XCELLigence Sistemi Cr51 Yayın Assay Karşılaştırılması tarafından İnsan Her2neu Özgül CD8 T hücrelerinin Optimal Sitotoksik Aktivite Belirlenmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, EXOGEN sistemini kullanan empedans tabanlı bir yaklaşımı krom salınım testi ile karşılaştırarak sitotoksik T-hücresi aktivitesini belirlemektir. İlk adım, fial kullanılarak tam kandan periferik kan mononükleer hücrelerinin ayrıştırılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, antijene özgü CD eight T hücreleri oluşturmak için PBMC'ler; peptit antijen, insan rekombinant IL two ve ışınlanmış PBMC ile birlikte kuyucuklara eklenir.

Her iki deneyde de, tümör hücresi ölümünü tetiklemek amacıyla antijene özgü CD8 T hücreleri tümör hücreleri ile birlikte kültürlenir. Hem empedans yöntemi hem de kromyum salınım analizi kullanılarak tümör hücrelerinin yüzde lizi üzerinden sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, kromyum salınım analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, empedans tabanlı sistemin gerçek zamanlı veri toplaması ve herhangi bir işaretleme gerektirmeyen daha az hücreye ihtiyaç duymasıdır. Bu protokol için, üretici protokolü takip edilerek normal sağlıklı HLA-A2 pozitif donörlerden alınan kan, PBMC veya periferik kan mononükleer hücre kaynağı sağlar.

P BMC'leri kandan ayırmak için F call PA plus kullanın. Ardından, altı kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna iki mililitre besiyeri içerisinde yaklaşık 4 milyon P BMC yükleyin. Her kuyucuğa, kültürde 10 µg/mL son konsantrasyon elde edecek şekilde HLAA iki bağlanma peptidi ekleyin.

T hücrelerini stimüle etmeye ve genişletmeye yardımcı olmak için hücrelere gün aşırı işlem uygulayın. Final konsantrasyonu 50 units/mL olacak şekilde, insan rekombinant IL-2 ile takviye edilmiş taze besiyeri ekleyin. Bir hafta sonra, otolog pbmc kültürü hazırlayın, hücreleri ışınlayın ve aynı hla ile iki saat boyunca pulse edin.

Her birine 10 µg/mL konsantrasyonunda iki bağlayıcı peptid ekleyerek kültürü yeniden stimüle edin; bunun için her bir kuyuya 1 mL ışınlanmış otolog PBM CS ekleyin. Bir hafta sonra, gün aşırı olarak IL-2 ile desteklenmiş taze besiyeri eklemeye devam edin ve kültürleri aynı şekilde ikinci kez yeniden stimüle edin. Kültürde altı gün daha bekledikten sonra hücreler kullanıma hazır olacaktır.

İstihbarat empedans ölçüm istasyonunu, en az bir saat boyunca %5 karbon dioksit altında 37 °C'ye dengeleyerek kullanıma hazırlayın. %75 konfluan insan tümör hücrelerini %0,25 tripsin ve santrifüjasyon kullanarak toplayın. Tümör hücrelerini bir hemositometre ile sayın ve RPMI içinde yeniden süspanse edin.

Mikrolitre başına 7.500 hücre konsantrasyonunda tümör medyumu. Ardından, Excel agent yazılımı ile kuyucuk düzenini içeren yerleşim sayfası ayarlanır. Zamanlama sayfası, 40 saatlik bir süre boyunca her beş dakikada bir empedans okuması alacak şekilde yapılandırılır; ilk 18 saat boyunca Xceligent sistemi yalnızca tümör hücrelerinin empedans okumalarını alacaktır.

Ardından, kuyuk başına 100 µL RPMI tümör medyumu ekleyin. Hücreler yokken empedansı ölçerek EPL'ler üzerinden bir arka plan okuması yapın. Tümör hücreleri eklendikten sonra, plakaları istasyona yerleştirin ve okumaları almaya başlayın.

Tümör hücreleri hemen EPL'lere yapışmaya başlayacaktır. Yaklaşık 18 saatlik inkübasyonun ardından, tümör hücreleri EPL'lere tutunmuş olacak ve kuyuk başına 15.000 tümör hücresine ulaşarak sayıca iki katına çıkacaktır. Bu aşamada, hazırlanan T hücrelerini hafifçe sıyırarak ve ajitasyonlu santrifüj kullanarak toplayın.

T hücrelerini %10 FBS içeren RPMI besiyeri ile yeniden süspande edin ve bir hemositometre kullanarak hücre sayımı yapın. Hücre yoğunluğu belirlendikten sonra, 200 µL T hücresi tümör hücrelerine eklendiğinde en yüksek konsantrasyonun tümör hücresi başına 40 T hücresi olacağı şekilde iki katlı bir dilüsyon serisi hazırlayın. Serinin son dilüsyonu, tümör hücresi başına 1,25 T hücresi sağlamalıdır.

EXOGEN istasyonunu durdurun ve EPL'yi bir pipet yardımıyla çıkarın. Kuyucuklardaki besiyerini boşaltın, ardından negatif kontrol olarak dilüsyon serisindeki tüm konsantrasyonları kullanarak 200 µL T hücresi yükleyin. Saf besiyeri kullanın, EPL'yi istasyona geri yerleştirin ve deney sonunda programı devam ettirin.

Sonuçları normalize edin. Chromium 51 ve chromium 51 ile işaretlenmiş hedef hücrelerle çalışırken her zaman kurumsal radyasyon güvenliği prosedürlerini takip edin ve radyasyon maruziyetini azaltmak için zırhlama kullanın. Tümör hücrelerini, mililitre başına 1 milyon hücre yoğunluğunda, mililitre başına 10 µL taze chromium 51 ile iki saat boyunca pulse ederek işleme başlayın.

Ardından, tümör hücrelerini 10% FBS içeren 10 mililitre RPMI besiyeri ile yıkayın, hücreleri santrifüjleyin ve aynı besiyeri içerisinde mililitre başına 1 milyon hücre olacak şekilde yeniden süspanse edin. Daha sonra, 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakaya, spontan salınımı hesaplamak için kuyucuk başına 100.000 tümör hücresi ekleyin.

Bu kuyucukların altısına ve diğer altı kuyucuğa başka hiçbir şey eklemeyin. Kalan tüm kuyucuklara, hücreleri liz etmek ve böylece maksimum salınımı hesaplamak için 100 µL Triton X 100 ekleyin. Daha önce hazırlanan dilüsyon serisini kullanarak plakaya T-hücreleri ekleyin.

Şimdi plakları beş saat boyunca inkübe edin ve her birinden 50 µL süpernatan örnekleri toplayın; plakları çeker ocakta oda sıcaklığında gece boyunca kuruttuktan sonra örnekleri bir luma plağına yükleyin. Bir gama sayıcı kullanarak CPM değerlerini ölçün. T hücreleri ve SKBR 3 kanser hücreleri X intelligence plaklarında kültüre edilmiş ve plak empedansının bir yansıması olan hücre indeksi ölçülmüştür, çünkü T hücrelerinin çoğalmak için adezyona ihtiyacı yoktur.

40 saatlik bir kültür boyunca empedans üzerindeki etkileri ihmal edilebilir düzeydeydi. Tek başına kültüre edilen kanser hücreleri, artan bir empedans ölçümü sergiledi. Ancak, 18. saatte T hücrelerinin eklenmesi bu eğilimi bozmaktadır.

Bu olay, T hücrelerinin eklenmesinden sonra yazılımsal normalizasyon gerektirir ve bir sonraki deneyde daha ayrıntılı olarak incelenir. SK BR three hücreleri farklı konsantrasyonlardaki T hücreleri ile birlikte kültüre edildiğinde, empedanstaki düşüşlerin T hücresi dozuna bağımlı olduğu çok net bir şekilde görülmüştür; veriler üç deneme boyunca 10. saat işaretinde her beş dakikada bir toplanmıştır. Hücre indeksleri, T hücreleri aralığında ikinci dereceden bir polinomu takip etmiştir; bu durum, Exogen istasyonunun CD eight T hücresi aracılı SK B three tümör ölümünü, hücre indeksindeki bir düşüş olarak gerçek zamanlı izlediğini göstermektedir. T hücreleri tarafından SK BR three hücrelerinde meydana getirilen empedans düşüşlerinin antijen spesifik olup olmadığını belirlemek için analizler yapılmıştır.

SK KBR üç hücresi, HER2'yi tanımayan HLA A2 pozitif FLU spesifik T hücreleri ile birlikte kültürlenmiştir. Bu hücrelerin litik aktivitesi önemli ölçüde daha düşük bulunmuştur. HER2 spesifik T hücrelerinin antijene özgü bir şekilde öldürme yapıp yapmadığını daha fazla belirlemek için ko-kültürlere Fas ligandı antikoru eklenmiştir. Antikor, HER2 P 360 9 spesifik T hücrelerinin litik aktivitesini azaltmamıştır.

Ancak, anti CD three, CD 28 boncukları ile spesifik olmayan şekilde aktive edilmiş T hücrelerinde, öldürme işleminin HLA sınıf bir bağımlı bir şekilde gerçekleşip gerçekleşmediğini belirlemek için antikor lizisi inhibe etmiştir. Ko-kültürlere ya anti HLA sınıf bir antikoru ya da izotip kontrol antikoru eklenmiştir. Sonuçlar bu hipotezi güçlü bir şekilde desteklemiştir.

T hücreleri daha sonra, bir beşe oranıyla diğer kanser hücreleri ile birlikte kültüre edildi. HLA A iki negatif tümör hücre hattı BT 20, negatif kontrol olarak kullanıldı. Sonuçlar, yöntemin çoklu hedef yapışkan tümör hücreleri için yararlı olduğunu göstermektedir.

HER iki yeni P 360 9 spesifik T hücrelerinin ko-kültürleri, kromyum 51 ile işaretlenmiş hedef hücrelere eklenmiş ve ardından CRA analizi yapılmıştır. İntelligense analizi, tutarlılığı analiz etmek için daha hassas görünmektedir. Deney içi varyasyon, bir'e 40 ile bir'e beş arasındaki her hücre oranı için varyasyon katsayısı yüzdesi olarak hesaplanmıştır.

Bu değer, en düşük hücre oranlarında %15'in altında ölçülmüştür. Ancak, CV yüzdesi yüksek veya öngörülemezdi. Ek olarak, farklı P 360 9 spesifik T-hücre hatları ile ko-kültür yoluyla SK BR üç T-hücre lizisinin değişkenliği incelenmiştir.

Veriler 30 gün arayla oluşturulmuştur. Deneyler üç paralel olarak gerçekleştirilmiş ve sonuçlar birbirine çok yakın çıkmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, empedans tabanlı bir yaklaşım kullanarak antijene özgü CD8 T hücreleri ve tümör hücreleri aracılığıyla sitotoksik T hücresi aktivitesinin nasıl belirleneceği konusunda kapsamlı bir bilgi edinmiş olmalısınız.