Time-lapse video Mikroskop ile Hücrelerinin Rastgele Göç Kantitatif Analiz

Aşağıdaki deneyin genel amacı, video zaman atlamalı mikroskopi kullanarak hücrelerin göçünü gerçek zamanlı olarak nicel olarak ölçmektir. Bu, önce altı kuyucuklu bir kültür plakasının kollajen ile kaplanması ve daha sonra ilgilenilen hücrelerin kaplanmış plaka üzerine seyrek olarak ekilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, bir pipet ucu kullanılarak plakada bir yara oluşturulur ve göç için geniş bir alan sağlanır.

Daha sonra, mikroskop kurulur ve göç eden hücrelerin gerçek zamanlı olarak sürekli izlenmesine izin vermek için bir sıcaklık kontrol sistemi kullanılarak düzenli aralıklarla görüntüler yakalanır. Sonuç olarak, parçacık izleme protokolü, test ve kontrol hücrelerinin ortalama hızı ve toplam yer değiştirmesindeki farklılıkları değerlendirmek için kullanılır. Bu tekniğin, kaçınan oda migrasyon tahlili gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, son nokta kantitatif migrasyon ölçümlerine dayanmamasıdır.

Bunun yerine, farklı parametrelerin sürekli olarak izlenmesine ve hesaplanmasına izin verir. Bu yöntem, belirli genlerin veya ilaçların tümör hücresi göçünü nasıl etkilediği gibi kanser biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. İşlemden iki gün önce, altı kuyucuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna opti ortamda seyreltilmiş 1.5 mililitre kollajen ekleyin ve ardından plakayı işlemden bir gün önce gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

İlgilenilen hücreleri oyuk başına iki mililitre DMEM artı FBS'de yeniden süspanse edin ve hücreleri kollajen ENC kaplı plakanın her bir oyuğuna aktarın ve hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İşlem gününde. Gece boyunca kültürlenmiş hücrelerde bir yara oluşturmak için bir pipet ucu kullanın ve yaranın bir sonucu olarak oluşan kalıntıları gidermek için her bir kuyuyu PBS ile yıkayın.

Durulanan kuyucuklara DMEM artı FBS ekleyin ve ardından temiz bir yara boşluğu oluşturulduğunu doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin. Mikroskop kamerasını ve canlı hücre görüntüleme cihazını açtıktan sonra, plakayı mikroskop tablasının üzerine yerleştirin. Plakayı yeni canlı hücre çevre kontrol odasının yanına kapatın ve termostatı 37 santigrat dereceye ve karbondioksiti %5'e ayarlayın Şimdi menü çubuğundaki slayt kitabı yazılımını açın.

Daire içindeki F düğmesine tıklayarak odak kontrolünü seçin. Hedef kutusunda, hedefi tanımlamak için açılır pencereyi kullanın Filtre seti kutusunda, ışık yolunu I parçasına yönlendirmek için ayarları seçin. Parlak Alan Aydınlatması için uygun filtreyi seçin ve ardından Parlak'ı aç'a tıklayın.

Parlak alan deklanşörünü açmak için. Şimdi taret üzerindeki parlak alan filtresini seçin ve uygun alanları bulmak ve numuneyi odağa getirmek için numuneyi göz merceğinden görüntüleyin. Ardından, kameraya giden ışık yolunu değiştirmek için filtre taretini hareket ettirin Slayt kitabı yazılımında görüntü yakalamak için, odak kontrolüne tıklayın, I parçası boyunca farklı konumlar seçmek için XY'yi seçin ve ardından her konumu kilitlemek için ayar noktasına tıklayın.

Görüntü yakalama için, ekranda görüntülenen kamera görüntüsünün odağına manuel olarak ince ayar yapın ve ardından sahne alanının Z konumunu ayarlamak için odak kontrolleri penceresindeki araçları kullanın. En iyi sonuçları elde etmek için, odaklanmaya yardımcı olması için plakayla temasın yakınındaki düz hücresel çıkıntılara odaklanın. Pozlama sürelerini odaklama için uygun bir aralıkta olacak şekilde ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın.

Birden fazla XY konumu seçilmişse, odak kontrolünü seçerek her bir konum için odağı ayarlayın. Sonra xy, sonra noktayı ziyaret edin. Slayt kitabında, menü çubuğundan kamera grafiğini seçin, yakalama türünü seçin ve ardından denemenin süresini seçmek için zaman atlamalı.

Açılır menüden, bir zaman noktasının başlangıcı ile bir sonrakinin başlangıcı arasında istediğiniz gecikmeyi yazın. Aralık alanlarında, üçüncü alan manuel olarak girilen değerlerden otomatik olarak hesaplanacaktır. Birden çok XY yakalama altında, birden fazla XY konumuna sahip deneyler için çok noktalı listeyi seçin.

Son olarak, dosyayı kaydetmek için dosyayı adlandırın, yakalama kontrolüne gidin ve gelişmiş'i seçin, ardından biriktir'i seçin. Ardından belleğe yakalayın ve her zaman noktasından sonra biriktirme dosyasına kaydedin. Resme tıklayarak başlayın.

Slayt kitabı menü çubuğunda, açılır menüden içe aktar'ı seçin ve ardından slayt kitap biriktirmeye tıklayın. Çeşitli alanlar ve zaman noktaları için geçiş denemesinden oluşturulan istenen slayt defteri dosyalarını seçin. İlk dosyayı açın, ardından menü çubuğunda maskeyi seçin ve açılır menüden parçacık izleme protokolünü seçin.

Partikül izleme menüsü altında, manuel partikül izleme protokolünü seçin. Başlangıç ve bitiş zaman noktalarını içeren bir pencere açılacaktır Rastgele geçişi analiz etmek için maskeyi ve ardından parçacık izleme protokolünü seçin. Yine, nesnenin merkezinin koordinatlarını belirlemek için alanın merkezini seçin.

Ardından izle'ye tıklayın ve devam edin. Şimdi yer değiştirme ve ortalama hız gibi her yol için istediğiniz istatistikleri seçin. Burada gösterildiği gibi, istatistikleri görüntülemek için hesapla'yı tıklayın.

Hız açısından nicelleştirilmiş bir rastgele geçiş analizi örneği bu kutuda gösterilmiştir. Bıyık grafiğinde, bu deneyde, tümör baskılayıcı geni yere serilmiş M-D-A-M-B 2 31 hücrelerinde ortalama hızda bir artış olmuştur. Buradaki kontrol M-D-A-M-B 2 31 hücreleri ile karşılaştırıldığında, hücrelerin ilk şekilden rastgele göçü, hücre yer değiştirmesi açısından analiz edildi.

Yine, toplam tümör baskılayıcı gen yıkım grubu, kontrol M-D-A-M-B 2 31'e kıyasla artmış bir hücre deplasmanına sahipti. Bu zaman atlamalı video mikroskopi film kontrolündeki hücreler MDA MB 2 31 hücreleri gece boyunca kollajen üzerine oturtuldu. Görüntüler daha sonra rastgele göç sırasında toplam 18 saat boyunca bir saatlik aralıklarla çekildi.

Hücrelerin zaman içinde orijinal konumlarından nasıl uzaklaştığına dikkat edin. Bu filmde, test M-D-A-M-B 2 31 hücrelerinin kollajen üzerine gece boyunca tohumlandıktan sonra göçü kaydedildi ve analiz edildi. Test hücrelerinin, önceki filmdeki kontrol hücrelerine kıyasla daha göçmen olduğunu unutmayın.

Bu prosedürü takiben, kanser metastazı geliştikten sonra hücrelerin rolleri nelerdir gibi ek soruları yanıtlamak için hücre istilası ve dynas gibi başka yöntemler de uygulanabilir. Bu teknik, hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların izole edilmiş kanser hücre dizilerini kullanarak hücre göçünü keşfetmelerinin yolunu açtı.