term newborn. Maturational aspects and glossary.</a> Neurophysiol. Clin. 29, 123-219 (1999).</li>
<li>Rakic, P., Komuro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+receptor%2Fchannel+activity+in+neuronal+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The role of receptor/channel activity in neuronal cell migration.</a> J. Neurobiol. 26, 299-315 (1995).</li>
<li>Spitzer, N. C., Root, C. M., Borodinsky, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+neuronal+differentiation%3A+patterns+of+Ca2%2B+spikes+specify+transmitter+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Orchestrating neuronal differentiation: patterns of Ca2+ spikes specify transmitter choice.</a> Trends. Neurosci. 27, 415-421 (2004).</li>
<li>Canto, C. B., Wouterlood, F. G., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+the+anatomical+organization+of+the+entorhinal+cortex+tell+us%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Plast%22%5BJournal%5D)">What does the anatomical organization of the entorhinal cortex tell us.</a> Neural. Plast. , 381243-381243 (2008).</li>
<li>Bureau, I., Shepherd, G. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+development+of+functional+and+anatomical+columns+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Precise development of functional and anatomical columns in the neocortex.</a> Neuron. 42, 789-801 (2004).</li>
<li>Ikegaya, Y., Le Bon-Jego, M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+imaging+of+cortical+network+activity+with+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Large-scale imaging of cortical network activity with calcium indicators.</a> Neuroscience research. 52, 132-138 (2005).</li>
</ol>

LaVision Biotec GmBH (Bielefeld, Almanya) Bu yazının makale gönderme ücreti sponsor oldu.

Fare ve sıçan beyin kortikal ve hipokampal ağların geliştirilmesi içinde tanımlanabilir hücreler ağ dinamikleri kalsiyum görüntüleme için uygun protokoller burada göstermek yöntemleri. Bu yöntemler aynı zamanda hücre somas suprathreshold aktivitesi ölçümü için bir yerel ağ görselleştirmek için en iyi uzaysal çözünürlüğü sağlar. Gürültü ölçümleri, genellikle gelişmekte olan sinir sistemi uzun süre suprathreshold olaylar, ağ etkinliği Zamansal çözünürlük çerçeve satın alma CCD kamera ayarları bağlı olarak, sinyal optimize etmek için, çeşitli olabilir. Bu protokoller, gelişmekte olan sinir sistemi boyunca hipokampal ve kortikal ağları değil, aynı zamanda etiket hücreleri sınırlı değildir. Bu yöntemin sınırlama sadece suprathreshold faaliyet kaydedilebilir.

kortikal ağları geliştirme fonksiyonel kalsiyum görüntüleme

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Sinir sistemleri gelişmekte olan faaliyet damgasını deseni kendiliğinden, senkronize ağ etkinliği. Senkronize aktivite, sağlam, spinal kord, beyin, retina, korteks ve ayrışmış nöronal kültür hazırlıkları görülmüştür. Spontan aktivite dönemlerinde, birçok iyon kanallarını aktive eden, tek ya da aksiyon potansiyelleri patlamaları yangın nöronlar depolarize. Depolarizasyon kalsiyum girişini arabuluculuk dendritler ve dikenler voltaj kapılı kalsiyum kanalları harekete geçirir. Yüksek senkronize elektriksel aktivite alanında elektrotlar kullanarak yerel nöronal ağlardan ölçülmüştür. Bu teknik bir elektrot okuma birden fazla nöron entegre nedeniyle yüksek zamansal örnekleme oranları ancak daha düşük uzaysal çözünürlüğü sağlar. Tek hücre çözünürlük nöronal aktivitenin faaliyet ateş ölçmek için tek nöron patch-kelepçe elektrofizyoloji kullanarak mümkündür. Ancak, ölçmek için bir ağ yeteneği, nöron yamalı s sayısı ile sınırlıdırimultaneously ve tipik olarak sadece bir ya da iki nöron. Kalsiyum-bağımlı floresan gösterge boyaların kullanımı hücrelerden oluşan bir ağ üzerinden senkronize aktivitesi ölçümü sağladı. Bu teknik, gelişmekte olan ağ spontan aktivite kayıt için yüksek uzaysal çözünürlüğü ve yeterli zamansal örnekleme verir. Öncesi ve erken doğum sonrası gelişimi sırasında yeni oluşum kortikal ve hipokampal ağları önemli bir özelliği de, nöronal aktivitenin senkronize (Khaziphov &amp; Luhmann&#39;ın, 2006 Katz &amp; Shatz, 1996), spontan. Bu korelasyon ağ aktivite, fonksiyonel devreleri nesil (Spitzer, 2006) gelişmekte olan sinir sistemi için gerekli olduğuna inanılmaktadır. Primat ve kemirgen beyin hem de, erken, elektrik ve kalsiyum ağ dalgaları gözlenir pre-ve postnatal in vivo ve in vitro (Adelsberger ve ark, 2005; Garaschuk ve ark, 2000;. Lamblin ve ark, 1999). Birkaç kontrol etmek için bilinen bu ilk çalışma, desen,nöronal farklılaşma, sinaptogenez ve plastisite (Rakic ​​&amp; Komuro, 1995, Spitzer ve ark, 2004) de dahil olmak üzere gelişimsel süreçleri kortikal devre doğru gelişmesi ve olgunlaşması için kritik öneme sahiptir. Bu jove video, kortikal ağları geliştirmek görüntü spontan aktivite için kullanılan yöntemler göstermektedir. Intrasellüler esteraz aktivitesi parçalayarak hücre zarından gibi Fura Kalsiyum duyarlı göstergeler, 2-AM ester diffüz gösterge boya hücre geçirgenliği olmayan formu terk esterleri AM. Göstergesi laktobionat formu sonra algılar ve intraselüler kalsiyum iyonları bağlamak mümkün karboksilik asit grupları .. Kalsiyum duyarlı boya floresan geçici kalsiyum bağlayıcı üzerine değişir. Tek veya çoklu foton görüntüleme teknikleri boya yayılan fotonlar değişimi ölçmek için kullanılır ve böylece hücre içi kalsiyum bir değişiklik gösterir. Ayrıca, bu kalsiyum-dependent göstergeleri aktif ağ içindeki hücre türlerini araştırmak için diğer floresan işaretleri ile kombine edilebilir.

Nöron ağları geliştirme spontan aktivite, kalsiyum duyarlı göstergesi boyalar AM ester formları kullanarak ölçülebilir. Nöronal aktivasyon gösteren hücre içi kalsiyum değişiklikler, bir veya iki foton görüntüleme göstergesi floresan geçici değişiklikler olarak algılanır. Bu protokol, gelişimsel bağımlı nöron ağları bir dizi için adapte edilebilir<em&gt; In vitro</em&gt;.

Kortikal Ağları Geliştirme Fonksiyonel Kalsiyum Görüntüleme

Gelişmekte olan sinir sistemlerindeki belirgin bir aktivite örüntüsü, spontan ve senkronize ağ aktivitesidir. Senkronize aktivite, ... içerisinde gözlemlenmiştir.

Bu videonun genel amacı, kalsiyuma duyarlı floresan indikatör kullanarak gelişmekte olan kortikal beyin kesitlerinden ağ aktivitesinin nasıl ölçüleceğini göstermektir. DY beyin kesitleri, genç bir farenin gelişmekte olan enteral korteksinden hazırlanır. Hem nöronlar hem de astrositler kalsiyum bağımlı markerlar ile yüklenir.Kalsiyum bağımlı boyaların floresanındaki değişimler, hücresel aktivitedeki değişimleri yansıtır. Astrositler, mikroglialar ve endotel hücreleri dahil olmak üzere nöronal olmayan hücreler, spesifik marker boyalar kullanılarak boyanabilir. Kortikal ağ aktivitesi, zaman ayarlı Multiphoton görüntüleme ile kaydedilir; ağ içindeki hücreler, ilgi bölgesinden 3D görüntü yığınları oluşturularak tespit edilir.Birden fazla hücredeki hücresel floresans değişiklikleri, gelişmekte olan kortikal ağın aktivitesini okumak için analiz edilebilir. Gelişen sinir sistemindeki karakteristik bir aktivite paterni, spontan senkronize ağ aktivitesidir. Senkronize aktivite, sağlam spinal kord korteksi ve disosiye nöronal kültür preparatları da dahil olmak üzere, gelişmekte olan birçok farklı nöronal bölgede; nöronların ateşleme için depolarize olduğu, birçok voltaj kapılı kalsiyum kanalı da dahil olmak üzere birçok iyon kanalını aktive eden tekli spike'lar veya aksiyon potansiyeli burst'leri ile kalsiyum girişine yol açtığı spontan aktivite dönemlerinde gözlemlenmiştir.Yerel ağlardan gelen yüksek derecede senkronize aktivite, alan elektrotları veya çoklu elektrot dizileri kullanılarak ölçülmüştür. Bunlar yüksek zamansal örnekleme hızlarına olanak tanır, ancak hücre aktivitesinin entegre okuması nedeniyle daha düşük uzamsal çözünürlük sunar. Nöronal aktivitenin tek hücre çözünürlüğünde ölçülmesi, ateşleme hızlarını belirlemek için tekil nöronların patch clamp elektrofizyolojisi kullanılarak gerçekleştirilebilir.Ancak, bir ağdan ölçüm yapabilme yeteneği aynı anda yamalanan nöron sayısıyla sınırlıdır ve genellikle sadece bir veya iki nörondur. Kalsiyum bağımlı floresan indikatör boyaların kullanımı, bir hücre ağı boyunca senkronize aktivitenin ölçülmesini mümkün kılmıştır. Bu teknik, gelişen ağın spontan aktivitesini kaydetmek için hem yüksek mekansal çözünürlük hem de yeterli zamansal örnekleme sağlar.URA 2:00 AM ester gibi floresan kalsiyum duyarlı indikatörler, kalsiyum iyonlarına bağlanabilen karboksilik asit grupları içerir. Bu floresan boyalar, tek fotonlu veya iki fotonlu mikroskopi kullanılarak belirli ışık dalga boyları ile aktive edilir. Boyadan yayılan foton sayısı, kalsiyuma bağlanma gerçekleştiğinde geçici olarak değişir.Foton sayısındaki veya floresan düzeyindeki bu değişim, delta FF sinyali olarak rapor edilir ve nöron içindeki kalsiyum seviyesindeki bir değişime karşılık gelir. Kalsiyuma duyarlı indikatörlerdeki değişimlerin ölçümü, gelişmekte olan hücrelerdeki ağ aktivite modellerinin yararlı bir okuma ölçütüdür. Merhaba, ben Rianna Morty ve benim adım Julie Abbots.Amsterdam'daki üniversitenin Yorumlayıcı Nörofizyoloji Bölümü'nden geliyoruz. Çok odaklı görüntülemede kalsiyum duyarlı indikatörler kullanarak, fare korteksindeki gelişmekte olan dokudaki fonksiyonel aktiviteyi incelemek için kalsiyum görüntüleme yöntemini kullanmaktayız. Bu kısa filmin amacı, bu yöntemlerin sinir sistemindeki gelişen ağlarda hem spontan hem de uyarılmış aktivite modellerini ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektir.Nöral devrelerdeki hasarı azaltmak için genç bir farenin beynini hızla kafatasından çıkarın. Beyni buz gibi soğuk dilimleme solüsyonu içinde diseke edin. Dilimleme solüsyonu, nöronal kayıtlar için A TSF'de yaygın olarak kullanılan sodyum yerine kolin klorür içerir.Bu deneylerde, gelişmekte olan fare beyninin enteral korteksinden beyin dilimleri hazırlıyoruz. Bir petri kabının üzerine bir parça filtre kağıdı yerleştirin ve birkaç mililitre A TSF ile ıslatın. Beyni filtre kağıdının üzerine aktarın.Hemisferleri tek kenarlı bir jiletle ikiye bölün. İki hemisferi birbirinden ayırın. Hemisferlerden birini, diğer hemisferle birlikte buzlu dilimleme solüsyonuna geri yerleştirin.Jiletle serebellumu çıkarın. Hemisferlerden birini orta hattına doğru katlayın ve bıçağı hafif bir açıyla rostral uca doğru tutarak dorsal yüzeyden yaklaşık bir milimetrelik bir kesi yapın. Beyni ters çevirin.Pamuklu aplik ve metal spatula kullanarak yakın zamanda kesilmiş yüzeyi temizleyin. Beyni metal kesme bloğuna aktarın. Beyni spatula üzerinden pamuklu aplikle hafifçe iterek yapışkanlı yüzeye yerleştirin.Beynin 300 µm kalınlığındaki dilimleri kesilir; genç dokular için kesme hızları ve bıçak frekansları genellikle daha olgun dokular için kullanılanlardan daha düşüktür. Kesilen her dilim, bir cam pipet kullanılarak oda sıcaklığındaki oksijenlenmiş A-TSF içeren tutma haznesine aktarılır. A-CSF, A-CSF çözeltisine göre daha yüksek bir magnezyum/kalsiyum oranına sahiptir.Kayıt için kullanılan kesitlerin toparlanması için bir saat beklenir. Hücreleri kalsiyuma bağımlı bir indikatör veya hücreye özgü bir işaretleyici ile yüklemek için kesitlerin boyama prosedürü için bir hazneye aktarılması gerekir. Ticari hazneler mevcut olsa da, standart laboratuvar ekipmanları kullanılarak çok düşük bir maliyetle kolayca bir hazne monte edilebilir.Bir boyama odası hazırlamak için şu temel laboratuvar ekipmanlarına ihtiyacınız olacaktır: iki adet plastik petri kabı, bir adet 10 milliliter şırınga, bir parça silika tüp, yarı geçirgen membranlı bir hücre kültürü inserti, hızlı yapıştırıcı, üç adet küçük tüp konnektörü ve ince uçlu bir iğne. Büyük Petri kabını alın ve ısıtılmış bir çubukla yan duvardan küçük bir delik açın. Küçük Petri kabını alın ve silikon tüpün geçebileceği büyüklükte, benzer çapta bir delik açın.Silikon tüpün bir bölümünü delikten geçirin ve küçük kabın içinde bir halka oluşturun. Tüpün açık ucunu kapatmak için hızlı yapıştırıcı kullanın. Ardından, tüpün geri kalan kısmını küçük petri kabının iç duvarına yapıştırın.Küçük petri kabını büyüğünün merkezine yerleştirin ve yapıştırın. Silikon tüpün kalan ucunu alın ve petri kabının yan duvarındaki küçük delikten geçirin. İnce bir iğne kullanarak, petri kabının içindeki silikon tüpte küçük delikler açın.Gaz geçirgenliğinin dengeli olması için delikleri eşit aralıklarla açın. Isıtılmış bir bistüri kullanarak, yarı geçirgen membranlı bir hücre kültür kuyucuğu alın. İnkübasyon sırasında dilimleri tutmak için sığ bir kap oluşturacak şekilde, kuyucuğun üstten bir santimetresini kesin.Sığ kabı, gözenekli silikon tüplerle çevrili küçük kabın merkezine yerleştirin. Büyük kabın kapağına yaklaşık yarım ila bir santimetre çapında bir delik açın. Isıtılmış bir bistüri kullanarak 10 mililitrelik plastik bir şırınga alın.Şırınganın ucunu çıkarmak için açılı bir kesik yapın. Şırınga tüpünün kesilen yüzeyine hızlı yapıştırıcı sürün. Bunu, büyük Petri kabı kapağındaki deliğin üzerine doğrudan yapıştırın.Şırınga ucunun sonuna bir hortum konnektörü takın. Gözenekli gaz hortumunun sığ kabın etrafında yer aldığından emin olarak, sığ kabı küçük Petri kabının merkezine yerleştirin. Bu hortum, ardından kesitleri oksijenlendirmek için bir karbogen gaz kaynağına bağlanır.İnkübasyon sırasında, şırınga ucu aracılığıyla gaz kaynağına doğrudan bağlı olan geniş petri kabının kapağını kapatın. Bu işlem, boyanın solmasını önlemek için inkübasyon süresince kesitlerin üzerine karbonat ve gaz akışı sağlayacaktır. Tüm işlemler mümkün olduğunca az ışık altında gerçekleştirilmeli; hem boya hem de kesitler karanlıkta tutulmalıdır.Boyama haznesini, dilim tutucusundan yaklaşık bir buçuk mililitre A TSF ile doldurun. Arayüz haznesini içeri yerleştirin ve bir mililitre daha A TSF ile doldurun. Dokunun sağlıklı kalması ve dilimin iyi yüklenmesi için iyi bir oksijen kaynağının sürdürülmesi önemlidir.Boyama odası ısınırken, boyanın nöronlar tarafından alınımını kolaylaştırmak için boyama yaklaşık 35 °C'de gerçekleştirilir. fira 2:00 AM Ester için indikatör boyayı hazırlayın. 50 µg'lık bir flakona dokuz µL DMSO ile bir µL onik asit ekleyin.DMSO ve onik asit. Boyanın lipid membran aracılığıyla alınmasını sağlamak için geçirgenlik artırıcı ajanlar olarak görev yaparlar. Boyanın tamamen çözündüğünden emin olmak için flakonu 15 dakika boyunca vorteksleyin.Boyama için, her kesiti ara yüze aktarın. Boyama haznesine yerleştirin. Boyayı kesitlerin üzerindeki ilgi bölgesine doğrudan damlatın ve boyama haznesinin kapağını kapatın.Kesitleri, kullanılan farelerin yaşına bağlı olarak 20 ila 40 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin. İnkübasyon sonrası, kalan fazla boyayı yıkamak için kesitleri tekrar kesit tutucuya aktarın. Kalsiyum görüntüleme için kullanılan boyama protokolleri, daha yaşlı dokulara göre de uyarlanabilir.Bu işlem, ek bir ön inkübasyon adımı gerektirir. Eski kesitleri, 3 mL CSF ve %0,5'lik 8 µL crema four çözeltisi ile doldurulmuş sığ bir ön inkübasyon kabına aktarın. Üç dakika boyunca 35 °C'ye ısıtın. Ardından kesitleri arayüze aktarın, boyama haznesine yerleştirin ve normal boyama prosedürlerini izleyin.Bu kesitlerin nöronal olmayan hücreler, yani astrositler, mikroglialar ve endotel hücreler için boyanması da mümkündür. Astrositleri sülfür domini için boyamak amacıyla Sülfur rumine 1 0 1 kullanılabilir. 10 µM'lık bir çözelti hazırlayın ve mor boyayı kesitlerdeki ilgili bölge üzerine pipetleyin.15 dakika boyunca inkübasyona bırakın. Fazla boyayı uzaklaştırmak için kesitleri tutma haznesine geri aktarın. Domates lektininin FSE konjuge formu, mikroglia ve endotel hücrelerini boyamak için kullanılabilir.Domates lektini için mililitre başına 20 mikrogramlık bir çözelti hazırlayın. Boyayı kesitlerdeki ilgili bölgenin üzerine damlatın. Kesitleri 45 dakika boyunca inkübasyona bırakın.Ardından kesitleri bir kez daha tutma haznesine aktarın. Görüntüleme sırasında kesitlerin mikroskop altında sabit kalması gerekir. Genellikle dokuyu sabit tutmak için metal bir arp yerleştirilir; ancak bu, kesitin yüzeyini düzensiz bir şekilde bozarak görüntüleme için odak içinde yalnızca sınırlı bir görüş alanı sağlayabilir ve bundan kaçınılmalıdır.Bu dilimler, POLİETİLEN veya PEI çözeltisi kullanılarak kayıt odasına sabitlenir. PEI, hücrelerin bir yüzeye tutunmasını artırmak için en az bir saat boyunca kullanılan bir polimerdir. Dilimleri kayıt odalarına yerleştirmeden önce, odanın tabanını kaplayacak şekilde birkaç mililitre PEI çözeltisi ile doldurun.Öncelikle, oda içerisindeki PEI'yi önce distile su, ardından CSF çözeltisi ile durulayın. Bir kesiti kayıt odasına aktarın ve fazla A CSF çözeltisini uzaklaştırın. Kesiti, ince uçlu bir boya fırçası kullanarak odanın ortasına yerleştirin.Kalan tüm A CSF'yi emici filtre kağıdının küçük parçalarını kullanarak temizleyin. Kesitin kenarlarında artık A CSF kalmadığından emin olun. Son olarak, kesiti bölmeden nazikçe üzerine yarım mililitre A CSF damlatın.Kamaraları oksijenle doyurulmuş büyük bir ara yüz kabına yerleştirin ve bir saat daha karanlıkta bekletin. Kalsiyum duyarlı indikatör boyalardaki değişimler, tek veya çift foton mikroskobu ile kaydedilebilir. Nöronal ağlarımızda çift foton görüntüleme yapabilmek için Olympus mikroskobuna bağlı bir titanyum safir lazer kullanıyoruz.Ek olarak, artırılmış kare tarama hızları için EM CCD hammer MATSU kameralı bir L Vision biotech trim scope sistemi kullanıyoruz. Dilim odasını, 1,6 millimolar kalsiyum ve 1,5 millimolar magnezyum içeren oksijenlendirilmiş A-T-S-F-A-T-S-F'nin stabil akışının olduğu mikroskobun altına yerleştirin. Düzenek, beyaz ışık kullanılarak yaklaşık 30 °C'ye ısıtılır.Kesitteki ilgi bölgesini belirleyin ve yüzeye odaklayın. Işıkları kapatın ve kayıt kabininin kapısını kapatın. Bu işlem, arka plan ışık seviyelerini azaltmak içindir.Görüntüleri kaydetmek ve analiz etmek için birçok farklı ticari veya açık kaynaklı yazılım paketi mevcuttur. Laboratuvarımızda, görüntüleme işlemi için Lavis Biotech'in inspector yazılımını kullanıyoruz. Görüntülemeye başlamak için deteksiyon amacıyla CCD kamera modunu seçin. İndikatörünüz için ilgili dalga boyunu ayarlayın.Fira 2:00 AM Ester için, trim scope yazılımında eksitasyonu 820 nanometreye ayarladık. 64 B tarama modunu seçin. İlgilendiğiniz bölge için optimal görüş alanı boyutunu ve piksel çözünürlüğünü belirleyin.Görüntü örneklemeniz için uygun bir kare hızı ve gerekliyse piksel döndürme (pixel spinning) seçin. Sürekli görüntüleme için lazer kepenklerini açın. Sürekli görüntüleme modunu kullanın.Kazancı ve lazer yoğunluğunu ayarlayın ve görüntülemek istediğiniz nöronal ağa odaklanın. Taramayı durdurun. Kare hızı ve sekans süresi için zamanlapse ayarlarını seçin.Zamanla seyreden (time-lapse) görüntülemenin ardından, 1 mikronluk adımlarla 20 mikron yukarısını ve 20 mikron aşağısını kapsayan bir Z yığını (Z stack) görüntü oluşturun. Bu Z yığını, analiz sırasında hücre tespiti için kullanılır. Kaydedilen dosyaları bir TIFF görüntü yığını olarak dışa aktarın.Sonuç olarak, gelişmekte olan korteksteki senkronize spontan ağ aktivitesini ölçmek için kalsiyum indikatörlerinin kullanımını göstermiş olduk. Tekniği kendi laboratuvarınızda kurabilmeniz için metodoloji ve reaktifler hakkında daha fazla ayrıntı, bu filme eşlik eden veri sayfalarında bulunabilir.

functional-calcium-imaging-in-developing-cortical-networks

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Neokorteks mikrodevreler ağ dinamiklerini anlamak için, aynı anda çok sayıda nöron aktivitesini kaydetmek için esastır. In vivo iki foton kalsiyum görüntüleme, bir tek hücre çözünürlük ile yoğun bir nöronal nüfusun faaliyet kaydetmenize olanak sağlayan tek yöntem.

Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

Kalsiyum sinyalleri gen ekspresyonu, hayatta kalma ve farklılaşma dahil olmak üzere pek çok hücresel süreçlerinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada Fura-02:00 kullanarak kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için nasıl göstermektedir. Kalsiyum görüntüleme, gerçek zamanlı ve sinyalizasyon kaskadlar düzenlenmesi hücre içi kalsiyum düzenlemeyi incelemek için değerli bir araçtır.

Kortikal nöronlar kullanarak Fura-02:00 Kalsiyum Görüntüleme

Kayıt kalsiyum aktivitesi için gösterge kalsiyum boyalar ile subventrikuler alanin (SVZ) hücreleri yüklemek için bir yöntem tarif edilmektedir. Postnatal SVZ nöral progenitör hücreler ve nöroblast gibi sıkıca paketlenmiş hücreleri içerir. Aksine banyo yükleme kullanmaktan daha biz daha iyi boya difüzyon sağlayan doku içinde basınç boya enjekte.

Kalsiyum Görüntüleme için akut subventricular dilimi Dilimleri hazırlanması

Kaynak: Bannai, H., et. al., Kültürlenmiş Hücrelerde Yerel Ca2+ Sinyallerinin Membran Hedefli Ca2+ Göstergeleri ile Diseksiyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Video, plazma zarı ve endoplazmik retikulum üzerinde lokalize kalsiyuma duyarlı proteinleri sırayla izleyerek astrositlerde kompartmana özgü spontan kalsiyum dinamiklerini gözlemlemek için floresan görüntülemeyi göstermektedir.

Astrositlerde Kompartmana Özgü Dinamikler için Spontan Kalsiyum Görüntüleme

Burada, serbest hareket eden farelerde çoklu korteks tabakaları boyunca hücresel çözünürlük ile büyük ölçekli Ca 2+ görüntülemenin gerçekleştirilmesi için bir prosedür sunuyoruz. Yüzlerce aktif hücre, implante edilmiş bir prizma probu ile birleştirilmiş minyatür, başa monte mikroskop kullanarak eş zamanlı olarak gözlemlenebilir.

Çok Katlı Kortikal Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Prizmatik Problar ve Minyatür Floresan Mikroskopi ile Serbestçe Hareketli Fare Görüntüleme

Biz yukarıda ikili birincil somatosensor corticies (S1) Thy1içinde çift optik pencerelerden nöronal aktivite ölçmek için deneysel bir işlem tarif-GCaMP6s transgenik fareler 2-foton (2 P) mikroskopi vivo içindekullanma.

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

Biz bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları ve Ca2 + geçişler akut beyin dilimleri içinde nöronal dendrites kaydetmek için iki fotonlu Imaging birleştiren bir yöntem mevcut.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Floresan kalsiyum görüntülemeile in situ hibridizasyonunu birleştiren ve deneycinin kalsiyum aktivitesi modellerini tek hücreli düzeyde gen ekspresyonu profilleriyle ilişkilendirmesine olanak tanıyan iki parçalı bir protokol salıyoruz.

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Hücre kalsiyum görüntüleme, benzersiz fonksiyonel imzalar veren kalsiyum geçirgen kanalların / reseptörlerin ekspresyonuna dayanarak, bireysel hücrelerin, kültürdeki karışık popülasyonların ve hatta uyanmış hayvanların dinamik sinyalizasyonunu incelemek için çok yönlü bir metodolojidir.

Kalsiyum Görüntüleme Tekniği ile Nöron-Glia Devresindeki Değişimlerin Görselleştirilmesi

Neokorteksteki birincil duyusal alanlar, gelişim sırasında benzersiz spontan aktiviteler sergiler. Bu makale, yenidoğan farelerde alana özgü senkron aktiviteleri in vivo olarak analiz etmek için bireysel nöron aktivitelerinin ve birincil duyusal alanların nasıl görselleştirileceğini açıklamaktadır.

Yenidoğan Fare Duyusal Korteksinde Tek Nöron Çözünürlükte Spontan Aktivitenin İn vivo Görselleştirilmesi

Keşfedin gelişen fare korteks dokusunda fonksiyonel kalsiyum görüntüleme yöntemini. Bu teknik, sinir ağı aktivitesini yüksek uzaysal çözünürlükle ölçmenizi sağlar.

Kortikal Ağları Geliştirme Fonksiyonel Kalsiyum Görüntüleme

Daha fazla video keşfet