Name: XCELLigence Sistemi Cr51 Yayın Assay Karşılaştırılması tarafından İnsan Her2neu Özgül CD8 T hücrelerinin Optimal Sitotoksik Aktivite Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Öğrenin, xCELLigence sistemi ile Cr51 yayın assay'ini karşılaştırarak HER2neu özgül CD8 T hücrelerinin sitotoksik aktivitesini gerçek zamanlı ve etiketsiz ölçme yöntemini. Bu teknik, kanser immünoterapisi araştırmalarında daha yüksek hassasiyet ve düşük hücre gereksinimi sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Cure Vakfı ve NIH / NCI 9R01 CA152045 ve P50-CA116201 için Susan G. Komen Keith L. Knutson için hibe tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%28%2B%29+T+cells%3A+foot+soldiers+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35, 161-168 (2011).</li>
<li>Garboczi, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+complex+between+human+T-cell+receptor%2C+viral+peptide+and+HLA-A2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2.</a> Nature. 384, 134-141 (1996).</li>
<li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li>
<li>Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).</li>
<li>Weren, A., Bonnekoh, B., Schraven, B., Gollnick, H., Ambach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flow+cytometric+assay+focusing+on+perforin+release+mechanisms+of+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes.</a> J. Immunol. Methods. 289, 17-26 (2004).</li>
<li>Aktas, E., Kucuksezer, U. C., Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+CD107a+expression+and+cytotoxic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity.</a> Cell Immunol. 254, 149-154 (2009).</li>
<li>Knutson, K. L., Schiffman, K., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+a+HER-2%2Fneu+helper+peptide+vaccine+generates+HER-+2%2Fneu+CD8+T-cell+immunity+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER- 2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients.</a> J. Clin. Invest. 107, 477-484 (2001).</li>
<li>Asiedu, M. K., Ingle, J. N., Behrens, M. D., Radisky, D. C., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta%2FTNF%28alpha%29-mediated+epithelial-mesenchymal+transition+generates+breast+cancer+stem+cells+with+a+claudin-low+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype.</a> Cancer Res. 71, 4707-4719 (2011).</li>
<li>Strijbosch, L. W., Buurman, W. A., Does, R. J., Zinken, P. H., Groenewegen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+dilution+assays.+Experimental+design+and+statistical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Limiting dilution assays. Experimental design and statistical analysis.</a> J. Immunol. Methods. 97, 133-140 (1987).</li>
<li>Gallimore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+exhaustion+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+visualized+using+soluble+tetrameric+major+histocompatibility+complex+class+I-peptide+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Induction and exhaustion of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes visualized using soluble tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complexes.</a> J. Exp. Med. 187, 1383-1393 (1998).</li>
</ol>

Üretim ve bu video-makale Ücretsiz Erişim Roche Diagnostics tarafından desteklenmektedir.

CD8 T hücreleri doğrudan enfekte veya kötü huylu hücreleri 4 öldürmek için güçlü olmak, adaptif bağışıklık yanıtı için önemlidir. Antijen-spesifik CD8 T hücreleri (örneğin ELISPOT, tetramer, flow sitometri) sayısını ölçmek için çeşitli yollar olsa da, çoğu kez bu hücrelerin 3 işlevsel sitotoksik olup olmadığını bilmek yararlıdır. Sitotoksik fonksiyonu değerlendirmek için en çok tanınan testi altın standart test 4 olarak kabul edilir MKK vardır. SRA önemli sınırlamalar radyoaktivite (1) şartı, duyarlılık (2) eksikliği, mekanik bir bilgi (3) eksikliği, hücrelerin büyük miktarlarda (4) gereksinimi, ve (5) zahmetli bir dizi vardır. Böylece, son on yılda, bu sınırlamaları en aza indirmek için yeni stratejiler benimseyerek ilgi olmuştur. Yeni yaklaşımlar içeren bu ölçen kaspaz sürüm 4, BLT esteraz activity5 ve CD107 6 yüzey ifadesi. Mevcut el yazması önerirRoche XCELLigence sistemi üzerinde gerçekleştirilen empedans tabanlı tahlil, aynı zamanda CRA alternatif olarak yararlı olabilir. Empedans dayalı bir yaklaşım uyum yeteneği yüzeylere sıkıca uymayan T hücreleri, bu nedenle ölçüm ile T hücrelerinin doğrudan müdahale herhangi bir endişe azalan empedansı üzerinde çok etkisi olması görünmüyor gözlem dayanmaktadır. Empedans analiz sisteminin kullanımı için gerekli emek önemli ölçüde daha az öncelikli radyoaktivite kullanımı için düzenleme ile ilgilidir ortadan kaldırılmasına bağlı olduğu tahmin edilmektedir. Empedans-tabanlı sistemin tek önemli dezavantajı $ 50.000 $ 60.000 bir harcama XCELLigence biriminin satın almak için gerekli olmasıdır. Bununla birlikte, bir birim XCELLigence radyasyon sayacı ihtiyacını ortadan kaldırır ve T hücre sitotoksisite 8 ek olarak, ilaç ve göç hücresel cevabı değerlendirmek için yararlı olan, çok yönlüdür. Bu gözlemlertümör hücre empedans doza bağımlı azalma, hem basit bir ikincil dereceden fonksiyon aşağıdaki oldukça dik bir eğim ile, Şekil 2 &#39;de gösterilen deney 9 sitotoksik hücrelerin sıklığı tahmin etmek için seyreltme tahlilleri (LDAS) sınırlayıcı kullanılan düşündürmektedir . Empedans tabanlı yaklaşım bir avantajı, gerekli T hücreleri ve tümör hücre sayısı LDA potansiyel olarak daha uygun hale CRA daha az olmasıdır. Örneğin, CRA, bir 01:40 oranında, oyuk başına 1 x 10 5 tümör hücreleri, oyuk başına 4 x 10 6 toplam T hücre gerektiren kaplama vardır. Bununla birlikte, empedans bazlı tahlilde, oyuk başına sadece 1.5 x 10 4 tümör hücreleri, oyuk başına sadece 6 x 10 5 toplam T hücreleri tüketir, ihtiyaç vardır. Bu nedenle, empedans bazlı tahlil% 85 daha az T hücreleri ve tümör hücreleri kullanır. Bu azalma, empedans tabanlı sistemi, insan klinik denemelerinde immünolojik izleme adapte edilebileceğini göstermektedir nerede tkan O sınırlı olabilir çizer. MKK tek bir zaman noktasında sınırlı iken Ayrıca, empedans bazlı analiz kullanıcı minimum ek emek ve hücreleri ile aynı deneyi birden fazla parçalama zaman noktalarında karşılaştırmak için izin, sürekli gerçek zamanlı veri toplar. Frekans hesaplamalar potansiyel olarak toplam 10 antijene spesifik CD8 T hücrelerinin fonksiyonel sitotoksik T hücrelerinin oranını belirlemek için örneğin tetramer analizleri fonksiyonu ölçmek olmayan diğer stratejiler ile kombine edilebilir. Empedans tabanlı yaklaşımın en çekici özelliklerinden biri çoğu diğer testlerin aksine, sitotoksisite potansiyel olarak daha kolay inhibitörleri veya antikorların kullanımı ile hücresel etkileşimleri çalışmak için yapım, gerçek zamanlı olarak izlenebilir olmasıdır. Başka bir yöntem, etiketleme karşı tümör hücreleri için uygun olmasıdır. Non-tümör hücreleri öldüren etiketlenmiş ve kalır çünkü Son olarak, steril, daha fazla hasat ve T-hücre-dirençli hücreler çalışma possib olduğule. Her iki sistem spesifik T hücreleri yanıt olarak tümör öldürme veri sağlamak Özetle,, empedans bazlı analiz MKK daha duyarlı ve daha esnek bir platform sağlar.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque Plus </td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>Kandan PBMC'leri izole etmek için kullanılır </td></tr><tr><td>RPMI 1640 </td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>Hücre kültürü besiyerleri </td></tr><tr><td>FBS </td><td>Denville Scientific</td><td>FB5001-H</td><td>Hücre kültürü medyaları </td></tr><tr><td>İnsan IL-2 </td><td>eBioscience</td><td>14-8029-81</td><td>T hücrelerinin büyümesini stimüle etmek için </td></tr><tr><td>İnsan İnterferon gama </td><td>Hücre Bilimleri</td><td>CR2026</td><td>Tümör hücrelerinde MHC ekspresyonunu stimüle etmek için </td></tr><tr><td>HER-2/neu p369-377 peptidi </td><td>Mayo Clinic peptit sentezi merkezi</td><td>amino asit dizilimi KIFGSLAFL</td><td>HLA-A2'ye bağlanır </td></tr><tr><td>İnfluenza p58-66 peptidi </td><td>Mayo Clinic peptit sentez merkezi</td><td>amino asit dizilimi GILGFVFTL</td><td>HLA-A2'ye bağlanır </td></tr><tr><td>İnsan CD3/CD28 Dynabeads </td><td>Invitrogen</td><td>111-61D</td><td>Non-spesifik T hücresi aktivasyonu ve ekspansiyonu için </td></tr><tr><td>Krom-51 </td><td>MP Biomedicals</td><td>62015</td><td>CRA etiketleme reaktifi </td></tr><tr><td>E-plaka </td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Grubu</a></td><td>05469830001</td><td>xCelligence empedans ünitesi için </td></tr><tr><td>Luma plaka 96 </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>6005630</td><td>Top Count NXT'de radyoaktivite ölçümü için. </td></tr><tr><td>xCelligence RTCA DP İstasyonu </td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Uygulamalı Bilimler</a></td><td>RTCA DP</td><td>Empedans birimi </td></tr><tr><td>Top Count NXT </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>C990601</td><td>Sintilasyon &amp;amp; Lüminesans Sayacı </td></tr><tr><td>Fas Ligand antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>556372</td><td>Fas-Fas ligand etkileşimlerini bloke etmek için</td></tr><tr><td>HLA-A2 BB7.2 antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>551230</td><td>HLA sınıf I blokajı için</td></tr><tr><td>Fare IgG2b, &amp;#954;</td><td>BD Biosciences</td><td>555740</td><td>HLA sınıf I için izotip kontrolü</td></tr><tr><td>SKBR3 tümör hattı</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td>Adenokarsinom</td></tr><tr><td>MCF7 tümör hattı</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>Adenokarsinom</td></tr><tr><td>HCC1419 tümör hattı</td><td>ATCC</td><td>CRL-2326</td><td>Primer duktal karsinom</td></tr><tr><td>BT20 tümör hattı</td><td>ATCC</td><td>HTB-19</td><td>Karsinom</td></tr></tbody></table>

xcelligence sistemi cr51 yayın assay karşılaştırılması tarafından İnsan her2neu Özgül cd8 t hücrelerinin optimal sitotoksik aktivite belirlenmesi

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Sitotoksik CD8 T hücreleri enfekte ya da kötü huylu konak hücreleri 1 ölümünü indükleme yeteneğine sahip olan T-hücrelerinin bir alt grup oluştururlar. Bu hücreler, özel bir reseptör I 2 molekülleri HLA sınıf bağlı belirli bir antijenik peptid tanıyabilir, T hücresi alıcısı (TCR), adlı ifade eder. Gibi hedef hücre ölümü ile sonuçlanan granzymes ve perforin olarak litik moleküllerin üretimi ile HLA sınıf I molekülü sonuçları ile enfekte olmuş hücreleri veya tümör hücreleri kazanılmıştır. Bu tür ELISPOT veya akış sitometri gibi tahliller kullanılarak antijen spesifik CD8 T hücrelerinin oranlarını belirlemek için yararlı olsa da, sitotoksisite deneyleri 3, CD8 T hücre yanıtları kuvvetini tespit etmek için de yararlıdır. Sitotoksik fonksiyonu değerlendirmek için en çok tanınan testi standart bir test 4 olarak kabul edilir Krom Sürüm Testi (MKK) &#39;dir. CRA gama radyasyon hücrelerin maruz kalma, l dahil olmak üzere birçok sınırlamalar vardırtekrarlanabilirlik ve hücrelerin çok sayıda için bir gereklilik ack. Geçtiğimiz on yıl içinde, bu sınırlamaları aşmak için yeni stratejiler benimseyerek ilgi olmuştur. Yeni yaklaşımlar içeren bu ölçen kaspaz sürüm 4, BLT esteraz aktivite 5 ve CD107 6 yüzey ifadesi. Roche XCELLigence sistemi kullanılarak empedans bazlı analiz, MKK alternatif olarak potansiyel için yazıda incelenmiştir. Yapışık tümör hücreleri elektrot plakaları bağlanmasına zaman empedansı ya da bir elektrik akımına karşı oluşur. Tümör hücreleri öldürme aşağıdaki ayırmak ve elektriksel direnç XCELLigence sistemi tarafından ölçülebileceği azalır. Hücre-aracılı öldürme değerlendirmek için empedans dayalı bir yaklaşım uyum yeteneği T hücreleri en yüzeylere sıkıca uymayan ve böylece T hücrelerinin doğrudan müdahale herhangi bir endişe azalan empedansı üzerinde çok etkisi olması görünmüyor gözlem dayanmaktadır ileölçme. Sonuçlar empedans tabanlı tahlil, standart MKK göre artan bir hassasiyet ile antijene özgü sitotoksik CD8 T hücrelerinin seviyelerindeki değişiklikleri tespit edebilir olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlara dayanarak, empedans tabanlı yaklaşımlar Cras veya sitotoksik CD8 T hücre işlevselliği ölçmek amacı diğer yaklaşımlar için iyi alternatifler olabilir.

Krom salınım tahlili, sitotoksik T hücresi aktivitesini tespit etmek için ortak bir tahlil, bazı sınırlamalar vardır. Bu madde, antijen spesifik CD8 T hücreleri ve insan göğüs kanseri tümör hattı ile, SKBR3 kullanarak, bir empedans dayalı bir yaklaşım hücre öldürme saptama yeteneğine için incelenmiştir.

XCELLigence Sistemi Cr51 Yayın Assay Karşılaştırılması tarafından İnsan Her2neu Özgül CD8 T hücrelerinin Optimal Sitotoksik Aktivite Belirlenmesi

Sitotoksik CD8 T hücreleri, enfekte olmuş veya malign konak hücrelerin ölümünü indükleme kapasitesine sahip T hücrelerinin bir alt grubunu oluşturur1. Bu hücreler ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, EXOGEN sistemi kullanılarak empedansa dayalı bir yaklaşımı krom salınım analizi ile karşılaştırarak sitotoksik T hücresi aktivitesini belirlemektir. İlk adım, fial kullanılarak periferik kan mononükleer hücrelerinin tüm kandan ayrıştırılmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, antijene özgü CD eight T hücreleri oluşturmak için PBMC'ler; peptit antijen, insan rekombinant IL two ve ışınlanmış PBMC ile birlikte kuyucuklara eklenir.Tümör hücre ölümünü tetiklemek amacıyla, her iki analizde de antijene özgü CD8 T hücreleri tümör hücreleriyle birlikte kültürlenir. Hem empedans yöntemi hem de kromyum salınım analizi kullanılarak tümör hücrelerinin yüzde cinsinden lizine dair sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, kromyum salınım analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, empedans tabanlı sistemin gerçek zamanlı veri toplaması ve herhangi bir işaretleme gerektirmeyen daha az hücreye ihtiyaç duymasıdır. Bu protokol için, normal sağlıklı HLA-A2 pozitif donörlerden alınan kan, üreticinin protokolü takip edilerek PBMC veya periferik kan mononükleer hücre kaynağı sağlar.P BMC'lerini kandan ayırmak için F call PA plus kullanın. Ardından, altı kuyuklu plakaların her bir kuyuğuna, iki mililitre medyum içinde yaklaşık 4 milyon P BMC yükleyin. Her bir kuyuğa, kültürde 10 µg/mL nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde HLAA iki bağlanma peptidi ekleyin.T hücrelerini stimüle etmeye ve genişletmeye yardımcı olmak için hücrelere gün aşırı müdahale edin. Final konsantrasyonu 50 units/mL olacak şekilde, insan rekombinant IL-2 ile desteklenmiş taze besiyeri ekleyin. Bir hafta sonra, otolog pbmc kültürü hazırlayın, hücreleri ışınlayın ve aynı hla ile iki saat boyunca pulse edin.Her birine 10 µg/mL konsantrasyonda iki bağlayıcı peptit ve 1 mL ışınlanmış otolog PBM CS ekleyerek kültürü yeniden stimüle edin. Bir hafta daha IL-2 ile desteklenmiş taze besiyeri eklemeye devam edin; ardından kültürleri ikinci kez aynı şekilde yeniden stimüle edin. Kültürde altı gün daha bekledikten sonra hücreler kullanıma hazır olacaktır.Zekâ empedans ölçüm istasyonunu, en az bir saat boyunca %5 karbon dioksit altında 37 °C'ye dengeleyerek kullanıma hazırlayın. %75 konfluensle büyümüş insan tümör hücrelerini %0,25 tripsin ve santrifüj kullanarak hasat edin. Tümör hücrelerini bir hemositometre ile sayın ve RPMI içinde yeniden süspande edin.Mikrolitre başına 7.500 hücre konsantrasksyonunda tümör ortamı. Ardından, Excel ajan yazılımı ile kuyucuk düzenini içeren yerleşim sayfası ayarlanır. Planlama sayfası, 40 saatlik bir süre boyunca her beş dakikada bir empedans ölçümü alacak şekilde ayarlanır; ilk 18 saat boyunca Xceligent sistemi yalnızca tümör hücrelerinin empedans ölçümlerini alacaktır.Ardından kuyu başına 100 µL RPMI tümör medyumu ekleyin. Hücreler yokken empedansı ölçerek ilgili EPL'lerin arka plan okumasını alın. Tümör hücreleri eklendikten sonra plakaları ilgili istasyona yerleştirin ve okumaları almaya başlayın.Tümör hücreleri hemen EPL'lere yapışmaya başlayacaktır. Yaklaşık 18 saatlik inkübasyonun ardından, tümör hücreleri EPL'lere tutunacak ve kuyuk başına 15.000 tümör hücresine ulaşarak sayıca iki katına çıkacaktır. Bu aşamada, hazırlanan T hücrelerini nazikçe sıyırma ve ajitasyon santrifüjü yoluyla toplayın.T hücrelerini, %10 FBS içeren RPMI besiyerinde yeniden süspanse edin ve bir hemositometre kullanarak sayın. Hücre yoğunluğu belirlendikten sonra, 200 mikrolitre T hücresi tümör hücrelerine eklendiğinde en yüksek konsantrasyonun tümör hücresi başına 40 T hücresi olacağı şekilde, T hücreleri için iki katlı bir dilüsyon serisi hazırlayın. Serinin son dilüsyonu, tümör hücresi başına 1,25 T hücresi sağlamalıdır.EXOGEN istasyonunu durdurun ve EPL'yi bir pipet yardımıyla çıkarın. Kuyucuklardaki besiyerini uzaklaştırın, ardından negatif kontrol olarak dilüsyon serisindeki tüm konsantrasyonları kullanarak 200 mikrolitre T hücresi yükleyin. Saf besiyeri kullanın, EPL'yi tekrar istasyona yerleştirin ve deneyin sonunda programı devam ettirin.Sonuçları normalize edin. Krom 51 ve krom 51 ile işaretlenmiş hedef hücrelerle çalışırken her zaman kurumsal radyasyon güvenliği prosedürlerini takip edin ve radyasyon maruziyetini azaltmak için koruyucu kalkan kullanın. Tümör hücrelerini, mililitre başına 1 milyon hücre konsantrasyonunda, mililitre başına 10 µL taze krom 51 ile iki saat boyunca pulse ederek işleme başlayın.Ardından, tümör hücrelerini %10 FBS içeren 10 mililitre RPMI besiyeri ile yıkayın, hücreleri santrifüjleyin ve aynı besiyeri içerisinde mililitre başına 1 milyon hücre olacak şekilde yeniden süspande edin. Daha sonra, 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakaya, spontan salınımı hesaplamak için kuyucuk başına 100.000 tümör hücresi ekleyin.Bu kuyucukların altısına ve diğer altı kuyucuğa başka hiçbir şey eklemeyin. Kalan tüm kuyucuklara, hücreleri liz etmek ve böylece maksimum salınımı hesaplamak için 100 µL Triton X 100 ekleyin. Daha önce hazırlanan dilüsyon serisini kullanarak plakaya T-hücrelerini ekleyin.Şimdi plakları beş saat boyunca inkübe edin ve her birinden 50 µL süpernatan örneği toplayın; plakları çeker ocakta oda sıcaklığında gece boyunca kuruttuktan sonra örnekleri bir luma plağına yükleyin. Bir gama sayacı kullanarak CPM değerlerini ölçün; T-hücreleri ve SKBR3 kanser hücreleri xCELLigence plaklarında kültüre edilmiş ve plak empedansının bir yansıması olan hücre indeksi ölçülmüştür, çünkü T-hücrelerinin çoğalmak için adhezyona ihtiyacı yoktur.40 saatlik bir kültür boyunca empedans üzerindeki etkileri ihmal edilebilir düzeydeydi. Tek başına kültüre edilen kanser hücreleri, artan bir empedans ölçümü gösterdi. Ancak, 18. saatte T hücrelerinin eklenmesi bu eğilimi bozmaktadır.Bu olay, T hücrelerinin eklenmesinin ardından yazılım normalizasyonu gerektirmektedir ve bir sonraki deneyde daha detaylı incelenmektedir. SK BR 3 hücreleri farklı T hücresi konsantrasyonları ile birlikte kültürlendiğinde, empedans değerlerindeki düşüşlerin T hücresi dozuna bağlı olduğu çok net bir şekilde görülmüştür; veriler üç deneme boyunca her beş dakikada bir 10. saat işaretine kadar toplanmıştır. Hücre indeksleri, T hücresi aralığı boyunca ikinci dereceden bir polinoma uymuş olup, bu durum Exogen istasyonunun CD8 T hücresi aracılı SK BR 3 tümör ölümünü hücre indeksindeki düşüş olarak gerçek zamanlı olarak izlediğini göstermektedir. T hücreleri tarafından SK BR 3 hücrelerinde meydana getirilen empedans düşüşlerinin antijene özgü olup olmadığını belirlemek için analizler yapılmıştır.Üç SK KBR hücresi, HER2/neu'yu tanımayan HLA A2 pozitif influenza spesifik T hücreleri ile birlikte kültüre edildi. Bu hücrelerin litik aktivitelerinin önemli ölçüde daha düşük olduğu görüldü; HER2/neu spesifik T hücrelerinin antijene özgü bir şekilde öldürme yapıp yapmadığını daha detaylı belirlemek için ko-kültürlere Fas ligandına karşı antikor eklendi. Antikor, HER2/neu P360-9 spesifik T hücrelerinin litik aktivitesini azaltmadı.Buna karşılık, anti CD3 ve CD28 boncukları ile spesifik olmayan şekilde aktive edilen T hücrelerinde, öldürme işleminin HLA sınıf I bağımlı bir şekilde gerçekleşip gerçekleşmediğini belirlemek için antikor lizi inhibe etti. Ko-kültürlere ya anti HLA sınıf I antikoru ya da izotip kontrol antikoru eklendi. Sonuçlar bu hipotezi güçlü bir şekilde destekledi.Ardından T hücreleri, bir beşe oranında diğer kanser hücreleri ile birlikte kültüre edildi. HLA A iki negatif tümör hücre hattı BT 20, negatif kontrol olarak kullanıldı. Sonuçlar, yöntemin birden fazla hedef içeren aderent tümör hücreleri için yararlı olduğunu göstermektedir.HER iki yeni P 360 9 spesifik T hücrelerinin ko-kültürleri, kromyum 51 ile işaretlenmiş hedef hücrelere eklenmiş ve ardından CRA analizi uygulanmıştır. İntelligençe testi, tutarlılığı analiz etmek için daha hassas görünmektedir. Analiz içi varyasyon, bir e 40 ve bir e beş arasındaki her hücre oranı için yüzdesel varyasyon katsayısı olarak hesaplanmıştır.Bu değer, en düşük hücre oranlarında %15'in altında ölçülmüştür. Ancak, CV yüzdesi yüksek veya öngörülemezdi. Ek olarak, farklı P 360 9 spesifik T-hücre hatlarıyla ko-kültür yoluyla SK BR üç T-hücresi lizisinin değişkenliği incelenmiştir.Veriler 30 gün arayla oluşturulmuştur. Deneyler üç paralel şeklinde gerçekleştirilmiş ve sonuçlar birbirine çok yakın çıkmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, empedans tabanlı bir yaklaşım kullanarak antijen spesifik CD8 T hücreleri ve tümör hücreleri aracılığıyla sitotoksik T-hücresi aktivitesinin nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

determining-optimal-cytotoxic-activity-human-her2neu-specific-cd8-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu tümör hedef hücreleri ile inkübe zaman T hücrelerinin sitotoksisiteye ölçmek için bir tek hücreli yüksek verim tahlil açıklanmaktadır. Bu yöntem, mekansal olarak tanımlanan oranlarda T hücreler ve hedef hücrelerin sınırlandırmak için alt nanolitre kuyular (~ 100.000 kuyu / dizi) ve bir yoğun, elastomerik dizisi kullanır ve efektör-hedef konjugasyon ve daha sonra apoptoz izlemek için flüoresan mikroskop ile birleştirilmiştir.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Bu protokol, hassas, hücre bazlı bir sitotoksisite testini tanımlar. Artan sayıda efektör CD8 + T hücresinin varlığında canlı hedef CD4 + T hücrelerinin frekansındaki azalmayı numaralandırarak, bu test antijene özgü CD8 + T hücrelerinin sitolitik aktivitesinin doğrudan değerlendirilmesine izin verir.

Sitotoksik Aktiviteyi Ölçmek için Hücre Bazlı Akış Sitometrisi Testi

Sıvı ve katı tümör hücrelerini hedefleyen kimerik antijen reseptör T hücrelerinin gücünü değerlendirmek için kantitatif gerçek zamanlı in vitro sitoz ispat sistemini tanımlıyoruz. Bu protokol diğer bağışıklık etki hücreleri değerlendirmek için uzatılabilir, yanı sıra kombinasyon tedavileri.

Katı ve Hematolojik Kanser Hücrelerini Hedefleyen İmhimik Antijen Reseptör T Hücreleri Için Gerçek Zamanlı Potens Tsay

Burada, antitümör T hücre etkinlik fenotipik ve fonksiyonel analiz için izin veren bir tüp bebek ortak kültür yöntemi yinelemeli olarak meydan tümör hedefli T hücreleri, açıklayın.

Vitro tümör hücre Rechallenge içinde akıllı Chimeric antijen reseptör T hücre antitümör işlevi değerlendirilmesi için

Burada, sitotoksisik T lenfosit (CTL) yanıt olarak bir model tümör antijeni için immundominance muayene sağlayan bir akış sitometri tabanlı in vivo öldürme tahlil tarif. Biz bu zarif tahlil mekanik çalışmalar için ve ilaç etkinliği test için istihdam olabilir nasıl örnekler sunuyoruz.

Tümör-spesifik CD8+ T hücre tepkiler Immunodominance çalışması Için In vivo sitotoksisite assays terzilik

Kanser dokularına benzer ancak 96 kuyulu ve 384 kuyu plakalı in vitro yüksek verimli tahlil sistemleri için uygun olmayan, hasta kaynaklı tümör organoidleri (PDO) kullanan antikanser ilaçları değerlendirmek için son derece hassas bir in vitro yüksek verimli tahlil sistemi geliştirilmiştir.

Hasta Kaynaklı Tümör Organoidleri Kullanılarak Yüksek Verimli In Vitro Tahlil

Bu protokol, terapötik bir anti-HER-2 antikoru varlığında doğal öldürücü hücre aracılı meme kanseri hücresi öldürmeyi modüle eden bileşikleri tanımlamak için otomatik, görüntü tabanlı yüksek verimli bir teknik sunar.

Antikor Bağımlı Hücresel Sitotoksisiteyi Modifiye Eden Bileşiklerin Tanımlanması için Yüksek İçerikli Tarama Testi

Burada, antitümör antikorların önemli bir kanser hücresi öldürme mekanizması olan ADCC mekanizmasını modüle eden bileşikleri tanımlamak için bir yöntem sunuyoruz. NK hücrelerinin sitotoksik etkisi, Trastuzumab varlığında meme kanseri hücre sferoidlerinde ölçülür. Görüntü analizi, sferoidlerdeki canlı ve ölü öldürücü ve hedef hücreleri tanımlar.

Bir Tümör Sferoid Modelinde Antikora Bağımlı Hücresel Sitotoksisitenin Ölçülmesi: İlaç Keşfi Uygulaması

Burada, bir ADCC biyo-tahlil kiti kullanarak antikora bağımlı, hücre aracılı sitotoksisite (ADCC) testi için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, ADCC mekanizmasını aydınlatmak ve kanser immünoterapisinde antikorların terapötik potansiyelini değerlendirmek için değerli bir araç sunmaktadır.

Antikora Bağımlı Hücre Aracılı Sitotoksisite Raportörü Biyotahlil Kullanılarak Kanser Hücrelerinde Antikora Bağımlı, Hücre Aracılı Sitotoksisitenin Değerlendirilmesi

Mevcut protokol, önceden tedavi edilmiş tümör hücreleri ile allojenik bir ko-kültür sisteminde insan T hücresi stimülasyonunun ex vivo analizine izin veren deneysel bir iş akışını açıklamaktadır.

Önceden İşlem Görmüş Tümör Hücrelerinin Allojenik Ko-Kültür Ortamında İnsan T Hücresi Aktivitesinin Analizi

Bu protokol, canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi kullanılarak insan doğal katil hücrelerinin doğal, kimerik antijen reseptörü aracılı ve antikor bağımlı sitotoksisitesinin tutarlı ölçümü için standartlaştırılmış bir in vitro iş akışı sağlar.

Canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi kullanarak kimerik antijen reseptörleri ve terapötik antikorlarla potantize edilen NK-hücre sitotoksisitesinin nicelendirilmesi

Öğrenin, xCELLigence sistemi ile Cr51 yayın assay'ini karşılaştırarak HER2neu özgül CD8 T hücrelerinin sitotoksik aktivitesini gerçek zamanlı ve etiketsiz ölçme yöntemini. Bu teknik, kanser immünoterapisi araştırmalarında daha yüksek hassasiyet ve düşük hücre gereksinimi sunar.

XCELLigence Sistemi Cr51 Yayın Assay Karşılaştırılması tarafından İnsan Her2neu Özgül CD8 T hücrelerinin Optimal Sitotoksik Aktivite Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal

XCELLigence Sistemi Cr51 Yayın Assay Karşılaştırılması tarafından İnsan Her2neu Özgül CD8 T hücrelerinin Optimal Sitotoksik Aktivite Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet