Name: Numune Hazırlama Mycobacterium tuberculosis özler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Öğrenin Mycobacterium tuberculosis metabolomik profilini NMR metabolomik kullanarak analiz etme yöntemini. Hücre kültürü, lizis ve spektrum analizi ile metabolit düzeylerindeki değişiklikleri belirleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar protokolü geliştirirken yararlı yorumlar için Dr Barletta ve Dr Güçlerin laboratuvarlarının tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Biz el yazması yararlı tartışmalar ve redaksiyon için Wendy Austin ederim. Bu yazıda anlatılan çalışma Nebraska-Lincoln Redoks Biyolojisi Merkezi (ebeveyn hibe # NCRR 2P20RR 017675, D. Becker, PI) University of Yukarıda listelenen her bir araştırmacı için tohum Pilot hibe tarafından finanse edildi. Ayrıca, araştırma malzemeleri ve bu yayına dahil NMR teknikleri standardize Bay Halouska en kısmi maaş desteği için ona R21 hibe (1R21AI087561-01A1) fon sağlamak için Dr Ofelia Chacon ederim.

1. Protokol Metni Bu protokol M. NMR metodolojisinin adaptasyonu vurgulamaktadır Tüberküloz (Sınıf III ajan). M. yaparken nedenle, Biyogüvenlik Seviyesi 3 (BSL3) uygulamaları takip edilmesi gereken bir yıllık sertifikalı laboratuvarda tüberküloz araştırma. Laboratuvar tarafından oluşturulan aerosoller Maruziyet bu mikroorganizmalar ile çalışan personel tarafından karşılaşılan en önemli tehlikedir. Aşağıdaki yordamlar Kurumumuzda yürütülen ve varyasyonları Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi&#39;nin önerilerine dayanarak mevcut olabilir. Ortak personel koruyucu ekipman, bir Tyvek elbise, kabarık kap, patik, N95 solunum, göz koruma, kollu ve nitril eldiven bir çift çifti oluşacaktır. M. içeren çalışın Açık M. tüberküloz kültürü ve / veya manipülasyon tüberküloz konteyner tipi A2 veya B2 biyolojik güvenlik kabininde yapılır. Plastik-kaplı emici kağıt w üzerine yerleştiriliryüzey akıcı iş. Bertaraf veya tesis kaldırılacak tüm malzemeler / gereçler iki biohazard torba yerleştirilir ve otoklavlanarak dekontamine edilmelidir. Çalışma yüzeyleri ve dolap (FastPrep-24 lizis homojenizatör, spektrofotometre, buz kovası, vb) içinde kullanılan ekipmanlar 1% Amphyl (tüberkülsit, bakterisid fungusid ve virüsidal ajanı) ile her çalışma oturumundan sonra dezenfekte edilmelidir. M. tüberküloz kültürleri gibi dondurucu, inkübatör, santrifüj, ve buzdolabı gibi biyolojik güvenlik kabini dışında bulunan büyük ekipman ulaşım için çifte altına alınmalıdır. Santrifüj kapalı güvenlik kapları ve O-ring vida üst tüpleri ile yapılır. BSL3 laboratuar dışında ileri analiz için, hücre içermeyen özler 15 dakika süreyle 95 ° C de öldü 0.2 um bir filtreden veya mikroorganizmalar ısı ile filtre edilir. 2 numuneler önce çevreleme kaldırılması için koloni oluşturan birim yokluğunda doğrulamak için kaplanır. <ol><li> 110 Polisorbat 80 (Tween 80 topaklanma önlemek için) içeren Middlebrook 7H9 ortamı ml tam çorbası (mA DC-TW) ya da bir 250 ml Erlenmeyer şişesi için uygun bir ortam. Aktarma C-metabolitler 13 kullanırken üç kat kültürlerinin rutin durum başına yetiştirilen ve on özdeş kültür 1D 1H NMR profilleme için yetiştirilir. Iki koşula (örneğin, ilaç ilavesi ile ve olmadan) çoğaltmak başına kültürünün çift hacmi büyüdü ve iki özdeş kültürlere ayrılabilir için. Bütün reaktif ve çözelti tarifleri protokolünün sonunda sağlanmaktadır. </li><li> M. 0.150 ml broth inoküle tüberküloz% 50 gliserol stoku (buz çözülmesini sağlar). Aşağıdaki 1. Not bakınız. </li><li> Kültürü 37 büyümesine izin ver ° C&#39;de yaklaşık 6 gün (OD 600 0.6-0.8) 100 rpm&#39;de sallayarak. Aşağıdaki Not 2&#39;ye bakınız. </li><li> Hiçbir antibiyotikler, alternatif eklemeler veya diğer tedaviler gerekiyorsa, kültürler hasat edilmeye hazırdır. Tedaviler kullanıldığında, devamdoğrudan 5. adıma. Kirlenme testleri, fenotipik analizi, PCR testleri: Her balona bir 0.5 ml örnek kaldır, 4 bir mikrosantrifüj tüp ve yerde ° kültürü titrasyon ve kalite kontrolü için C aktarmak. Aşağıdaki Not 3&#39;e bakınız. Bu noktada, 6. Aşamaya geçin. </li><li> Sallantıyı matara çıkarın ve istenen tedavi (örn., ilaç ya da metaboliti ekleyin) gerçekleştirin. Sıra bir ek süre (örneğin, 6-18 saat) için çalkalayıcı ve inkübe geri şişelerde. Bu sürenin sonunda, diğer bir 1.0 ml bir örnek alır ve OD 600 belirler. Her balona bir 0.5 ml örnek kaldır, 4 bir mikrosantrifüj tüp ve yerde ° kültürü titrasyon ve kalite kontrolü için C aktarmak. </li><li> 5 dakika buz üzerine yerleştirin kültürler. Bu adımdan sonra, geriye kalan bütün protokol boyunca buz üzerinde hücreleri bırakın. Hasat 2,000 x g&#39;de ve 4 de santrifüj ile kültür ° C&#39;de bir tezgah üstü santrifüj kullanılarak 50 ml tüp içinde 15 dakika için. Her bir kültür 25 ml her biri (1 toplam dört tüp gerektirir00 ml 2B 1 için yeterli bir sinyal-gürültü elde etmek için gerekli olan H-13 C kültür başına 50 ml 1D 1 H NMR deneyleri için gerekli NMR deneyleri). </li><li> Yukarıda anlatılan parametrelere göre santrifüj buz-soğuk GKD 2 O (yaklaşık olarak 15 mi, ilk kez ve 10 ml ikinci kez) ile her bir hücre peleti iki kez yıkayın. İkinci yıkama için iplik önce aynı tüp içine 10 ml alikotları birleştirir. 1.0 ml GKD 2 O (hücre peleti hacim için ayarlamak için gereken) bir nihai hacim içinde hücre pelet yeniden süspanse edin. Yığınlaşma serbest tek bir hücre süspansiyonu bu aşamada arzu ediliyorsa, kısa bir süre için sonike edilmiş hücreler ve / veya bir 27 gauge iğneden üç kez geçirildi edilebilir. Alternatif olarak, hücre peleti -80 ° C de donduruldu ve daha ileri işleme kadar saklanabilir. İkinci durumda ise, dondurulmuş pelet yeniden süspanse edilmesi için önce buz üzerinde çözülmüş edilir. Yukarıda belirtildiği gibi 1.0 ml GKD 2 O değerindeki bir son hacim içinde, hücre topakları yeniden süspanse edin. </li><li> TransfeParçalama Matris B (0.1 mm silis küreler) ihtiva eden 2.0 ml bir vidalı kapak tüp için r, 1.0 ml hücre süspansiyonu. Biyogüvenlik kabini içindeki FastPrep-24 lizis homojenizatör yerleştirin. Tutma tüpün üstünde plaka konuştu güvence, numune tutucu içine örnekleri koyun. 6 metre / saniye hız ayarında homojenleştiricide 60 sn örnekleri işleyin. </li><li> 15.000 x g&#39;de ve 4, bir mikrosantrifüj içinde örnekleri döndürme ° C&#39;de pellet hücre artıkları ve sağlam hücreler 10 dakika için. </li><li> Steril bir tüp içine bir şırınga filtresi (0.2 mikron) ile süpernatant ve geçiş örnek çıkarın. MA DC agar üzerinde numune Plate 0.1 ml (% 10 veya örnek olarak örnek bir temsilcisi fraksiyonu) hiçbir canlı hücre olduğunu doğrulamak için. Araştırmacılar ayrıca, birden fazla filtrasyon adım yapmak ve / veya herhangi bir potansiyel biyogüvenlik endişeleri önlemek veya belirlemek amacıyla canlı-ölü boyama prosedürleri kullanarak özler canlı hücrelerin varlığını doğrulayabilir. Depolamak için bir madde, etanol-kuru buz banyosu içinde örnekleri Dondurarak-80 ° C de bir NMR tesiste liyofilize ve işlenebilir hazır oluncaya kadar. </li><li> 2 ay sonra, koloni oluşturan birimlerin yokluğu doğrulamak için plakaları kontrol edin. Hiçbir CFU en bulunursa, örnekleri BSL3 laboratuar dışına alınabilir. Diğer analizler normal olarak çoklu kullanıcı sunmaktadır ve herhangi bir özel önleme şartları altında çalışan bir standart NMR odası içinde gerçekleştirilir. </li><li> Kuruyana kadar Lyophilize numuneleri, daha sonra NMR tampon ve bir mikrosantrifüj tüpüne transfer 0.7 ml içinde tekrar süspansiyon haline getirin. 13,000 x g&#39;de 3 dakika boyunca santrifüjleyin. 0.6 ml ve 5 mm NMR tüpü transfer çıkarın. Alternatif olarak, liyofilize örnekleri olmayan biyozararli düzenli örnekleri gibi harici tesisine gönderilecek olabilir. </li><li> NMR verileri hemen toplanır. Tüm önlemlere rağmen, aktif enzimler hala mevcut olabilir ve örnek uzun süre için genellikle istikrarlı değildir. Örnekler m ° C ila oda sıcaklığında ve 4 &#39;te dışında kaldığında NMR spektrum değişiklikler belirgin hale gelmektedirler1 hafta daha cevher. Ayrıca, NMR veri toplama örnekler rastgele her kategoride seçilen tedavi ve ilaç tedavi kültürler arasındaki izliyor. NMR spektrumları toplanmıştır önce belirli bir kategoriye daha uzun bir gecikme vardı çünkü bu gereksiz önyargı önler. Tüm işlem görmemiş örnekler için NMR spektrumu, ilaç tedavisi örnekleri birinci toplanmış ve daha sonra takip edildi eğer veri bir sapma meydana gelmektedir. Örnekler hemen NMR ile analiz edilmesi mümkün değilse, numuneler -80 ° C&#39;de 1 ml Eppendorf tüpleri saklanmalıdır </li><li> Örneğin, kilit, şim, ayar ve 90 ° darbe uzunluğu optimizasyonu gibi birkaç rutin adımları içeren bir BACS-120 numune değiştirici, cihaz kalibrasyonu, içine numune yerleştirdikten sonra sonuçların kalitesini en üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Tek bir numune 90 ° nabız süresini ayarlamak ve kalan numuneler için araç ayarlamak için kullanılır. Kilitleme shimming ve her örnek için NMR veri toplama otomatik istimal olduğunug ICONNMR ve gradshim. </li><li> A 1D 1H NMR spektrumu uyarma heykel kullanarak su bastırmalı Bruker zgesgp puls sekansı kullanılarak toplanır. 32k veri 5482.5Hz bir süpürme genişliği ile puan, 128 taramalar ve 16 kukla taramaları toplam kullanılmaktadır. A 2D 1 H-13 C HSQC spektrum Bruker hsqcetgp puls sekansı kullanılarak toplanır. 5000.0 Hz süpürme genişliği ile 2048 veri noktalarının toplam doğrudan 1 H boyut boyunca toplanan ve dolaylı 13 C boyut boyunca 18864,9 Hz süpürme genişliği ile 64 veri noktaları edilir. Spektrum gürültü sinyali iyi almak için 128 taramalar ve 16 kukla taramaları ile tahsil edilir. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3673/3673fig1.jpg" /> Şekil 1. Deneysel prosedür bir akış şeması tasvir edilmiştir. NMR tamponu 50 mM potasyum fosfat, soluk sarı stok solüsyonu50 uM TMSP ile er: <ul><li> 2.17 g K 2 HPO 4 (potasyum fosfat dibazik) </li><li> 1.70 g KH 2 PO 4 (potasyum fosfat tekbazlı) </li><li> 7.86 mg Sodyum-3-Trimethylsilylpropionate (TMSP-2 ,2,3,3-D 4 (D,% 98)) </li><li> &quot;100%&quot; D 2 O 500 ml suda eritilir </li><li> Nihai çözüm pH 7.2 (düzeltilmemiş) olmalıdır </li></ul> MA DC-TW veya MOADC-TW (1 L) <ul><li> 4.7 g Middlebrook 7H9 broth base </li><li> 900 ml GKD 2 O </li><li> 2 ml gliserol </li><li> 25 dakika boyunca kısımlar ve otoklav karıştırın. : Aşağıdaki çözümler dokunun ve eklemek için serin sıvı </li><li> 100 ml ADC MOADC hazırlanmasında mA DC veya 100 ml OADC hazırlanmasında </li><li> 2.5 ml% 20 Tween 80 (alternatif olarak, non-metabolik% 20 Tyloxapol 1 ml) </li><li> 10 ml% 1 sikloheksimid </li></ul> ADC (1 L) <ul><li> 20 g D (+)-glikoz </li><li> 50 g BSA FraksiyonuV </li><li> 8.5 g NaCl </li><li> 800 ml GKD 2 O </li><li> Birlikte eritilir hacmi 1 L uyum ve 0.2 mikron filtre ile sterilize edin. 4 ° C&#39;de depolayın </li></ul> Alternatif olarak, OADC (1L) hazırlamak için% 1 oranında oleik asit (aşağıda tarif 250 mL&#39;lik bir toplu hale getirir) artı 50 ml yukarıda listelenen tüm bileşenlerini ekleyin. Birlikte eritilir hacmi 1 L uyum ve 0.2 mikron filtre ile sterilize edin. Şişe 4 ° C&#39;de alüminyum folyo ve mağaza sarılmış gerekmektedir <ul><li> 2.5 g Oleik Asit </li><li> 250 ml 0.2 M NaOH </li><li> 55 ısı ile Çözünme oleik asit (soğutma üzerine katılaşan) ° 10 dakika ve 60 dakika için karıştırma ile NaOH çözeltisi ve ısı ile eklemek için C&#39;dir. Alüminyum folyo ile sarılmış steril cam şişelerde saklayın. 4 at parafilm ve mağaza ile Seal şişeleri ° C. </li></ul> Tercih ederseniz, katalaz Zenginleştirme ile ticari BD BBL Middlebrook ADC veya OADC satın alabilirsiniz. % 1 Sikloheksimit (100ml) </strong&gt; <ul><li> 1 g sikloheksimid </li><li> 100 ml GKD 2 O </li></ul> Çözülür ve 0,2 mikron filtre ile sterilize edin. 4 ° C&#39;de depolayın Dikkat: sikloheksimid son derece dikkatle ele kadar zehirli olduğunu. % 20 (v / v) Tween 80 (100ml) <ul><li> 20 ml Tween 80 </li><li> 80 ml ​​GKD 2 O </li></ul> % 20 w / v çözelti hazırlamak için, alternatif olarak, Tween 80 ve 20 g (yoğunluk 1.06 g / mL, yaklaşık 18.9 ml) tartın. 55 Isı çözümü ° C 30 dk erimesi ve tamamen karıştırmak için. Bir 0.2 um filtre ile sterilize sıvı. Oda sıcaklığında nihai çözelti saklayın. % 20 (v / v) Tyloxapol (100ml) <ul><li> 20 ml Tyloxapol </li><li> 80 ml ​​GKD 2 O </li></ul> % 20 w / v çözelti hazırlamak için; Alternatif olarak, Tyloxapol 20 g (yoğunluğu 1,1 g / mL, yaklaşık 18.2 ml) tartın. Di için 30 dakika için 55 ° C ısıya çözeltissolve ve tamamen karıştırın. Bir 0.2 um filtre ile sterilize sıvı. Oda sıcaklığında nihai çözelti saklayın. Not 1: M. Gliserol stokları tüberküloz aşağıdaki protokol kullanılarak hazırlanmıştır. M. Stoklama tüberküloz <ul><li> M. büyütün doygunluk 50 ml mA DC tüberküloz (OD 600 = 1.5 ila 2.0) 37 ° C sallayarak koşulları (100 rpm) altında. Suşu bağlı olarak, bu 7-14 gün sürer. </li><li> Pelet kültür için 15 dakika için 4 ° C&#39;de 2.000 x g&#39;da örnekleri Spin. Süpernatantı. </li><li> Steril% 50 gliserol 6 ml süspanse edin. </li><li> 4 Corning kriyojenik şişeleri ve etiket uygun içine tablet 1,5 ml. </li><li> -80 Etanol / kuru buz banyosu ve mağaza hemen flaş dondurma şişeleri ° C. </li></ul> Not 2: aşılamak suşu H37Rv (-80 ° 1,5 yaşında C stok) mA DC medya 70 mL &lt;bir OD 600 verir/ Bir Innova 40 Shaker sallayarak koşullar (100 rpm) altında 37 ° C&#39;de büyüme 5 gün sonra yaklaşık 0,6 alt&gt;. Not 3: kültür kontaminasyon test etmek için, araştırmacılar standart zengin ortam üzerine bir kültür kısım aşılamak ve gecelik inkübasyon sonrası büyüme yokluğu doğrulamak olabilir. Rutin, kültürleri koloni morfolojisi gözlemlemek ve faz-kontrast mikroskop ile incelenmesi mA DC agarda kaplanır. Açıklandığı gibi İsterseniz, kültürler PCR kullanılarak doğrulanabilir 6110 primerler IS. 3 2. Temsilcisi Sonuçlar Da hazırlanmış olan bir örnek, Şekil 2&#39;de tasvir edilen bir benzer bir NMR tayfı elde edilir. Bu spektrum, M. bir temsilidir; tüberküloz vahşi tip metabolik havuzu. Metabolitleri, doğrudan ya da dolaylı olarak, D-alanin yolu ile ilişkilidir. Ayrıca, zirve yoğunlukları büyüklüğü metabolit konsantrasyonları ile orantılıdır sunmakhücre özü. Bu nedenle tedavi kültürleri, ilaç tedavisi ve mutant suşlar arasındaki pik şiddetleri değişiklikleri metabolitleri ve metabolik yollar tedirginlikler gösterebilir. M. tüberküloz 1D 1 H NMR spektrası, bir üçlü-rezonans, Z-eksenine gradyanı kriyoprob ile donatılmış bir Bruker Avance 500 MHz spektrometre üzerinde elde edilmiştir. Spektrumu ca içerir. Bu amino asitler, nükleotid öncülleri ve glikolitik ve sitrik asit ara dahil olmak üzere 40-50 metabolitleri tanımlamak ve ölçmek mümkün olduğu 400 zirveleri. İkon Bruker yazılımı ile birlikte bir BACS-120, numune değiştirici NMR verileri toplama otomatikleştirmek için kullanılmıştır. 1D 1 H NMR spektrumları verimli (sonraki temel bileşenler analizi (PCA) veya dikey kısmi en küçük kareler diskriminant analizi eserler indükleyebilir temel koleksiyon için herhangi bir ihtiyacı ortadan kaldırarak, düz taban çözücü kaldırmak ve korumak için uyarma heykel 4 kullanılarak toplanmıştır OPLS- DA). A 1D 1 H-NMR spektrumu 5482,5 Hz ve 32K veri noktaları bir spektrum genişliği 25 ° C &#39;de toplanmıştır. 16 kukla taramaları ve 128 taramalar toplam spektrum elde etmek için kullanılmıştır. ACD Labs 1D NMR işlemci yazılım yarı-otomatik olarak her 1D 1 H NMR spektrumu işlemek için kullanıldı. Spektrumu Fourier, dönüştürülmüş aşamalı ve TMSP tepe (0.0 ppm) başvurulan idi. NMRpipe yazılım paketi, tek tek 2B 1 H-13C NMR spektrumları işlemek için kullanılan ve NMRDraw ile analiz edilmiştir. Bruker FID veri dosyasının ilk NMRpipe tarafından tanınabilir bir dosya biçimine dönüştürülür ve ardından spektrumu Fourier dönüştürüldü, faz düzeltilmiş ve sıfır doldurdu. 1D 1H NMR spektrumu ve 2D 1 H-13C NMR spektrumunda gözlenen NMR zirvelerinin 1 H ve sırasıyla 0.05 ve 0.50 ppm, 13 C kimyasal kayma toleranslar ve Madison Metabolomik Konsorsiyumu Veritabanı (MMCD kullanarak belirli metabolitlerin atanan ) <sup&gt; 5 BioMagResBank, 6 ve İnsan Metabolome Veritabanı. Özellikle 7, 1D ve 2D NMR spektrumları NMR kimyasal vardiya pik liste daha sonra İnsan Metabolome Veritabanı yüklenen nerede, elle pik toplanmış bulunmaktadır. İnsan Metabolome Veritabanı tarafından tanımlanan metabolitleri NMR rezonansı eşleşen ve metabolik ağa mensup sayısını maksimize hem esas NMR spektrumu atanır. Her bileşik veya metabolit genellikle birden CH çiftleri ve buna birden NMR rezonansı vardır. Bu nedenle deneysel NMR spektrum gözlenmiştir, bu NMR rezonansı ve daha çok, daha çok metaboliti bulunmaktadır. Benzer şekilde, aynı yol ile ilişkilendirmek birden metabolitleri tanımlamak doğru atamaları olasılığını artırır. Metabolitleri ve metabolik yolların varlığı Genlere ve genoma (KEGG) 8 Kyoto Ansiklopedisi ve MetaCyc veritabanları ile doğrulanır. 9 Mycobacterium smegmAtis M. için kullanışlı bir model sistemi tüberküloz ve diğer mikobakteriyel patojenler. M. başka yerde tanımlandığı gibi, örnek smegmatis&#39;in da sonication tarafından bozulmuş olabilir. 10. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3673/3673fig2.jpg" /> Şekil 2. Mycobacterium tuberculosis hücre ekstresi 1D 1H NMR spektrumu. Metabolitlerinin temsili ile ilişkili NMR zirvelerinin etiketlenir. Kısaltmalar aşağıdaki gibidir: AMP, adenozin mono fosfat, α-Kg, α-ketoglutarat, Glu, L-glutamat ve Ala, alanin.

<ol><li>Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Manipulation+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2(2007).</li>
<li>Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Maintenance+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1(2007).</li>
<li>Clarridge, J. E. 3rd, Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+use+of+polymerase+chain+reaction+for+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+a+routine+mycobacteriology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory.</a> J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).</li>
<li>Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOGGY%3A+solvent-optimized+double+gradient+spectroscopy+for+water+suppression.+A+comparison+with+some+existing+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques.</a> J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).</li>
<li>Cui, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+identification+via+the+Madison+Metabolomics+Consortium+Database%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database.</a> Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).</li>
<li>Ulrich, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioMagResBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BioMagResBank.</a> Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMDB%3A+the+Human+Metabolome+Database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HMDB: the Human Metabolome Database.</a> Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).</li>
<li>Kanehisa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KEGG+for+linking+genomes+to+life+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">KEGG for linking genomes to life and the environment.</a> Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).</li>
<li>Karp, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+BioCyc+collection+of+pathway%2Fgenome+databases+to+160+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).</li>
<li>Halouska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+NMR+metabolomics+to+analyze+the+targets+of+D-cycloserine+in+mycobacteria%3A+role+of+D-alanine+racemase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase.</a> J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).</li>
<li>Boshoff, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+responses+of+Mycobacterium+tuberculosis+to+inhibitors+of+metabolism%3A+novel+insights+into+drug+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action.</a> J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).</li>
<li>Mehaffy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Descriptive+proteomic+analysis+shows+protein+variability+between+closely+related+clinical+isolates+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).</li>
<li>Schnappinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Adaptation+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+Macrophages%3A+Insights+into+the+Phagosomal+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment.</a> J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).</li>
<li>Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+of+host+pathogen+interactions%3A+how+Mycobacterium+tuberculosis+and+the+macrophage+adapt+to+one+another%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes.+Infect%22%5BJournal%5D)">Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another.</a> Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).</li>
<li>Shui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+profiling+of+host-pathogen+interactions%3A+the+macrophage+response+to+Mycobacterium+tuberculosis+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids.</a> J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).</li>
<li>Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temporal+expression+profile+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).</li>
<li>Forgue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+metabolic+profiling+of+Aspergillus+nidulans+to+monitor+drug+and+protein+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity.</a> J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).</li>
<li>Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+by+numbers%3A+acquiring+and+understanding+global+metabolite+data%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data.</a> Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).</li>
<li>Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR-based+Metabolomic+Profiling+in+Mice+Infected+with+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).</li>
<li>Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+extraction+method+for+mycobacterial+metabolome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Biomed.+Anal%22%5BJournal%5D)">Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).</li>
<li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+of+Mycobacterium+tuberculosis+reveals+compartmentalized+co-catabolism+of+carbon+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates.</a> Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).</li>
<li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+metabolomic+profiling+of+enzymatic+function%3A+identification+of+Rv1248c+as+a+mycobacterial+2-hydroxy-3-oxoadipate+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase.</a> Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).</li>
<li>Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gluconeogenic+carbon+flow+of+tricarboxylic+acid+cycle+intermediates+is+critical+for+Mycobacterium+tuberculosis+to+establish+and+maintain+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+metabolism+in+Mycobacterium+smegmatis+during+the+transition+from+O2-rich+to+O2-poor+conditions+as+studied+by+isotopomer-assisted+metabolite+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis.</a> Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).</li>
<li>Kweon, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polyomic+approach+to+elucidate+the+fluoranthene-degradative+pathway+in+Mycobacterium+vanbaalenii+PYR-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1.</a> J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).</li>
<li>Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+6-phosphate+accumulation+in+mycobacteria%3A+implications+for+a+novel+F420-dependent+anti-oxidant+defense+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system.</a> J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).</li>
<li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li>
<li>Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+%28LC-MS%29+in+metabolic+profiling+and+metabolomic+studies+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery.</a> Biomark Med. 1, 159-185 (2007).</li>
<li>Ludwig, C., Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+J-resolved+NMR+spectroscopy%3A+review+of+a+key+methodology+in+the+metabolomics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem.+Anal%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox.</a> Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSimpson%2C+RJ+%22Proteins+and+Proteomics%3A+A+Laboratory+Manual%22">Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual</a>. Inglis, J. , Cold Spring Laboratory Press. 425-595 (2003).</li>
<li>Beste, D. J., McFadden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-level+strategies+for+studying+the+metabolism+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).</li>
<li>Rhee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+carbon+metabolism+in+Mycobacterium+tuberculosis%3A+an+unexpected+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier.</a> Trends Microbiol. , (2011).</li>
<li>Who. Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Anti-tuberculosis+Drug+Resistance+in+the+World%3A+Report+No.+4%22">Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4</a>. , (2008).</li>
<li>Jassal, M., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensively+drug-resistant+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Extensively drug-resistant tuberculosis.</a> Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Çalışmaların önemli bir kısmı M. Transkriptomik ve proteomik profilleri analiz var in vitro ve in vivo koşullarında çeşitli altında tüberküloz. 11-16 Sonuçta, gen ekspresyonu ve enzim aktivitesinde değişiklikler küçük molekül ağırlıklı moleküllerin konsantrasyonları değişikliklere yol açmaktadır. Bu bileşiklerin tam açıklaması metabolome oluşturmaktadır. Böylece, metabolik yolaklar uyuşturucu ve değişen büyüme koşullarına etkileri metabolomik analizi takip edilebilir. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> ADC Zenginleştirme </td><td> BD BBL Middlebrook </td><td> 212352 </td><td></td></tr><tr><td> BACS-120 Numune Değiştirici </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NMR Bruker Avance </td><td> Bruker </td><td></td><td> 500 MHz </td></tr><tr><td> Bovine Albumin Serum </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td> Fraksiyon V </td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td><td> Tezgahüstü </td></tr><tr><td> Santrifüj Tüpleri </td><td> Corning </td><td> 430291 </td><td> 50 ml steril polipropilen </td></tr><tr><td> Kriyojenik Flakon </td><td> Corning </td><td> 430488 </td><td> 2.0 ml steril polipropilen </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> AG Bilimsel </td><td> C-1189 </td><td> Zehirli </td></tr><tr><td> D (+) - Glikoz </td><td> ACROS </td><td> 41095-0010 </td><td></td></tr><tr><td> Ağır su </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 617385 </td><td></td></tr><tr><td> Erlenmeyer Flask </td><td> VWR </td><td> 89095-266 </td><td> Steril, düz taban, polikarbonat, 0.22 mikron PTFE membran havalandırmalı kapak </td></tr><tr><td> Flaş Freeze Flask </td><td> VWR </td><td> 82018-226 </td><td> 750 ml </td></tr><tr><td> Kurutucu dondur </td><td> VWR </td><td> 82019-038 </td><td> 4.5 L Benchtop </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> GibcoBRL </td><td> 15514-029 </td><td></td></tr><tr><td> Kuluçka makinesi </td><td> New Brunswick </td><td> Innova 40 </td><td> Tezgahüstü çalkalayıcı </td></tr><tr><td> Parçalama Matris B </td><td> MP Biomedicals </td><td> 6911-100 </td><td></td></tr><tr><td> Lizis Makinesi </td><td> MP Biomedicals </td><td> FastPrep-24 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrosantrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> 5415D </td><td> Tezgahüstü </td></tr><tr><td> Mikrosantrifüj </td><td> Beckman Coulter </td><td> Mikrofuge&#39;de 22R </td><td> Tezgahüstü </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H9 Broth </td><td> Difco </td><td> 271310 </td><td></td></tr><tr><td> NMR tüpler </td><td> Norell </td><td> ST500-7 </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> OADC Zenginleştirme </td><td> BD BBL Middlebrook </td><td> 212351 </td><td></td></tr><tr><td> Oleik Asit </td><td> Sigma </td><td> O1008 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum fosfat dibazik </td><td> VWR </td><td> BDH0266 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum Fosfat mono </td><td> VWR </td><td> BDH0268 </td><td></td></tr><tr><td> Rotor - mikrofuge&#39;de 22R </td><td> Beckman Coulter </td><td> F241.5P </td><td> Mühürlü ve polipropilen </td></tr><tr><td> Rotor - Allegra X-15R</td><td> Beckman Coulter </td><td> SX4750 </td><td> Biyo-sertifikalı kapaklar ile </td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum-3-trimethylsilylpropionate-2 ,2,3,3-D4 </td><td> Cambridge İzotop </td><td> DLM-48 </td><td></td></tr><tr><td> Spektrofotometre </td><td> Beckman Coulter </td><td> DU-530 </td><td></td></tr><tr><td> Spektrofotometre Küvetleri </td><td> Hayat çizgisi </td><td> LS-2410 </td><td> 1.5 ml polistiren, 2 açık taraf </td></tr><tr><td> Şırınga </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td><td> Steril, 3 ml Luer-Lok </td></tr><tr><td> Şırınga Filtre </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td> 0.2 um steril selüloz asetat </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP338-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

numune hazırlama<em&gt; mycobacterium tuberculosis</emnükleer manyetik rezonans metabolomik araştırmaları&gt; özler

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis küresel ölçekte insan mortalitenin önemli bir nedenidir. Hem çok (MDR) ve yaygın-(XDR) ilaca dirençli suşların ortaya çıkması mevcut hastalık kontrol çabalarını rayından tehdit ediyor. Böylece, şu anda mevcut olanlardan daha etkili ilaçlar ve aşılar geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır. M. genom tüberküloz fazla 10 yıldır bilinen, fakat gen fonksiyonu ve zorunluluk bilgimizi önemli boşluklar bulunmaktadır olmuştur. Birçok çalışma bu yana gen ifadesinin küresel desenleri ile ilgili ilaçlar, oksidanlar ve büyüme koşullarının etkisini belirlemek amacıyla Transkriptomik ve proteomik düzeyde hem de gen ekspresyon analizi kullandık. Sonuçta, bu değişikliklerin nihai yanıtını birkaç bin küçük moleküler ağırlıklı kimyasal maddeler de dahil olmak üzere bakterinin metabolik kompozisyonu yansıtılır. Tedavi edilmeyen veya tr ya da yabani tip ve mutant suşlarının metabolik profilleri KarşılaştırılmasıBelirli bir ilaç ile eated, etkili bir hedef tespit edilmesini sağlar ve antitüberküloz aktivitesi olan yeni inhibitörlerinin gelişimine neden olabilir. Aynı şekilde, metabolome üzerinde iki ya da daha fazla koşulların etkileri de tespit edilebilir. Nükleer manyetik rezonans (NMR) metabolik ara tanımlamak ve ölçmek için kullanılan güçlü bir teknolojidir. M. hazırlanması için bu protokol, prosedürler NMR metabolomik analiz için tüberküloz hücre ekstreleri tarif edilmektedir. Metabolitlerin korunması maksimize etmek için soğuk sıcaklıkları korurken hücre kültürleri uygun koşullar ve gerekli Biyogüvenlik Seviyesi 3 çevreleme, 1 hasat altında yetiştirilen ve mekanik lizis tabi tutulur. Hücre lizatları kurtarıldı, steril ve ultra-düşük ısılarda saklanan filtrelendi. Bu hücre özleri alikotlar canlı hücrelerinin yokluğu doğrulamak için koloni oluşturan birim için Middlebrook 7H9 agarda kaplanır. 37 inkübasyon iki ay ° C, eğer üzerine hiçbir vimümkün koloniler gözlenir, numune üretim prosesleri için tecrit tesisine kaldırılır. Özler, liyofilize edildi döteryumlanmış tampon içinde tekrar süspanse edilir ve daha sonra istatistiksel analize tabi tutulur spektroskopik verileri yakalamak, NMR aleti olarak enjekte edilir. Anlatılan prosedürler (1D) tek boyutlu 1 H NMR ve iki-boyutlu (2B) 1 H-13 C NMR analizi her ikisi için de uygulanabilir. Bu metodoloji kromatografik yöntemlere göre daha güvenilir küçük molekül ağırlığı metabolit tespiti ve hücre ekstresi metabolik kompozisyonlar daha güvenilir ve duyarlı kantitatif analizler sağlar. Işlem varyasyonları hücre parçalama aşamasını takiben de tarif paralel Proteomik analizleri için adapte edilebilir.

Ve metabolomik profili<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Broth kültürleri büyüme sonrasında belirlenir. Koşullar bu mikroorganizmanın metabolik profil üzerinde besin takviyeleri, oksidanlar ve anti-tüberküloz ilaçların etkilerini test etmek için değişik olabilir. Özütü hazırlanması için prosedür 1D her ikisi için de geçerlidir<sup&gt; 1</sup&gt; H ve 2D<sup&gt; 1</sup&gt; H-<sup&gt; 13</sup&gt; C NMR analizleri.

Numune Hazırlama<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</emNükleer Manyetik Rezonans metabolomik Araştırmaları&gt; özler

Mycobacterium tuberculosis, küresel ölçekte insanlarda ölümlerin temel nedenlerinden biridir. Hem çoklu ilaç dirençli (MDR) hem de yaygın ilaç dirençli (XDR) ...

Bu prosedürün amacı, NMR metabolomikleri ile Mycobacterium tuberculosis hücreden arındırılmış ekstraktlarını analiz etmek için öncelikle kültürleme yapmak ve hücreleri uygun büyüme aşamasında hasat etmektir. Ardından hücreleri lizleterek analiz için hücreden arındırılmış ekstraktlar elde edilir. Liyofilize ekstraktlar, NMR analizi için tampon çözeltide yeniden süspande edilir.Son olarak, NMR verilerini toplayın ve metabolitleri tanımlamak için spektra yazılımla analiz edin. Nihayetinde, mycobacterium tuberculosis'in NMR analizi, çeşitli tedaviler üzerine metabolit düzeylerindeki korunumları göstermek için kullanılır. NMR metabolomikleri, mycobacterium tuberculosis fizyolojisinin önemli metabolik yollar gibi temel yönlerine uygulanabilir.Bu anlayış, ilaç etki ve direnç mekanizmalarını aydınlatmak ve ilaç tasarımı için yeni hedefler belirlemek açısından kritik öneme sahiptir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, tüm örnekleri tamamen aynı şekilde işleme konusundaki yetersizlikleri nedeniyle zorlanabilirler; bu durum gereksiz varyasyonlara ve laboratuvarımdan kaynaklanan sonuçlara yol açacaktır. Doktora öğrencisi Steven Luka, NMR işlemleri için örneklerin nasıl hazırlanacağını g

sample-preparation-mycobacterium-tuberculosis-extracts-for-nuclear

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mikrobiyal planktonik toplulukların metaboliti çıkarımı için bir yöntem sunulmaktadır. Tüm topluluk örnekleme özel hazırlanmış filtreler üzerine filtrasyon sağlanır. Liyofilizasyon sonra, sulu çözünür metabolitleri ekstre edilir. Bu yaklaşım doğal ya da deneysel mikrobiyal toplulukların trans-omik araştırmalar çevre metabolomik uygulaması için izin verir.

Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Çevre metabolomik için düşük yoğunluklu Planktonik topluluklardan Metabolitlerinin Konsantrasyon

Bu videoda, metabolit profili oluşturma için meme kanseri hücresi örneklerinin hazırlanmasına yönelik bir teknik açıklanmaktadır. Meme kanseri hücreleri, östrojen reseptörü alfa'ya bağlanan ve metabolit bileşiminde değişikliğe neden olan estradiol ile tedavi edilir.

Metabolomik için Numune Hazırlama: Metabolit Profili Oluşturma için Hücre Numuneleri Hazırlama Yöntemi

Memeli beyninin nörokimyası birçok nörolojik ve sistemik hastalıkta değişmiştir. Serebral metabolitlerin karakteristik profilleri, beyin dokusunun ham ekstraktlarına dayalı olarak verimli bir şekilde elde edilebilir. Bu amaçla, metabolit konsantrasyonlarının (metabolomikler) ayrıntılı kantitatif analizini sağlayan yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi kullanılır.

Doku Esansı Yüksek Çözünürlük Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Sıçan Beyin metabolomic Analizi

Bu makale, bitkilerin metabolik profillemesinde PSYCHE ve SAPPHIRE-PSYCHE'nin kullanımını sunmakta ve numune hazırlama ve optimal Pure Shift NMR spektrum kaydı için ayrıntılı prosedürleri içermektedir. Homonükleer ayrışma ile elde edilen çözünürlük kazancının, sistemin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına izin verdiği örnekler tartışılmaktadır.

Saf Vardiya Nükleer Manyetik Rezonans: Bitki Metabolomikleri için Yeni Bir Araç

Bu protokolde, birçok numunenin verimli ve hızlı bir şekilde numune hazırlamasını birleştiren optimize edilmiş bir iş akışı sunuyoruz. Ek olarak, metabolik GWAS çalışmalarının yüksek verimli değerlendirilmesi için analitik varyasyonları azaltmak için adım adım bir kılavuz sunuyoruz.

Büyük Ölçekli Multi-omik Genom Çapında İlişkilendirme Çalışmaları (Mo-GWAS): Numune Hazırlama ve Normalleştirme Kılavuzları

Bu protokol, Mycobacterium tuberculosis hücre dışı veziküllerini kültür süpernatantlarından zenginleştirmek için kolay ve tekrarlanabilir bir teknik olan boyut dışlama kromatografisini tanımlar.

Mycobacterium tuberculosis Boyut Dışlama Kromatografisi ile Hücre Dışı Vezikül Zenginleştirme

Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, çeşitli hastalıkları olan hastalarda metabolitlerdeki düzensizliği tanımlamak için kullanılır. Bu teknik, patofizyolojik içgörüleri çözerek düzensiz metabolitlerin nicelleştirilmesine izin verir. Burada, hastaların metabolik karakterizasyonu için NMR tabanlı yaklaşımın adım adım prosedürünü açıklıyoruz.

NMR Bazlı Metabolomikler Kullanılarak Kritik Hastalarda Düzensiz Metabolitlerin Tanımlanması ve Miktar Tayini

Bu protokol, çözünmeyen hücre duvarı ve zar proteinlerini, izoelektrik noktaya dayalı hazırlayıcı izoelektrik odaklama (IEF) kullanarak basit fraksiyonlara (1-5 protein) ayırır ve ardından moleküler ağırlığa göre ayırır. Elde edilen fraksiyonlar, daha fazla saflaştırma olmaksızın doğrudan immünolojik ve proteomik analiz için kullanılabilir.

Hücre Duvarı ve Hücre Zarı Proteinlerinin Aşağı Akış Protein Analizi için Mycobacterium tuberculosis'ten Ayrılması ve Fraksiyonlanması

Bu protokol, DNA yakalama boncuk saflaştırması ile birleştirilen boncuk çırpmayının, Mycobacterium tuberculosis örneklerinden DNA çıkarmak için hızlı ve tutarlı bir yöntem sağladığını ve bu da onu yeni nesil dizileme uygulamaları için etkili bir seçim haline getirdiğini gösterir.

Özel Tamponda Boncuk Çırpma Kullanılarak Mikobakteriyel DNA Ekstraksiyonu ve Ardından NGS İş Akışı

Bu protokol, mikobakterilerden yüksek kaliteli DNA çıkarmak için CTAB yöntemini tanımlar; bu yöntem, onların dayanıklı, mikolik asit açısından zengin hücre duvarlarının getirdiği zorlukları aşmaktadır. Bu süreç, enzimatik sindirim, CTAB ile hücre lizisi ve organik ekstraksiyon ile etanol çökeltilemesiyle DNA arındırmasını içerir. Bu yöntem, moleküler çalışmalar için uygun DNA üretir ve mikobakteriyel araştırmalar için güvenilirdir.

Mycobacterium Türlerinden Setiltrimetilamonium Bromid Tekniği ile Tam Genom Deoksiribonüklein Asit Ekstraksiyonu

Öğrenin Mycobacterium tuberculosis metabolomik profilini NMR metabolomik kullanarak analiz etme yöntemini. Hücre kültürü, lizis ve spektrum analizi ile metabolit düzeylerindeki değişiklikleri belirleyin.

Numune Hazırlama

Daha fazla video keşfet