Name: Time-lapse video Mikroskop ile Hücrelerinin Rastgele Göç Kantitatif Analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Öğrenin, hücre göçünü zamana bağlı video mikroskobu ile gerçek zamanlı olarak niceliksel analiz etme yöntemini. Bu teknik, sürekli izleme sağlayarak hız ve yer değiştirme gibi parametreleri ölçer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar deneyi ile ilk yardım Amanda Struckhoff teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH 5RO1CA115706 bir hibe ile desteklenmiştir.

1. Plaka hazırlanması Kollajen ile Kaplı <ol><li> 10 ug / Opti-MEM ortam içinde ml bir nihai yoğunluğa kolajeni ile seyreltilir. </li><li> Adım 1 den her oyuğa ilave edilerek 1.5 ml kolajeni ile Coat 6 oyuklu plakalar,. 4, bir gece boyunca inkübe ° C. </li><li> Ertesi gün, 1x Fosfat ile 2 kez Salin (PBS) Tamponlanmış plaka yıkayın ve PBS saklayın. </li></ol> 2. 6-iyi Plate Hücre Hazırlama ve Tohum Not: Hücre hareketi için en uygun koşulları sağlamak için sıcak bir ortam ve PBS kullanın <ol><li> Büyümeye MDA-MB-231 (invaziv meme kanseri hücre hattı) seyrek% 10 Fetal Bovine Serum (FBS) ile Dulbecco Modified Eagle Orta (DMEM) içinde. Bu örnekte, MDA-MB-231 kullanabilir; Bununla birlikte, bu yöntem, herhangi bir yapışkan kanserli olmayan kanser hücre çizgileri de uygulanabilir. </li><li> Sıcak 1x PBS ile iki kez hücre yıkayın ve tripsinizasyon ile toplamak. Su yapmak için bir mikroskop altında hücrelerin kontrol edinhücrelerinin doğru tripsin muamelesi vasıtasıyla ayrılmış olduğu yeniden. </li><li> % 10 FBS DMEM ekleyerek hücreleri toplayın, yavaşça 5 dakika 1000 g olarak hücreleri aşağı spin. % 10 FBS ile DMEM ortamı içinde yavaşça hücre pelletini. </li><li> Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme tarafından hücre pelletini kırın. Bu, mümkün olduğunca tek tek hücrelerin içine kümeleri yıkmak için önemlidir. </li><li> Hücreleri saymak ve% 10 FCS ile 50.000 hücre / ml DMEM ortam içinde bir son konsantrasyon elde etmek seyreltik. Her kuyunun içine 2 ml dağıtın. </li><li> Hızlandırılmış mikroskopi başlangıç ​​kadar, bir gece boyunca bir doku kültürü inkübatöründe 37 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> Göç için geniş bir alan sağlamak için, bir pipet kullanarak bir yara oluşturabilir, moloz (yara sonucu oluşan) çıkarın ve% 10 FBS DMEM eklemek için 1X PBS ile plaka yıkayın. Kayan hücrelerin mikroskop altında kontrol edin. Hücrelerinin büyük sayıda yüzer ise, yıkama işlemi tekrar edin. Şimdi, plakası üzerine ayarlanabilir hazırdırgörüntü alımı için mikroskop. </li></ol> 3. Mikroskop Kurulum ve Otomatik Resim Alma Otomatik görüntü alımı için mikroskop kontrol çeşitli görüntüleme yazılım paketleri vardır. Burada, Slidebook 5.0 görüntüleme yazılımı kullanın ve otomatik satın alma ve minimal fototoksisite hız önemdedir canlı hücre uygulamaları için mükemmel bir EM-Hamamatsu C9100 kamera, birleştiğinde bir mikroskop (Olympus IX81), üzerinde gerçekleştirilir. Sistem bir sahne üst çevresel kontrol odası (Neue Canlı Hücre) ve otomatik XY denetleyicisi (önce ProScan) içerir. Görüntüler tanımlanmış bir zaman aralığı ile parlak bir alan modunda 10X UPLANFL Ph1/0.30 amacı, ile elde edilir. Aşağıdaki protokol görüntü toplama açıklanmaktadır. <ol><li> Mikroskop, kamera ve canlı hücre görüntüleme cihazları açın. Mikroskopik sahne üzerinde plakası yerleştirin. Neue Canlı Hücre çevre tarafından Kapak plakasıBir CO2 kaynağı ve sıcaklık algılayıcı ile bağlanmıştır rının kontrol odası,. 37% 5 ° C ve CO 2 termostatı ayarlayın. </li><li> SlideBook yazılım tam otomatik objektif seçimi, dalgaboyu seçimi ve floresan ve parlak saha teknikleri arasında kolay geçiş sağlar. Odak farklı kontrol parametrelerini ayarlamak için, açık SlideBook yazılım&gt; tıklayarak, menü çubuğunda&gt; select odak denetimi gitmek&gt; <img alt="0 Düğme 1 Şekil" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig0btn1.jpg" /> ve aşağıdaki parametreleri seçin: <ol><li> In &quot;Amaç kutusunda,&quot; penceresinden aşağı açılan seçim tarafından nesnel tanımlar. Bir faz objektif kullanıyor ve elle kondenser uygun faz halka seçmiş unutmayın. Otomatik bir kondansatör ile bir sistem kullanıyorsanız, bu otomatik olarak yazılım aracılığıyla ayarlanır. Ne amacı ne de taret kondenser otomatiktir Alternatif olarak, eğer bu kılavuzu her seçilmelidirly. </li><li> : &quot;Filtre Seti&quot; kutusunda <ol><li> Kullanılabilir filtreler (sistemimizde Kamera için &quot;Geniş açılı&quot;, gözmerceği için &quot;Live&quot;) görmek için açılan kutu aşağıya mercek veya kamera birine ışık yolu yönlendirmek için ayarları seçin. </li><li> Aydınlık aydınlatma için uygun filtre seçin (bizim set up, bu seçeneği aydınlık ışık yolu için açık bir pozisyonu temsil eden &quot;DIC&quot; etiketli). </li><li> Parlak bir alan deklanşör açmak için &quot;Aç Parlak&quot; tıklayarak ışık kaynağı seçin. </li></ol></li></ol></li><li> Göz kısmı altında örnek görmek için, taret parlak bir alan filtre (bizim sistemde konum &quot;6&quot;) seçin. Başlangıçta uygun alanları bulmak ve odak (adımlar 3.2.1 için 3.2.2.3) içine numune getirmek için oküler üzerinden örnek gördükten sonra. Görüntü yakalama (konum sistemimizde &quot;1&quot;) için kameraya ışık yolu değiştirmek için filtre taret taşıyın. </li><li> Otomatik sahne sağlar farklı XY koordinasyon seçimigörüntü alımı sırasında ilgi Birden fazla alanda yakalamak için tes. SlideBook yazılımında, odaklanma kontrolü gidin, göz parçası olsa farklı pozisyonlarda seçin, &quot;XY&quot; seçin, daha sonra görüntü yakalama (Şekil 1) Her yerde &quot;set point&quot; kilidi tıklayın. </li><li> İnce ayar ekranda görüntülenir kamera görüntüsü odak. Bu da daha ince artışlarla odaklama ayarını mikroskop ya da bilgisayar kontrolleri, üzerinde manuel kontroller kullanılarak gerçekleştirilebilir. </li><li> &quot;Focus Denetimleri&quot; penceresindeki denetimleri kullanarak, sahne z konumunu ayarlamak. En iyi sonuçlar için, plaka ile temas yakınında düz hücresel çıkıntılar odaklanın. </li><li> Odaklama için uygun bir aralık içinde olması poz süreleri ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın odaklama ile yardımcı olmak için. Birden XY pozisyonları seçilmişse, her pozisyon için odak ayarı: odak denetimi&gt; XY&gt; ziyaret noktası altında. Not: Bu emin, inci olmak için yapılıralanları doğru bir şekilde optimal bir anlık görüntü için odaklanmıştır. </li><li> Yakalama penceresini parametrelerini ayarlamak için yazılımı kullanın. SlideBook yılında seçerek yakalama açın <img alt="0 Düğme 2 Şekil" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig0btn2.jpg" /> menü çubuğundan. Şekil 2&#39;ye bakınız. Daha sonra aşağıdaki parametreleri kontrol edin. <ol><li> Zaman atlamalı olarak tip&gt; Capture kontrol edin. </li><li> Geniş alanı: DIC (parlak alan görüntü için) Filtre setini kontrol edin. </li><li> &quot;Time lapse yakalama&quot; (bu hücre tipine bağlı olarak değişebilir) Çekilecek zaman noktaları sayısıdır. Süre deney için zaman toplam uzunluğudur. Zaman Birimleri [milisaniye (ms), saniye (s), dakika (m) ya da saat (h)] açılan menüden seçilebilir. </li><li> &quot;Aralık&quot; bir timepoint başında ve sonraki timepoint başlangıcı arasındaki gecikme oluyor. Bu değerlerin iki yazarken, üçüncü alana otomatik olarak hesaplanacaktır. </li><li> Çoklu XY yakalama: &quot;Çok seçin1&#39;den fazla XY pozisyonu için nokta listesi &quot;. </li><li> Dosyayı adlandırın. Verilen örnekte, &#39;bunu &#39;231 adında var. </li></ol></li><li> Nedeniyle birden fazla görüntü için bilgisayarın kapatılması beklenmedik önlemek için, dosyayı kaydetmek için &quot;kuyruk&quot; seçeneği kullanın. Bu isteğe bağlıdır, ancak şiddetle tavsiye edilmektedir. Bu amaçla, yakalama altında contro l&gt; seçin Gelişmiş&gt; Makara&gt; bellek Yakalama ve her zaman geçtikten sonra spool dosyasına kaydedin. Slayt kitap dosyası (Şekil 3) kaydedileceği konumu göz atın. Üretilen film daha sonra belirlenen yere alınabilir. Mikroskop kurulum adımlarla özetlenmiştir <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/Figure_3.1_merged.pdf" target="_blank">dosyası 3.1</a> . </li></ol> 4. Göç Görüntü İşleme ve Analizi: Hız ve Deplasman hesaplanması Bu örnekte, görüntü işleme SlideBo yapılırok 5, 6 5.0 yazılımı. Görüntü işleme ve analiz için böyle ImageJ 7 gibi çeşitli programları vardır. <ol><li> Farklı zaman noktalarında farklı bölgesinin görüntü elde SlideBook dosyalarını. Menü çubuğunda göster&gt; Resim altında&gt; Al&gt; Slayt kitap biriktirme&gt; istediğiniz dosya (Şekil 4a) seçin. </li><li> Burada amaç tek tek hücrelerin hareketini izlemek için. Bu otomatik izleme veya tek tek izleme kullanılarak yapılabilir. Örneğin, biz manuel izleme kullanmış, bu kolaylaştırır yana otomatik takibi ile daha zor olan, kolayca eserler ortadan kaldırılması. </li><li> Bu izleme gerçekleştirmek sahip olduğu SlideBook dosyası, açma. Menüsü altında: Seçiniz Maske&gt; Parçacık Takip Protokolü&gt; Manuel Parçacık Takip Protokolü (Şekil 4b). Bir pencere başlangıç ​​ve bitiş noktaları (Şekil 4c) ile çıkacaktır. </li><li> BegiHer bir hücre (çekirdeği) merkezinde tıklamayı, tek tek hücrelerin hareketini izlemek üzere n. Yaklaşık 30 hücreleri bir deneyden analiz edilecektir, böylece her bir film ile yaklaşık 10 hücreleri ve en az üç farklı filmler takip farklı konumlarda seçilmelidir. Her bir deney üç kez tekrar edilmelidir. Tarafsız bir yaklaşımı sağlamak için, bu tür ön bazı hücreleri gibi farklı yerlerden hücreleri seçin, orta, köşeler vb &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın, bir kez izleme yapılır. </li><li> Rastgele göç menüsü altındaki verileri&gt; seçin maske&gt; parçacık izleme&gt; parçacık izleme protokolü analiz etmek için hız, hız veya yer değiştirme vb değişiklikleri ölçerek analiz edilebilir. (Şekil 5a): Aşağıda açıklandığı gibi takip parametreleri seçin: <ol><li> Ile takip edin - Eğer açılır listeden izlemek istediğiniz parametreyi seçin. Alan bu örnekte, kullandık, Merkez (Ob merkezinin koordinatlarıtabidir). </li><li> &quot;Izlemek ve devam&quot; tıklayın. Izleme tamamlandıktan sonra, bu otomatik olarak bir sonraki adım ilerleyecektir. </li></ol></li><li> Bu tür değiştirme ve ortalama hız (Şekil 5b bakınız) gibi her yolu için istenen istatistikleri, Seçiniz: <ol><li> Ortalama Hız - toplam mesafe bu mesafeyi için gereken süreyi bölünmüş seyahatler. </li><li> Hacmi - nesne tarafından katedilen toplam mesafe. </li><li> &quot;Hesapla ve Devam Et&quot; bir sonraki adıma geçmek istiyorsanız, ya da sadece bir sonraki adıma gitmeden istatistikleri görmek istiyorsanız &quot;Hesapla&quot; seçeneğini tıklayın. Bir dosya metin dosyası olarak kaydedilebilir oluşturulur ve daha sonra Excel ihraç edilebilir. </li></ol></li><li> Otomatik bir izleme protokolü kullanılarak nesneler izlemek için, ilk olarak, bir maske hazırlandı edilmelidir. <ol><li> &gt; Segment Görüntü&gt; bir segment penceresi görünür Maskesi seçin&gt; eşiği elde edilene kadar seçin, öyle ki EylülBaşkalarından bir nesne arating&gt; (Şekil 5c bakınız)&gt; ok geçerlidir tıklayın. Adım 4.5.1 aynıdır. </li><li> Daha küçük nesneleri kaldırın - Seçici belirli bir boyutu daha küçük nesneleri kaldırmak için bu kutuyu işaretleyin. Düzenleme alanında boyutu girin ve birim olarak mikron veya piksel olarak seçin. Bu kalıntı sık neden eşya çıkarmak için kullanılır. </li><li> Minimum hareket - bir yol belirlemek amacıyla izlenmesi gerekir zaman noktalarının asgari sayısını girin. </li><li> Maksimum Hareket - Eğer bir kez noktadan herhangi bir nesneden sonraki beklediğiniz maksimum hareket girin. </li><li> Verileri analiz etmek Adımlar (4.6.2 için adımları 4.5.2 bakınız) manuel izleme aynıdır. </li></ol></li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Rastgele bir geçiş analizi bir örnek olarak hız ve yerdeğiştirme (Şekil 6) cinsinden miktarı. Dosyayı t verdikten sonrao excel, veri bir kutu ve bıyıkları arsa kullanılarak çizilir. Test ve kontrol arasındaki toplam deplasman ve ortalama hız karşılaştırma İstatistiksel analizde Mann-Whitney testi kullanılarak yapılır. Test örneği, kontrol ile karşılaştırıldığında ortalama hızı bir artış gösterir. Test örneği, kontrol ile karşılaştırıldığında toplam hacmi bir artış gösterir. Kontrol ve test Movie: Kontrol MDA-MB-231 ve test MDA-MB-231 hücrelerinde gece kollajen üzerine ekildi. Zaman atlamalı video mikroskopi, mikroskop tarafından yapılan bir EM-Hamamatsu kamera birleştirilmiştir. Görüntüler rastgele göç sırasında 18 saat olmak üzere toplam 1 saat arayla alınır. Film 1, kontrol ve test örnekleri için rastgele göç Movie 2 bakınız. Mikroskop kurulum: <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig1.jpg" /> Şekil 1. Resim için birden fazla puan ayarlama<html> yakalamak. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig2.jpg" /> Şekil 2. Çekim denetimi betimleyen Adımlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585fig2large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig3.jpg" /> Şekil 3. Nasıl birden fazla görüntü kaydetmek için. &quot;dflinebreak&gt; Göç Görüntü işleme ve analizi. <img alt="Şekil 4a" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig4a.jpg" /> Şekil 4a. Veri analizi için görüntü almak için adımlar. <img alt="Şekil 4b" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig4b.jpg" /> Şekil 4b. Parçacık izleme protokolü kullanılarak veri analiz adımları. <img alt = &quot;Şekil 4c&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3585/3585fig4c.jpg&quot; /&gt; Şekil 4c. Paletli parçacıkların Pencere betimleyen yol uzunluğu. Veri analizi Adımlar. <img alt="Şekil 5a" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5a.jpg" /> Şekil 5a. Parçacık izleme protokol parametreleri gösteren adımlar. <img alt="Şekil 5b" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5b.jpg" /> Şekil 5b. Analiz edilecek yolu istatistikleri seçimi. <img alt="Şekil 5c" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5c.jpg" /> Şekil 5c. Otomatik izleme protokolü için maske oluşturmak için Adımları. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig6.jpg" /> Şekil 6. Ortalama hız (Şekil6a) ve deplasman (Şekil 6b) bir bıyıkları arsa çizilir. Kontrol etmek karşılaştırmak gibi test örneği hız ve yer değiştirme bir artış göstermektedir. Filmler Film 1. Kontrolü hücrelerin Göç. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585movie1.avi" target="_blank">filmi görmek için buraya tıklayın</a> . Film 2. Test hücrelerin Göç. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585movie2.avi" target="_blank">filmi görmek için buraya tıklayın</a> . Kontrol MDA-MB-231 ve test MDA-MB-231 hücreler gece boyunca kolajen üzerinde seyrek ekilmiştir. Zaman atlamalı video mikroskopi, mikroskop tarafından yapılan bir EM-Hamamatsu kamera birleştirilmiştir. Görüntüler rastgele göç sırasında 18 saat boyunca 1 saat arayla alınır. Kontrol ve test için rastgele göç filmleri bakınız.

<ol><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+a+physically+integrated+molecular+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84, 359-369 (1996).</li>
<li>Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+integrating+signals+from+front+to+back%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302, 1704-1709 (2003).</li>
<li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+versus+directionally+persistent+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).</li>
<li>Valone, F. H., Austen, K. F., Goetzl, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+random+migration+of+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Modulation of the random migration of human platelets.</a> J. Clin. Invest. 54, 1100-1106 (1974).</li>
<li>Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+speed+comparison+of+microscope+software+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Acquisition speed comparison of microscope software programs.</a> Microsc. Res. Tech. 74, 539-545 (2011).</li>
<li>Struckhoff, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+ROCK+in+tumor+cells+controls+CXCR4-driven+adhesion+events%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of ROCK in tumor cells controls CXCR4-driven adhesion events.</a> J. Cell. Sci. 123, 401-412 (2010).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophoton.+Internat%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophoton. Internat. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Tyl Hewitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+collagen+and+fibronectin+in+neural+crest+cell+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration.</a> Dev. Biol. 87, 259-266 (1981).</li>
<li>Albini, A., Sporn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumour+microenvironment+as+a+target+for+chemoprevention%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The tumour microenvironment as a target for chemoprevention.</a> Nat. Rev. Cancer. 7, 139-147 (2007).</li>
<li>Yu, Y. P., Luo, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myopodin-mediated+suppression+of+prostate+cancer+cell+migration+involves+interaction+with+zyxin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Myopodin-mediated suppression of prostate cancer cell migration involves interaction with zyxin.</a> Cancer. Res. 66, 7414-7419 (2006).</li>
<li>Teng, T. S., Lin, B., Manser, E., Ng, D. C., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+promotes+directional+cell+migration+by+regulating+Rac1+activity+via+its+activator+betaPIX%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Stat3 promotes directional cell migration by regulating Rac1 activity via its activator betaPIX.</a> J. Cell. Sci. 122, 4150-4159 (2009).</li>
<li>Wozniak, M. A., Kwong, L., Chodniewicz, D., Klemke, R. L., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-Ras+controls+membrane+protrusion+and+cell+migration+through+the+spatial+regulation+of+Rac+and+Rho%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">R-Ras controls membrane protrusion and cell migration through the spatial regulation of Rac and Rho.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 84-96 (2005).</li>
<li>Orr, A. W., Elzie, C. A., Kucik, D. F., Murphy-Ullrich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin+signaling+through+the+calreticulin%2FLDL+receptor-related+protein+co-complex+stimulates+random+and+directed+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin signaling through the calreticulin/LDL receptor-related protein co-complex stimulates random and directed cell migration.</a> J. Cell Sci. 116, 2917-2927 (2003).</li>
<li>Smith, A., Bracke, M., Leitinger, B., Porter, J. C., Hogg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LFA-1-induced+T+cell+migration+on+ICAM-1+involves+regulation+of+MLCK-mediated+attachment+and+ROCK-dependent+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">LFA-1-induced T cell migration on ICAM-1 involves regulation of MLCK-mediated attachment and ROCK-dependent detachment.</a> J. Cell Sci. 116, 3123-3133 (2003).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Gerçek zamanlı rastgele göç testi gibi hız ve yer değiştirme gibi hücre göçü parametrelerin doğru, duyarlı, analiz sağlar. Bu yöntem, nokta ölçüm değeri sonuna kadar sınırlı değildir, dolayısıyla daha nicel olduğunu. Bu yana, hücreler serumu ile normal bir DMEM ortam izlenir; serum boş ortam içinde uzun inkübasyon zararlı etkilerini azaltır. Bu, hücre göçü biçimlendirme ve böylece, bu yöntem, migrasyon farklı sübstrat etkisini araştırmak için kullanılan olabilir alt tabaka 8 ile temas hücre kopma bağlı olduğu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> İkizler Bio-Ürünler </td><td> 100-106 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-Mem </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajen </td><td> BD </td><td> 354231 </td><td></td></tr><tr><td> Canlı Hücre odası &amp; Otomatik XY kontrolörü ile Mikroskop </td><td> Olympus </td><td> Olympus 1X81 </td><td></td></tr><tr><td> Çevre kontrol odası </td><td> Neue </td><td> Neue Canlı Hücre Odası </td><td> Bizimki odasının üstü ile uygun optikler için özel inşa edilmiş dikdörtgen cam levha üst vardır. Dikdörtgen şeklindeki bizim deneysel bir çok kullanılan çok oyuklu plakalar barındırırts. </td></tr><tr><td> Otomatik XY </td><td> Önce </td><td> Önce ProScan </td><td> Bu kesin dönüş time lapse mikroskopi sırasında seçilen XY pozisyonu çarpma sağlar. </td></tr><tr><td> Kamera </td><td></td><td> Hamamatsu EM kamera C9100 </td><td></td></tr><tr><td> Yazılım </td><td> Genellikle, bu tür Olympus gibi mikroskop satıcı aracılığıyla satın </td><td> Slayt Kitabı 5 </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse video mikroskop ile hücrelerinin rastgele göç kantitatif analiz

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Hücre göçü embriyonik gelişme, doku onarımında, bağışıklık sistemi fonksiyonu, ve tümör invazyonu 1, 2 önemli dinamik bir süreçtir. Yönsel, geçiş sırasında hücreleri bir hücre dışı kemotaktik sinyaline yanıt olarak, ya da bazik motilitesi makine tarafından sağlanan intrinsik kuyrukları 3 yanıt olarak hızlı bir şekilde hareket eder. Bir hücre hücrelerin kendi yerel ortamında keşfetmek için izin, düşük içsel yönü sahip olduğunda Rastgele göç oluşur. Hücre göçü ilk tepkisi hücre, kompleks bir süreçtir polarizasyon uğrar ve göç 2 yönünde çıkıntılar uzanır. Böyle Boyden çemberinin göç deneyi olarak göç ölçmek için geleneksel yöntemleri bir bitiş noktası sonucu olarak göç ölçüm sağlayan in vitro, in kemotaksis ölçmek için kolay bir yöntemdir. Ancak, bu yaklaşım ne bireysel göç parametrelerin ölçümünü sağlar, ne de visua izin vermezhücre göçü sırasında uğradığını morfolojik değişikliklerin Harp öncesi devresi. Time lapse mikroskopi - Burada, bize video kullanarak gerçek zamanlı olarak göç hücreleri izlemeye olanak sağlayan bir yöntem sunuyoruz. Hücre göçü ve işgali kanseri işaretlerinden olduğu için, bu yöntem in vitro kanser hücre göçü ve işgali okuyor geçerli olacaktır. Trombositlerin Rastgele göç trombosit fonksiyonu 4 parametrelerinden biri olarak kabul edilmiştir, dolayısıyla bu metod aynı zamanda trombosit fonksiyonlarının incelenmesinde yararlı olabilir. Bu testte, hızlı, güvenilir, tekrar üretilebilir olma avantajına sahiptir, ve hücre sayısı optimizasyonu gerektirmez. Hücrelerin fizyolojik olarak uygun koşullar muhafaza etmek amacıyla, mikroskop CO 2 kaynağı ve sıcaklık termostat ile donatılmıştır. Hücre hareketi düzenli aralıklarla mikroskop takılan bir kamera ile fotoğraf çekerken tarafından izlenir. Hücre göçü ölçüm ortalama hız ve hesaplanabilirSlidebook yazılımı ile hesaplanır verage yer değiştirme,.

Bu yöntem gerçek zamanlı ve bu hız, yer değiştirme ve hız gibi farklı hücre göçü parametrelerinin nicel ölçümleri hücrelerin izlenmesine olanak sağlar. Geleneksel yöntemlerin aksine, bu gerçek zamanlı bir yaklaşım uç kantitatif göç ölçümlere dayalı değildir, bunun yerine izlenmesi ve sürekli farklı parametreler hesaplanarak sağlar.

Time-lapse video Mikroskop ile Hücrelerinin Rastgele Göç Kantitatif Analiz

Hücre göçü; embriyonik gelişim, doku onarımı, bağışıklık sistemi fonksiyonu ve tümör invazyonu için önemli, dinamik bir süreçtir 1, 2. ... boyunca

Aşağıdaki deneyin genel amacı, video zaman atlamalı mikroskopi kullanarak hücrelerin migrasyonunu gerçek zamanlı olarak nicel bir şekilde ölçmektir. Bu işlem, önce altı kuyucuklu bir kültür plağının kolajen ile kaplanması ve ardından ilgili hücrelerin kaplı plağa seyrek bir şekilde ekilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, migrasyon için yeterli alan sağlamak amacıyla bir pipet ucu kullanılarak plak üzerinde bir yara oluşturulur.Ardından, göç eden hücrelerin gerçek zamanlı olarak sürekli izlenmesine olanak sağlamak için bir sıcaklık kontrol sistemi kullanılarak mikroskop kurulumu yapılır ve düzenli aralıklarla görüntüler alınır. Son olarak, test ve kontrol hücrelerinin ortalama hızları ve toplam yer değiştirmelerindeki farkları değerlendirmek için partikül izleme protokolü kullanılır. Bu tekniğin, kaçınma odası göç deneyi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, nihai nokta kantitatif göç ölçümlerine dayanmıyor olmasıdır.Bunun yerine, farklı parametrelerin sürekli olarak izlenmesine ve hesaplanmasına olanak tanır. Bu yöntem, kanser biyolojisi alanındaki belirli genlerin veya ilaçların tümör hücresi migrasyonunu nasıl etkilediği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımc

quantitative-analysis-random-migration-cells-using-time-lapse-video

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tek boyutlu bir kapalı mikro hücrelerin spontan göç incelemek için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, mikrofabrike kanalları yararlanır ve tek bir deneyde, farklı koşullar altında hücrelerin büyük sayıda göçünü incelemek için kullanılabilir.

Microfabricated Kanallar Hücre Göç Çalışması

Hücre göçü, bir kanser gibi yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkilerinin ve patofizyolojik süreçler gibi, fizyolojik bir bolluk dahil bir biyolojik bir olgudur. 3D-kollajen matris göç deneyi 3D fizyolojik gibi bir ortamda içinde farklı hücre tipleri göç özelliklerini analiz etmek için çok yönlü bir araçtır.

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

Hücre nakli, hücre iskeleti etiketleme ve fonksiyon kaybı/kazanımı yaklaşımlarını birleştiren bu protokol, göç eden zebra balığı prospektif prekordal plağın, in vivo hücre göçünde bir aday genin işlevini analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücresi (HUVEC) kültürü için protokoller, mikrotübül büyümesinin floresan işaretli belirteçlerinin geçici transfeksiyonu, canlı hücre görüntüleme ve interfaz mikrotübül büyüme dinamiklerinin otomatik analizi detaylandırılmıştır.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

Bu protokol, aynı zamanda, bir polimer matrisi üzerinden bir ilacın difüzyon hızını belirlemek için kullanılabilir chemoattractants yanıt olarak hücre göçü ölçmek için özelleştirilebilir yöntemi göstermektedir.

Ölçme Hücre Göç Bir Özelleştirilebilir Odası

Objektif-ücretsiz video mikroskobu hücre kültürleri doğrudan kuluçka makinesi içinde izlemek sağlar. Burada biz almak ve kültürlü HeLa hücreleri 2,7 gün uzun edinimi çözümlemek için kullanılan tam iletişim kuralı tanımlamak, 2.2 x 10 bir veri kümesi için önde gelen6 ölçümleri tek hücre morfolojisi ve 10584 hücre döngüsü izler.

Dinamik için objektif-ücretsiz Video mikroskobu ve kantitatif analiz yapisan hücre kültürü

Uyuyan ve aktif kanser hücre fenotipleri nicel faz Imaging'i kullanma ile karakterize. Hücre çoğalması, geçiş ve Morfoloji deneyleri entegre ve basit bir yöntem ile analiz edildi.

Hızlandırılmış, etiket içermeyen, nicel faz uyuyan ve aktif insan kanser hücrelerinin çalışma görüntüleme

Marjinal zon B hücreleri (MZBs) kesme akışı gücüne geçiş yollarına kadar debi yeniden yönlendirme tarafından yanıt. Bu iletişim kuralı, kayıt ve analiz akışkanlar birim, pompa, mikroskop görüntüleme sistemi ve özgür yazılım kullanarak geçiş gösterilmiştir.

Yamultma akış kaynaklı geçiş antikorundan marjinal bölge B hücrelerinin in Vitro analizine

Bu prosedür, Acanthamoeba spp.'  nin nasıl görselleştirileceğini, izleneceğini ve ölçüleceğini açıklar.Motilite.

Acanthamoeba spp.'nin miktar tayini Motilite

Bu protokol, kantitatif analiz ile belirli çevresel koşullar altında primer murin T hücresi izolasyonu ve T hücresi göçünün hızlandırılmış mikroskobu için bir yöntem sağlar.

Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi

Bu protokol, makrofaj morfodinamiğinin gerçek zamanlı görüntülemesi ve nicel analizi için etiketsiz optik kırınım tomografisi tabanlı bir iş akışını tanımlar. Bu yöntem, tek hücre morfolojisi ve göçünün sürekli izlenmesini sağlar ve uzun vadeli canlı hücre görüntüleme sırasında projeksiyon alanı, çevresi ve ortalama göç hızının zaman çözünçüsüyle ölçümlerini sağlar.

Gerçek Zamanlı Etiketsiz Görüntüleme ve Makrofaj Morfodinamiğinin Optik Kırınım Tomografisi Kullanılarak Nicel Analizi

Öğrenin, hücre göçünü zamana bağlı video mikroskobu ile gerçek zamanlı olarak niceliksel analiz etme yöntemini. Bu teknik, sürekli izleme sağlayarak hız ve yer değiştirme gibi parametreleri ölçer.

Time-lapse video Mikroskop ile Hücrelerinin Rastgele Göç Kantitatif Analiz

Daha fazla video keşfet