Numune Hazırlama Mycobacterium tuberculosis özler

Ve metabolomik profili

Bu prosedürün amacı, mycobacterium tuberculosis, hücresiz ekstraktları NMR metabolomik ilk kültürü ile analiz etmek ve hücreleri uygun bir büyüme aşamasında hasat etmektir. Daha sonra hücreleri liza edin ve analiz için hücresiz ekstraktlar elde edin. Liyofilize ekstraktları NMR analizi için tamponda yeniden askıya alın.

Son olarak, NMR verilerini toplayın ve metabolitleri tanımlamak için spektrumları yazılımla analiz edin. Sonuç olarak, mikobakteri tüberkülozunun NMR analizi, çeşitli tedaviler üzerine metabolit seviyelerindeki korumaları göstermek için kullanılır. NMR metabolomikleri, önemli metabolik yollar gibi mikobakteri tüberkülozunun fizyolojisinin temel yönlerine uygulanabilir.

Bu anlayış, ilacın etki ve direnç mekanizmalarını aydınlatmak ve ilaç tasarımı için yeni hedefler belirlemek için kritik öneme sahiptir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, tüm numuneleri tam olarak aynı şekilde işleyememe nedeniyle mücadele edeceklerdir, bu da laboratuvarımdan gereksiz varyasyonlar ve sonuçlar getirecektir. Steven Luka Doktora yüksek lisans öğrencisi, NMR işleme için numuneleri işleme prosedürlerini gösterecek Laboratuvarımdan, araştırma laboratuvarı yöneticisi ve üç araştırma teknisyeni Robert Fenton, şimdi M tüberkülozu yürütürken mikobakteri tüberkülozu kültürlerini ele alma prosedürlerini gösterecek.

Araştırma, kurumsal kılavuzlar tarafından tanımlanan biyogüvenlik seviye üç uygulamalarını takip etti. Bu videodaki etiketlerde biyogüvenlik hususları için mikrobakteri tüberkülozu yazsa da, bu gösteride patojenik olmayan mycobacterium magmatic kullanılmıştır. % 50 gliserol M tüberkülozu stoğunu buz üzerinde çözerek başlayın.

250 mililitrelik ER'de 110 mililitre M-A-D-C-T-W et suyuna 0.15 mililitre aşılayın ve şişem kültürleri yaklaşık altı gün boyunca 100 RPM'de çalkalayarak 37 santigrat derecede büyütüyor. Antibiyotik yoksa, alternatif ilaveler veya diğer tedaviler gerekli değildir. Tedavi gerektiren kültürler için kültürleri hasat edin.

Kültür, titrasyon ve kalite kontrol için buz üzerinde 0,5 mililitrelik bir Eloqua ayırın. Daha sonra istenen tedaviyi uygulayın ve tedavi süresinden sonra kültürleri tekrar çalkalayıcıya yerleştirin. Bir mililitre çıkarın ve OD 600'ü belirleyin.

Ayrıca kültür, titrasyon ve kalite kontrol için 0,5 mililitrelik bir numune ayırın. Kalan tüm protokol boyunca hücreleri buz üzerinde tutun. Hücreleri 15 mililitre buz gibi çift damıtılmış su ile yıkadıktan sonra santrifüjleme ile dört adet 50 mililitrelik tüpte hasat edin.

Reese, peletleri 10 mililitrelik alikotlarda askıya alır. İki alikot çekin ve santrifüjleme ile peleti çekin, ardından hücre peletini bir mililitre çift damıtılmış suyun son hacminde yeniden süspanse edin. Topaklanma içermeyen tek hücreli bir süspansiyon isteniyorsa, hücreleri 27 gauge bir iğneden geçirin.

Bir mililitrelik hücre süspansiyonunu, parçalama matrisi B'yi içeren iki mililitrelik bir vidalı kapağa aktarmak için üç kez devam edin. Hızlı hazırlık 24 lizis homojenizatörünü biyogüvenlik kabininin içine yerleştirin. Numuneleri, tutma teli plakasını sabitleyerek numune tutucuya yerleştirin. Ardından saniyede altı metre hız ayarında 60 saniye boyunca işlem yapın.

Sonraki, numuneleri pelet hücresi kalıntılarına ve sağlam hücrelere santrifüjleyin. Daha sonra supinatı 0.2 mikronluk bir şırınga filtresinden geçirin ve canlı hücrelerin yokluğunu kontrol etmek için steril bir tüpe geçirin. Plaka: MADC üzerinde 0.1 mililitre numune. Ağar.

Numuneleri bir etanol kuru buz banyosunda dondurun ve bir NMR tesisinde liyofilize edilmeye ve işlenmeye hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. İki ay sonra, koloni oluşturan birimlerin olmadığını doğrulamak için plakaları kontrol edin. Herhangi bir CF kullanıcısı bulunamazsa, numuneler standart bir NMR tesisinde daha fazla analiz için BSL üç laboratuvarından çıkarılabilir.

Numuneleri kurumaya uğrattıktan sonra, 0.7 mililitre NMR tamponunda yeniden süspanse edin ve 13.000 kez üç dakika boyunca bir mikro santrifüj tüp santrifüjüne aktarın. G, 0.6 mililitre çıkarın ve beş milimetrelik bir NMR tüpüne aktarın. Medya analizinden, özelleştirilmiş bir raf, birden fazla NMR borusunun doğru derinlikte eğiricilere yüklenmesini kolaylaştırır.

Ardından, ABACS'ye bir adet 20 örnek değiştirici yerleştirmek için örnekleri NMR spektrometresine aktarın. Tedavi edilmemiş ve ilaçla tedavi edilmiş kültürler arasında geçiş. İlk numunenin, otomatik bir çalışmanın başlangıcında mıknatısa önceden yüklenmesi gerekir.

Cihazı kalibre etmek için, 90 derecelik darbe uzunluğunu tek bir örnekle optimize edin ve cihazı kalan örnekler için ayarlayın. Simge NMR ve grad dolgusunu kullanın. Her numune için kilitleme, şimleme ve NMR veri toplamayı otomatikleştirin.

1D hidrojen bir NMR spektrumu için, su bastırma ve uyarma şekillendirme ile darbe dizisini seçin. İki DH bir C 13 hs QC spektrumu için toplam 32.000 veri noktası, 128 tarama ve 16 sahte tarama ayarlayın. Darbe sırasını seçin.

Doğrudan H bir boyut boyunca tarama genişliğine sahip toplam 2048 veri noktası ve dolaylı C 13 boyutu boyunca tarama genişliğine sahip 64 veri noktası seçin. Ayrıca, gürültüye iyi bir sinyal elde etmek için 128 tarama ve 16 sahte tarama ile spektrum toplamayı belirtin. Bir m tüberküloz spektrumu, bilinen 50 metabolit dahil olmak üzere yaklaşık 400 pik üretti.

Örneğin, ekteki el yazmasında ayrıntılı olarak açıklandığı gibi veri işleme, doğrudan veya dolaylı olarak D alanin yolu ile ilişkili olan bu metabolit spektrumunu üretti. Tepe yoğunluklarının büyüklüğü, hücre ekstraktında bulunan metabolit konsantrasyonları ile orantılıdır, bu nedenle metabolitlerdeki ve metabolik yollardaki nispi bozulmalar, numuneler ve tedaviler arasında ölçülebilir. LMR metabolomikleri, bakteriyoloji alanındaki araştırmaların önünü açarak, görsel ve mikrobakterilerde, başka bir patojenik veya patojenik olmayan mikroorganizmalarda fizyoloji ve patogenezin araştırılmasına zemin hazırlamaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, NMR metabolomikleri için çoklu tüberküloz hücre ekstraktlarının nasıl hazırlanacağını iyi anlamalı ve daha da önemlisi güvenilir sonuçlar elde etmek için tüm protokol boyunca tutarlılığı korumalısınız.