XCELLigence Sistemi Cr51 Yayın Assay Karşılaştırılması tarafından İnsan Her2neu Özgül CD8 T hücrelerinin Optimal Sitotoksik Aktivite Belirlenmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, EXOGEN sistemini kullanan empedans tabanlı bir yaklaşımı krom salım testi ile karşılaştırarak sitotoksik T hücresi aktivitesini belirlemektir. İlk adım, periferik kan mononükleer hücrelerinin fial kullanılarak tam kandan ayrılmasıyla elde edilir. Daha sonra, PBMC, antijene özgü CD sekiz T hücreleri oluşturmak için peptit antijeni, insan rekombinant IL iki ve ışınlanmış PBMC ile birlikte kuyucuklara eklenir.

Antijene özgü CD sekiz T hücresi daha sonra tümör hücresi ölümüne neden olmak için her iki testte de tümör hücreleri ile birlikte kültürlenir. Hem empedans yöntemi hem de krom salınım testi kullanılarak tümör hücrelerinin yüzde parçalanmasını gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin krom salınım testi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, empedans tabanlı sistemin gerçek zamanlı veri toplaması ve herhangi bir etiketlemeye ihtiyaç duymayan daha az hücre gerektirmesidir Bu protokol için, normal sağlıklı HLA A iki pozitif donörden alınan kan, üreticinin protokolünü takiben bir pbmc veya periferik kan mononükleer hücre kaynağı sağlar.

P BMC'leri kandan ayırmak için F çağrısı PA plus'ı kullanın. Altı kuyulu plakanın yanında, kuyu başına iki mililitre ortama yaklaşık 4 milyon P BMC yüklenir. Her birine, mililitre kültür başına 10 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon için HLAA iki bağlayıcı peptit ekleyin.

T hücrelerini uyarmaya ve genişletmeye yardımcı olmak için alternatif günlerde hücreler. Mililitre başına 50 birimlik bir nihai konsantrasyon için insan rekombinant IL iki ile desteklenmiş taze ortam ekleyin. Bir hafta sonra, bir otolog pbmc kültürü hazırlayın, hücreleri ışınlayın ve aynı hla ile iki saat boyunca nabız atın.

Mililitre başına 10 mikrogramda iki bağlayıcı peptit, her birine bir mililitre ışınlanmış otolog PBM CS ekleyerek kültürü yeniden uyarır. Bir hafta sonra alternatif günlerde IL iki ile desteklenmiş taze medya eklemeye devam edin, kültürleri ikinci kez aynı şekilde yeniden canlandırın. Kültürde altı gün daha kaldıktan sonra, hücreler kullanıma hazır olacaktır.

İstihbarat empedans ölçüm istasyonunu en az bir saat boyunca %5 karbondioksit altında 37 santigrat dereceye dengeleyerek kullanıma hazırlayın. % 0.25 tripsin ve santrifüjleme kullanarak% 75 birleşik insan tümör hücrelerini hasat edin. Bir hemo sitometre kullanarak tümör hücrelerini sayın ve bunları RPMI'de yeniden oluşturun.

Mikrolitre başına 7.500 hücre konsantrasyonunda tümör ortamı. Sonraki program, Excel aracı yazılımı, düzen sayfasını kuyu düzeni ile ayarlar. Program sayfasını, ilk 18 saat boyunca 40 saatlik bir süre boyunca her beş dakikada bir empedans okumaları alacak şekilde ayarlayın, Xceligent sistemi yalnızca tümör hücrelerinin empedans okumalarını alacaktır.

Daha sonra kuyucuk başına 100 mikrolitre RPMI tümör ortamı ekleyin. Hücrelerin yokluğunda empedansı ölçerek bu nedenle EPL'ler hakkında bir arka plan okuması yapın. Tümör hücreleri eklendikten sonra, plakaları bu istasyona yükleyin ve okuma almaya başlayın.

Tümör hücreleri hemen EPL'lere yapışmaya başlayacaktır. Yaklaşık 18 saatlik inkübasyondan sonra, tümör hücreleri EPL'lere bağlanacak ve kuyu başına 15.000 tümör hücresine iki katına çıkacaktır. Bu sırada, hazırlanan T hücrelerini nazikçe kazıma ve çalkalama santrifüjü ile hasat edin.

T hücreleri, bunları %10 FBS ile RPMI ortamında sulandırır ve bir hemo sitometre kullanarak sayar. Hücre yoğunluğu bilindikten sonra, tümör hücrelerine 200 mikrolitre T hücresi eklendiğinde, en yüksek konsantrasyon tümör hücresi başına 40 T hücresi olacak şekilde iki katlı bir seyreltme serisi T hücresi hazırlayın. Serinin son seyreltilmesi, tümör hücresi başına 1.25 T hücresi sağlamalıdır.

EXOGEN istasyonunu duraklatın ve bir pipet kullanarak EPL'yi çıkarın. Ortamı kuyucuklara çıkarın, ardından seyreltme serisindeki tüm konsantrasyonları negatif kontrol olarak kullanarak 200 mikrolitre T hücresi yükleyin. Saf ortam kullanın, EPL'yi istasyona geri getirin ve testin sonunda programa devam edin.

Sonuçları normalleştirin. Krom 51 ve krom 51 etiketli hedef hücrelerle çalışırken daima kurumsal radyasyon güvenliği prosedürlerini izleyin ve radyasyona maruz kalmayı azaltmak için korumayı kullanın. Tümör hücrelerini mililitrede 1 milyon hücrede iki saat boyunca nabız atarak başlayın ve mililitre başına 10 mikrolitre taze krom 51 ile.

Daha sonra, tümör hücrelerini 10 mililitre RPMI ortamında% 10 FBS ile yıkayın, hücreleri santrifüjleyin ve mililitre başına 1 milyon hücrede aynı ortamda yeniden oluşturun. Sonra 96 kuyulu yuvarlak bir alt plakaya. Spontan salınımı hesaplamak için kuyu başına 100.000 tümör hücresi ekleyin.

Bu kuyuların altısına diğer altı kuyuya başka bir şey eklemeyin. Hücreleri ayırmak için 100 mikrolitre Triton X 100 ekleyin ve böylece kalan tüm kuyucuklara maksimum salınımı hesaplayın. Daha önce hazırlanan seyreltme serisini kullanarak plakaya T hücreleri ekleyin.

Şimdi plakaları beş saat inkübe edin ve her birinden 50 mikrolitre süpernatan numunesi toplayın, plakaları gece boyunca oda sıcaklığında davlumbazda kuruttuktan sonra numuneleri bir luma plakasına iyice yükleyin. Bir gama sayacı, T hücresi ve SKBR üç kullanarak CPM'lerini ölçün. Kanser hücreleri X zeka plakaları üzerinde kültürlendi ve hücre indeksi ölçüldü, bu da plaka empedansının bir yansımasıdır çünkü T hücreleri çoğalmak için yapışmaya ihtiyaç duymaz.

Empedans üzerindeki etkileri 40 saatlik bir kültürde ihmal edilebilir düzeydeydi. Tek başına kültürlenen kanser hücreleri, artan bir empedans ölçümü gösterdi. Bununla birlikte, 18 saatte bir T hücrelerinin eklenmesi bu eğilimi bozar.

Bu olay, T hücrelerinin eklenmesinden sonra yazılım normalizasyonu gerektirir ve bir sonraki deneyde daha fazla araştırılmıştır. SK BR üç hücresi, değişen konsantrasyonlarda T hücreleri ile birlikte kültürlendiğinde, empedanstaki azalmalar çok açık bir şekilde T hücresi dozuna bağlıydı, veriler 10 saatlik işarette üç deneme boyunca her beş dakikada bir toplandı. Hücre indeksleri, T hücreleri aralığı boyunca ikinci dereceden bir polinom izledi, bu da Exogen istasyonunun, T hücreleri tarafından SK BR üçünün empedansındaki azalmaların antijene özgü olup olmadığını belirlemek için hücre indeksinde bir düşüş olarak SK B'nin üç tümörünün CD sekizinci T hücresi aracılı ölümünü gerçek zamanlı olarak izlediğini gösteriyor.

SK KBR üç hücre, HER'yi tanımayan iki pozitif FLU spesifik T hücresi olan HLA A ile ko-kültürdü. Bu hücreler, iki yeni spesifik T hücresinin antijene özgü bir şekilde öldürüp öldürmediğini daha fazla belirlemek için önemli ölçüde daha az litik aktiviteye sahipti, hızlı liganda karşı antikor kokültürlere dahil edildi. Antikor, HER iki yeni P 360 9 spesifik T hücresinin litik aktivitesini azaltmadı.

Bununla birlikte, anti CD üç, CD 28 boncukları ile spesifik olarak aktive edilmeyen T hücreleri ile antikor, öldürmenin HLA sınıf bir bağımlı şekilde meydana gelip gelmediğini belirlemek için lizisi inhibe etti. Ko kültürlere anti HLA sınıf bir antikor veya izotip kontrol antikoru eklendi. Sonuçlar bu hipotezi güçlü bir şekilde destekledi.

T hücreleri daha sonra diğer kanser hücreleri ile bir ila beş oranında birlikte kültürlendi. HLA A iki negatif tümör hücre hattı BT 20 negatif kontrol olarak kullanıldı. Sonuçlar, yöntemin çoklu hedef yapışık tümör hücreleri için yararlı olduğunu göstermektedir.

HER iki yeni P 360 9 spesifik T hücresinin kokültürleri, krom 51 etiketli hedef hücrelere eklendi ve ardından CRA analizi yapıldı. İstihbarat tahlili, tutarlılığı analiz etmek için daha hassas görünmektedir. Test içi varyasyon, her hücre oranında bir ila 40 ve bir ila beş arasındaki varyasyon katsayısı olarak hesaplandı.

Bu, en düşük hücre oranlarında %15'in altında ölçülmüştür. Ancak, CV yüzdesi yüksek veya tahmin edilemezdi. Ek olarak, SK BR üç T hücresi lizizinin farklı P 360 9 spesifik T hücresi hatları ile ko-kültür ile değişkenliği incelenmiştir.

Veriler 30 gün arayla oluşturuldu. Tahliller üç nükte halinde yapıldı ve sonuçlar çok benzerdi. Bu videoyu izledikten sonra, empedans tabanlı bir yaklaşım kullanarak antijene özgü CD sekiz T hücreleri ve tümör hücreleri kullanılarak sitotoksik T hücresi aktivitesinin nasıl belirleneceğini iyi anlamış olmalısınız.