Özel Tamponda Boncuk Çırpma Kullanılarak Mikobakteriyel DNA Ekstraksiyonu ve Ardından NGS İş Akışı

Teşhis araştırmamız, hız ve pragmatizme odaklanarak, sınırlı kaynak ortamlarında tüberkülozda ilaç direncinin tespitini iyileştirmeye odaklanmaktadır. TB teşhisinde, daha kapsamlı genotipik testler ve hatta bir dizi yeni hızlı fenotipik test vardır ve bu testleri bakım noktasına yaklaştırmak için tutarlı baskılar vardır. Ancak hâlâ var olan bir takım pragmatik engeller var.

Reaktiflerden altyapıya ve lojistiğe kadar kaynak zorlukları önemli engeller olmaya devam ediyor. Bir Cepheid Xpert testinin teknik karmaşıklığının ötesinde herhangi bir şeyle, farklı ortamlarda protokol standardizasyonu zordur. Dolayısıyla, buradaki çalışmada ayrıntılı olarak açıklandığı gibi MTB DNA ekstraksiyonu bunun en iyi örneğidir.

Dizilemeye dayalı TB teşhisini genişletmek için kritik bir ihtiyaç var, ancak birçok laboratuvar hala yüksek kaliteli DNA çıkarmanın güvenilir bir yolundan yoksun. Amacımız basit, pratik ve düşük kaynaklı bakım noktası ortamına uygun bir yöntemi paylaşmaktır. Burada, kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda kullanılmak üzere tasarlanmış basit, düşük maliyetli bir protokol sunuyoruz.

NGS uygulamaları için doğrulanmıştır ve otomatik sıvı taşıma sistemleriyle uyumludur. Başlamak için, Triton tamponunu oluşturmak için sodyum klorür çözeltisi Tris hidroklorür tamponu, Triton X 100 ve EDTA'yı birleştirin. Karıştırarak karıştırın ve 100 mililitrelik nihai hacme ulaşmak için ultra saf su ekleyin.

Kullanmadan önce filtre, tamponu sterilize edin. Daha sonra, bir mililitre tek molar Tris-HCl ve 20 mikrolitre 0,5 molar EDTA'yı birleştirerek 100 mililitre düşük EDTA Tris-EDTA tamponu hazırlayın. 100 mililitrelik nihai hacme ulaşmak için karıştırın ve ultra saf suyla doldurun.

Ardından filtre tamponu sterilize edin. Lizis tüplerini hazırlamak için, bükülme noktasının hemen altındaki 1,5 mililitrelik vidalı kapaklı bir tüpün altını dikkatlice kesmek için bir neşter bıçağı kullanın. Ucu bir P1000 pipet ucundan kesin ve uca yakın V şeklinde bir kama yapın.

Bir kepçe oluşturmak için vidalı kapaklı tüpün kesik tabanını V şeklindeki pipet ucuna sıkıştırın. Steril bir kabı 0,1 milimetrelik zirkonya silikat boncuklarla doldurun. Hazırlanan kepçeyi kullanarak yaklaşık 200 miligram boncuğu 1,5 mililitrelik vidalı kapaklı tüplere aktarın.

Bakteri hücre kültürünün hazırlanması için, beş mililitre mycobacterium tuberculosis kültürünü 15 mililitrelik konik bir santrifüj tüpüne aktarın. 10 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin. Şimdi, peleti bozmadan süpernatanın yaklaşık 500 mikrolitresi hariç tamamını dikkatlice çıkarmak için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın.

Kalan süpernatanı çıkarmak için bir P1000 pipeti kullanın. Peleti 350 mikrolitrelik özel triton tamponunda yeniden süspanse edin, ardından yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Numuneyi kuru bir ısı banyosunda 95 santigrat derecede 30 dakika ısıtın.

Balgamı hazırlamak için bir ila beş mililitre balgam örneğini steril 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Ditiyotreitol sıvılaştırma işlemini gerçekleştirmek için, balgam örneğine dört hacim 10 milimolar Ditiyotreitol ekleyin, ardından 30 saniye boyunca iyice girdap yapın. Numuneyi 10 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin.

Ardından, süpernatantın 500 mikrolitresi hariç tümünü atmak için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın. Peleti bozmadan süpernatanın geri kalanını bir P1000 pipetle çıkarın. Peleti 350 mikrolitre özel triton tamponunda yeniden süspanse edin.

NALC sodyum hidroksit sıvılaştırmasını gerçekleştirmek için balgam örneğine dört hacim NALC sodyum hidroksit çözeltisi ekleyin. Karışımı 30 saniye vorteksleyin. Ardından tüpü oda sıcaklığında yedi dakika inkübe edin.

Şimdi 50 mililitre işaretine kadar PBS ekleyin. İyice karıştırmak için tüpün içeriğini vorteksleyin, ardından tüpü 10 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, 50 mililitrelik bir serolojik pipetle, daha önce gösterildiği gibi süpernatanı atın.

Ardından peleti 350 mikrolitre özel triton tamponunda yeniden süspanse edin. İlk olarak, 350 mikrolitre inaktive edilmiş numuneyi, 250 mikrolitre 0,1 milimetre zirkonya silikat boncuk içeren etiketli 1,5 mililitrelik vidalı kapaklı bir tüpe aktarın. Boncuk, döngüler arasında iki dakika dinlenerek lizatı saniyede 6,5 metre hızla 45 saniye boyunca yendi.

Numuneyi iki dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin, ardından 150 mikrolitre süpernatantı yeni etiketli bir tüpe aktarın. Daha sonra girdap temizleme manyetik boncukları 30 dakika boyunca oda sıcaklığında eşitleyerek yeniden askıya alın. 180 mikrolitre manyetik boncuk DNA örneğine aktarın.

Karıştırmak için 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Oda sıcaklığında iki dakikalık bir inkübasyondan sonra, tüpü manyetik bir rafa yerleştirin ve çözeltinin temizlenmesi için iki dakika bekleyin. Ardından süpernatanı atmak için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın.

Tüp hala manyetik raftayken, karşı duvar boyunca 500 mikrolitre taze hazırlanmış% 70 etanol ekleyin ve 30 saniye bekleyin. Son yıkamanın sonunda, kalan etanolü 10 mikrolitrelik bir pipetle çıkarın ve iki dakika havayla kurutun. Boncuklar opak hale gelir gelmez tüpü manyetik raftan çıkarın.

20 mikrolitre düşük EDTA Tris tamponunda yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında beş dakikalık bir inkübasyondan önce tüm boncukların çözelti içinde olduğundan emin olmak için pipetleme veya vorteksleme yoluyla karıştırın. Ardından, tüpü temizlenene kadar iki dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin.

Ardından, boncuk taşınmasını önlemek için 20 mikrolitreden daha az ayrıştırılmış DNA'yı yeni etiketli bir tüpe aktarın. Mikobakteriyel atpE'nin 99 nükleotidini hedefleyen kantitatif bir PCR kullanarak mikobakteriyel DNA'yı ölçmek için, buz üzerinde bir QPCR ana karışımı oluşturun. Pipetleme kaybını hesaba katmak için %10 fazlalık da dahil olmak üzere numune miktarına ve standartlara göre ana karışımı ayarlayın.

Termal döngüleyiciyi 95 saniye boyunca 60 santigrat derece, ardından saniyede 35 santigrat derece rampa hızıyla 95 saniye boyunca 10 santigrat derece ve 60 santigrat derece 30 saniye boyunca 2.11 santigrat derece çalıştırın. Tüm numuneleri, standartları ve kontrolleri üç kopya halinde çalıştırın. Burada, mycobacterium tuberculosis kültürleri, test edilen tüm koşullar arasında en yüksek DNA konsantrasyonlarını verdi.

Çivili balgam örnekleri, özellikle 10.000 bakteri grubunda, giderek daha düşük DNA verimi ve azalan bakteri girdisi ile artan varyasyon gösterdi.