Kortikal Ağları Geliştirme Fonksiyonel Kalsiyum Görüntüleme

Bu filmin genel amacı, kalsiyuma duyarlı floresan indikatör kullanarak kortikal beyin dilimleri geliştirmekten kaynaklanan ağ aktivitesinin nasıl ölçüleceğini göstermektir. DY beyin dilimleri, genç bir farenin gelişmekte olan enteral korteksinden yapılır. Hem nöronlar hem de astrositler kalsiyuma bağımlı belirteçlerle yüklüdür.

Kalsiyuma bağımlı boyaların floresansındaki değişiklikler, hücresel aktivitedeki değişiklikleri yansıtır. Astrositler, mikroglia ve endotel hücreleri dahil olmak üzere nöronal olmayan hücreler, spesifik işaretleyici boyalar kullanılarak boyanabilir. Kortikal ağ aktivitesi, hızlandırılmış Multifoton görüntüleme hücreleri kullanılarak kaydedilir ve ilgilenilen bölge boyunca bir 3D görüntü yığını oluşturularak ağ içinde tespit edilir.

Birden fazla hücredeki hücresel floresanstaki değişiklikler daha sonra gelişmekte olan kortikal ağın aktivitesini okumak için analiz edilebilir. Gelişmekte olan sinir sistemindeki ayırt edici bir aktivite modeli, kendiliğinden senkronize ağ aktivitesidir. Spontan aktivite dönemlerinde sağlam omurilik korteksi ve ayrışmış nöronal kültür preparatları dahil olmak üzere birçok farklı gelişmekte olan nöronal bölgede senkronize aktivite gözlenmiştir, yangına depolarize nöronlar, kalsiyum akışına yol açan voltaj kapılı kalsiyum kanalları da dahil olmak üzere birçok demir kanalını aktive eden tek sivri uçlar veya aksiyon potansiyeli patlamaları.

Yüksek derecede senkronize aktivite, alan elektrotları veya çoklu elektrot dizileri kullanılarak yerel ağlardan ölçülmüştür. Bunlar, yüksek zamansal örnekleme oranlarını mümkün kılar, ancak hücre aktivitesinin entegre okuması nedeniyle daha düşük uzamsal çözünürlük sağlar. Ateşleme hızlarını ölçmek için tek nöronların yama kelepçe elektrofizyolojisi kullanılarak nöral aktivitenin tek hücre çözünürlüğü mümkündür.

Bununla birlikte, bir ağdan ölçüm yapma yeteneği, aynı anda yamalanan nöronların sayısıyla sınırlıdır ve tipik olarak yalnızca bir veya iki nörondur. Kalsiyuma bağımlı floresan indikatör boyaların kullanılması, bir hücre ağı boyunca senkronize aktivitenin ölçülmesini sağlamıştır. Bu teknik, gelişmekte olan ağın spontan aktivitesini kaydetmek için hem yüksek uzamsal çözünürlük hem de yeterli zamansal örnekleme sağlar.

URA 2:00 ester gibi floresan kalsiyuma duyarlı indikatörler, kalsiyum madenlerini bağlayabilen karboksilik asit grupları içerir. Bu floresan boyalar, bir foton veya iki foton mikroskobu kullanılarak belirli ışık dalga boyları ile aktive edilir. Boyadan yayılan fotonların sayısı, kalsiyumun bağlanması üzerine geçici olarak değişir.

Foton sayısındaki veya floresandaki bu değişiklik, delta FF sinyali olarak rapor edilir ve nöron içindeki kalsiyum seviyesindeki bir değişikliğe karşılık gelir. Kalsiyuma duyarlı göstergelerdeki değişikliklerin ölçümü, gelişmekte olan hücrelerdeki ağ aktivitesi modellerinin yararlı bir okuma ölçüsüdür. Merhaba, ben Rianna Morty, Ve benim adım Julie Abbots.

Yorumlayıcı nörofizyoloji Bölümü'nden ve Amsterdam üniversitesindeniz. Multifokal görüntülemede kalsiyuma duyarlı göstergeler kullanarak fare korteksinde doku geliştirmedeki fonksiyonel aktiviteyi incelemek için kalsiyum görüntüleme kullanıyoruz. Bu kısa filmin amacı, bu yöntemlerin sinir sisteminde gelişmekte olan ağlarda hem spontan hem de uyandırıcı aktivite örüntülerini ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektir.

Nöral devrelere verilen zararı azaltmak için beyni genç bir farenin kafatasından hızla çıkarın. Beyni buz gibi soğuk dilim solüsyonunda inceleyin. Dilim çözeltisi, nöronal kayıtlar için A TSF'de yaygın olarak kullanılan sodyum yerine kolin klorür içerir.

Bu deneylerde, gelişmekte olan fare beyninin enteral korteksinden beyin dilimleri yapıyoruz. Bir petro kabının üzerine bir parça filtre kağıdı yerleştirin ve birkaç mililitre A TSF ile ıslatın. Beyni filtre kağıdına aktarın.

Tek kenarlı bir tıraş bıçağı kullanarak yarım küreleri ikiye bölün. İki yarım küreyi ayırın. Birini kalan yarım küre ile buzlu dilim çözeltisine geri yerleştirin.

Beyincik'i jiletle çıkarın. Bir yarım küreyi orta çizgisine çevirin ve bıçağın rostral ucuna doğru hafif bir açısıyla sırt yüzeyinden yaklaşık bir milimetrelik bir kesim yapın. Beyni ters çevirin.

Yakın zamanda pamuklu bir kuş ve metal spatula kullanılarak kesilmiş yüzeyi. Beyni metal kesme bloğuna aktarın. Beyni pamuklu bir kuşla spatuladan yavaşça yapıştırılmış yüzeye itin.

300 Mikrometre beyin dilimleri genç doku kesme hızları için kesilir ve bıçak frekansı tipik olarak daha olgun doku için kullanılanlardan daha yavaştır. Kesildikten sonra, her dilimi bir cam pipet kullanarak aktarın, dilimler oda sıcaklığında oksijenli A TSF içeren tutma odasına aktarılır. A CSF, A BOS çözeltisinden daha yüksek bir magnezyum / kalsiyum oranı içerir.

Kayıt için kullanılan dilimler iyileşmek için bir saat bekletilir. Hücreleri kalsiyuma bağımlı bir indikatör veya hücreye özgü bir işaretleyici ile yüklemek için, boyama prosedürü için dilimlerin bir odaya aktarılması gerekir. Ticari odalar mevcut olmasına rağmen, standart laboratuvar ekipmanlarından çok az maliyetle kolayca monte edilebilir.

Bir boyama odası yapmak için aşağıdaki temel laboratuvar ekipmanına, iki plastik petri kabına, bir adet 10 mililitrelik şırıngaya, bir silika boru bölümüne, yarı geçirgen membran süper yapıştırıcılı bir hücre kültürü ekifine, üç küçük boru konektörüne ve ince bir iğneye ihtiyacınız olacak. Büyük Petri kabını alın ve yan duvardan ısıtılmış bir çubukla küçük bir delik açın. Küçük Petri kabını alın ve silikon borunun geçebileceği kadar büyük boyutta bir delik açın.

Silikon borunun bir bölümünü delikten geçirin ve küçük tabağın içinde bir halka oluşturun. Borunun açık ucunu kapatmak için süper yapıştırıcı kullanın. Ardından borunun geri kalanını küçük petri kabının iç duvarına yapıştırın.

Küçük petri kabını büyük olanın ortasına yerleştirin ve yerine yapıştırın. Silikon borunun kalan ucunu alın ve Petri kabının yan duvarındaki küçük delikten geçirin. İnce bir iğne alın ve petri kabının içindeki silikon tüpte küçük delikler açın.

Eşit bir gazlayıcı füzyonu için delikleri eşit aralıklarla yapın. Isıtılmış bir neşter kullanarak yarı geçirgen bir zar ile bir hücre kültürü alın. Kuluçka sırasında dilimleri tutmak için sığ bir tabak bırakmak için kuyunun üst bir santimetresini kesin.

Sığ tabağı, gözenekli silikon boru ile çevrili küçük tabağın ortasına yerleştirin. Büyük tabağın kapağında yaklaşık yarım ila bir santimetre çapında bir delik açın. Isıtılmış bir neşter kullanarak 10 mililitrelik plastik bir şırınga alın.

Şırınganın ucunu çıkarmak için açılı bir kesim yapın. Şırınga tüpünün kesilen yüzeyine süper yapıştırıcı sürün. Bunu doğrudan büyük Petri kabı kapağındaki deliğin üzerine yapıştırın.

Şırınga ucunun ucuna bir boru konektörü takın. Sığ kabı küçük Petri kabının ortasına yerleştirin ve gözenekli gaz tüpünün yemeğin etrafında durduğundan emin olun. Bu tüp daha sonra dilimleri oksijenlendirmek için bir karbojen gazı kaynağına bağlanır.

Kuluçka sırasında, şırınga ucu aracılığıyla doğrudan gaz kaynağına da bağlı olan büyük kabın kapağını değiştirin. Bu, boyanın ağarmasını önlemek için inkübasyon sırasında dilimlerin üzerine bir araba ve gaz kaynağı getirecektir. Tüm işlemler mümkün olduğunca az ışıkla gerçekleştirilir ve hem boya hem de dilimler karanlıkta tutulur.

Boyama haznesini dilim tutucudan yaklaşık bir buçuk mililitre A TSF ile doldurun. Arayüz haznesini içine yerleştirin ve başka bir mililitre A TSF ile doldurun. Dokuyu sağlıklı tutmak ve dilimin iyi bir şekilde yüklenmesi için iyi bir oksijen kaynağı sağlamak önemlidir.

Boyama odası ısınırken boyanın nöronlara alımını kolaylaştırmak için boyama yaklaşık 35 ° C'de meydana gelir. İndikatör boyasını fira 2:00 Ester için hazırlayın. 50 mikrogramlık bir şişeye bir mikrolitre onik asit ile dokuz mikrolitre DMSO ekleyin.

DMSO ve onik asit. Boyanın lipit zarından alınmasını sağlamak için geçirgen maddeler olarak işlev görür. Boyanın tamamen çözüldüğünden emin olmak için şişeyi 15 dakika boyunca vorteksleyin.

Boyama için, her dilimi arayüze aktarın. Boyama haznesine yerleştirin. Boyayı doğrudan dilimlerin üzerindeki ilgili bölgeye yerleştirin, boyama odasının kapağını kapatın.

Dilimleri, kullanılan maus'un yaşına bağlı olarak 20 ila 40 dakika karanlıkta inkübe bırakın. İnkübasyondan sonra, kalan fazla boyayı yıkamak için dilimleri dilim tutucuya geri aktarın. Kalsiyum görüntüleme için boyama protokolleri daha yaşlı dokular için de uyarlanabilir.

Bu, ek bir ön inkübasyon adımı gerektirir. Eski dilimleri, üç mililitre BOS ve sekiz mikrolitre krema dörtlü çözelti ile doldurulmuş sığ bir ön inkübasyon kabına aktarın,% 0.5'teÜç dakika boyunca 35 derece C'ye ısıtın. Ardından dilimleri arayüze aktarın, boyama odasına yerleştirin ve normal boyama prosedürlerini izleyin.

Bu dilimleri nöronal olmayan hücreler, yani astrositler, mikroglia ve endotel hücreleri için boyamak da mümkündür. Kükürt rumin 1 0 1, kükürt domini için astrositleri boyamak için kullanılabilir. 10 mikromolar pipetten oluşan bir çözelti yapın, mor boyayı dilimlerdeki ilgili bölgenin üzerine pipetleyin.

15 dakikalık bir süre inkübe etmeye bırakın. Fazla boyayı çıkarmak için dilimleri tutma odasına geri aktarın. Domates lektininin FSE konjugatı mikroglia ve endotel hücreleri için lekelenebilir.

Domates lektini için mililitre başına 20 mikrogramlık bir çözelti hazırlayın. Boyayı dilimlerdeki ilgilenilen bölgenin üzerine koyun. Dilimleri 45 dakikalık bir süre inkübe etmeye bırakın.

Ardından dilimleri bir kez daha tutma odasına geri aktarın. Görüntüleme sırasında dilimlerin mikroskop altında stabil olması gerekir. Genellikle dokuyu tutmak için metal bir arp yerleştirilir, ancak dilimin yüzeyini eşit olmayan bir şekilde bozabilir ve görüntülemenin kaçınması için odakta yalnızca sınırlı bir görüş alanı sağlar.

Bu dilimler POLYETHALE veya PEI solüsyonu kullanılarak kayıt odasına yapıştırılır. PEI, hücrelerin en az bir saat boyunca bir yüzeye yapışmasını arttırmak için kullanılan bir polimerdir. Dilimleri kayıt odalarına yerleştirmeden önce, odanın tabanını kaplamak için bu odaları birkaç mililitre PEI solüsyonu ile doldurun.

İlk olarak, PEI'yi hazneden damıtılmış su ile durulayın, ardından bir BOS çözeltisi trans. Bir dilimi kayıt odasına aktarın ve fazla A BOS solüsyonunu çıkarın. İnce bir boya fırçası kullanarak dilimi haznenin ortasına yerleştirin.

Küçük emici filtre kağıdı parçaları kullanarak diğer tüm A BOS'u çıkarın. Dilimin kenarlarında artık A CSF kalmadığından emin olun. Son olarak, yarım mililitre A CSF'yi hazneden gevşetmeden dilimin üzerine nazikçe koyun.

Odaları büyük bir oksijenli arayüz kabına yerleştirin ve karanlıkta bir saat daha bırakın. Kalsiyuma duyarlı indikatör boyalarındaki değişiklikler bir veya iki foton mikroskobu ile kaydedilebilir. Nöronal ağlarımızda iki foton görüntülemeyi mümkün kılmak için bir Olympus mikroskobuna bağlı bir titanyum safir lazer kullanıyoruz.

Ek olarak, daha yüksek kare tarama hızları için EM CCD çekiçli MATSU kameralı bir L Vision biotech trim dürbün sisteminden yararlanıyoruz. Dilim haznesini, 1.6 milimolar kalsiyum ve 1.5 milimolar içeren stabil bir oksijenli A-T-S-F-A-T-S-F akışı ile mikroskop altına yerleştirin. Magnezyum, kurulumda beyaz ışık kullanılarak yaklaşık 30 derece C'ye ısıtılır.

Dilimde ilgilenilen bölgeyi bulun ve yüzeye odaklanın. Işıkları kapatın ve kayıt kabini kapağını kapatın. Arka plan ışık seviyelerini azaltmak için.

Görüntüleri kaydetmek ve analiz etmek için birçok farklı ticari veya açık yazılım paketi mevcuttur Laboratuvarımızda, Lavis Biotech'ten satın almak için denetçi yazılımı kullanıyoruz. Görüntülemeye başlamak için, algılama için CCD kamera modunu seçin. Göstergeniz için uygun dalga boyunu ayarlayın.

fira 2:00 Ester için, trim kapsamı yazılımında uyarımı 820 nanometreye ayarladık. 64 B tarama modunu seçin. İlgilendiğiniz bölge için en uygun boyut, görüş alanı ve piksel çözünürlüğünü seçin.

Görüntü örneklemeniz için gerekirse uygun bir kare hızı ve piksel döndürme seçin. Sürekli görüntüleme için lazer deklanşörü hazır hale getirin. Sürekli görüntüleme modunu kullanma.

Kazancı ve lazer yoğunluğunu ayarlayın ve görüntülemek istediğiniz nöronal ağa odaklanın. Taramayı durdurun. Kare hızı ve sekans süresi için zaman atlamalı ayarları seçin.

Hızlandırılmış görüntülemenin ardından, bir mikronluk adımlarla 20 mikron üst ve 20 mikron alt kısımları işaretleyen bir Z görüntü yığını oluşturun. Bu Z yığını, analiz sırasında hücre tespiti için kullanılır. Kaydedilen dosyaları bir TIFF görüntü yığını olarak dışa aktarın.

Sonuç olarak, gelişmekte olan kortekste senkron spontan ağ aktivitesini ölçmek için kalsiyum göstergelerinin kullanımını gösterdik. Metodoloji ve reaktifler hakkında daha fazla ayrıntı, tekniği kendi laboratuvarınızda kurmanıza olanak sağlamak için bu filme eşlik eden veri sayfalarında bulunabilir.