Name: Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi Drosophila Larva ve Pupa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Öğrenin Drosophila larva ve pupa dönemlerinde proprioseptif kordotonal organları immün boyama ve konfokal mikroskopi ile görselleştirme yöntemini. Bu teknik duyu organı gelişimi araştırmaları için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar bize antikorlar göndermek için Iowa Üniversitesi Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı tarafından sağlanan hibe (No: 29/08) tarafından desteklenmiştir. AS de DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) bir araştırma bursu ile desteklenmektedir.

Başlamadan önce <ol><li> İstediğiniz sinek kültürleri büyütün. (50 ml flakon başına yaklaşık 30 sinekler) bulursunuz şişeleri tutun. Sinekler Her flakon yalnızca bir gün için yumurtalarını edelim. Bu larvalar yeterli gıda kaynağı sağlamak ve onlara gıda dışında tarama öncesi maksimal büyüklüğe ulaşmak sağlayacaktır. Üçüncü dönem larvalar flakon duvara dolaşmaya başlar kadar uygun sıcaklık şişeleri tutun. </li><li> Fosfat taze bir stok (PBS) ve PBT (PBS içinde% 0.1 Tween) tamponlu hazırlayın. Buz üzerinde 10 ml PBS tutmak. </li><li> Taze sabitleştirici 1-5 ml (PBT% 4 Formaldehit) hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Biz bir stok çözüm olarak şişelenmiş 37-38% formaldehit kullanın. </li></ol> 1. Üçüncü Larvalar diseksiyonu ve Fiksasyon <ol><li> Flakon duvardan bir gezgin Üçüncü dönem larva alın ve bir Sylgard diseksiyon plaka (bir de Sylgard 184 silikon elastomer kiti, Dow Corning Corporation yapılan buz gibi soğuk PBS bir 50 ul damlasının içine yerleştirdiğinizdedoku kültürü çanak). </li><li> Ince forseps (Dumont # 5 forseps) kullanarak, ağız kancalar yakınında, larva, dorsal yüzü yukarı tutun ve larva beyninde bir böcek pin (minutien, 0,1 mm, paslanmaz çelik) sopa. </li><li> Forseps ile larva posterior ucundan tut, hafifçe çekin ve yavaşça boyuna larva germek. Iki posterior spiracles arasındaki bir başka böcek pin sopa. </li><li> Kullanımı bahar makas anterior ve posterior iğne yakın vücut duvarı iki yatay insizyon (dik ön-arka eksen), kesti. </li><li> Yay makas kullanılarak posterior insizyon anterior gelen dorsal orta hat boyunca larva vücut duvarı kesti. </li><li> Ince forseps kullanılarak iç organlar (bağırsak, tükürük bezleri, Malpighi tüpleri tübüller vb) ve trakea çıkarın. PBS ile bir veya iki kez yıkayın. </li><li> Onları germek ve her tarafı için iki böcek pimleri kullanarak tabagina pin, forseps ile iki gövde duvarı flep tut. </li><li> P çıkarınBS ve sabitleme solüsyonu (PBT% 4 formaldehit) 50 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. </li><li> Sabitleştirici çıkarın. PBS ile iki kez yıkayın. Böcek pimleri çekin. Kullanımı bahar makas dikdörtgen köşe bırakarak larva baş ve kuyruk kesilir. PBS ile soğutulmuş Eppendorf tüpüne sabit doku aktarın. </li><li> Larvalar yeterli sayıda sabitlenir sonra, bir antikor boyama doğrudan devam edebilir. Derhal boyama arzu edilmediği takdirde, sabit bir larva% 95 etanol ile 3 defa, 5 dakika, her biri yıkanmış ve -20 ° C&#39;de% 95 etanol içinde saklanmalıdır </li></ol> 2. Diseksiyon ve Pupalar Fiksasyonu Bölüm I <ol><li> Üçüncü dönem larva pupariate alıncaya kadar, larva fiksasyon gibi şişelere katılın. Şişeleri pupariated var her saat ve işareti larva inceleyin. İşaretli pupa 29 at 24 ° C veya 24-27 saat sonra 30-40 saat geliştirmek için izin ° C. </li><li> Ince forseps kullanma th 20-30 pupa almake uygun yaş ve karanlık bir porselen çok iyi diseksiyon tabağına koyun. Ilgi dokulara zarar vermemek için dikkatli olun. </li><li> Pupa halinde gelen pupa ayıklayın. Operculum&#39;un soyulmuştu başlayın ve pupa serbest kalıncaya kadar devam eder. Iyi PBT dolu içine pupa koyun. Tüm pupa ayıklanması devam edin. Adımlar 2,4-2,6 bir seferde beş pupa küçük gruplar halinde yapılmalıdır. </li><li> Diseksiyon çanağı kuyuları arasındaki düz bir yüzey üzerine beş pupa yerleştirin. Bir mikro diseksiyon bıçak kullanarak baş ucu kesilir ve karın arka ucu (alternatif olarak, pupa her iki ucunda delik gözyaşı forseps iki çift kullanmak mümkündür). </li><li> Ince forseps kullanılarak yerinde pupa tutun ve ön delikten PBT enjekte edilerek, pupa ve iç organları dışarı yıkamak için 1 ml şırınga kullanın. </li><li> Bir de PBS ile dolu onu batırarak disseke pupa kısaca yıkayın ve buz üzerinde tutulmalıdır bir Eppendorf tüp soğuk fiksatif içine taşıyın. </li><li> 4 de (ON) gece inkübe ° C </li></ol> Bölüm II <ol start="8"><li> Sabitleştirici atın ve PBT ile pupa üç kez, 5 dakika, her biri yıkayın. Buz üzerinde yıkanmış pupa tutun. </li><li> PBT ile diseksiyon çanağı iki kuyu doldurun. Kuyu birine bir polietilen Pasteur pipeti transferi birkaç pupa kullanma. </li><li> Ikinci kuyuya bir defada bir pupa taşıyın. Kanat şeffaf pupa kütikül soyulabilir, mükemmel sıralanmış uçları sivri forseps iki çift Kullanımı: forseps iyi kullanan bir çift altına pupa güvenli ve yavaşça forseps, ikinci çifti kullanılarak kütikül gözyaşı. Bir kez manikür soyulması kanat kapalı, yırtılıyor. Pupa gelen kanat kesmek için dikkatli olun. Kanat bıçaklı kütikül soyulmuştu sonra, kanat menteşe (burada kanat ChOs bulunmaktadır) kütikül soyulması devam ediyor. </li><li> Kanat kütikül soyulmuştu sonra, benzer bir şekilde bacak kütikül soyulmuştu girişiminde bulunabilir.Birçok bacak sürecinde kayıp olması muhtemeldir, ama büyük ölçüde bacak ChOs ve boyama geliştirir yana düşük verim rağmen, bu adımı şiddetle tavsiye edilir. Haltere ve karın ChOs daha kütikül soyulmuştu kalmadan görüntülenebilmekte. </li><li> Metanol ile dolu bir Eppendorf tüp içinde &#39;soyulmuş&#39; pupa yerleştirin ve oda sıcaklığında tutun. Tüm pupası kütikül soyulmuştu devam edin ve aynı tüp ekleyebilirsiniz. En az 10 güzel soyulmuş pupa Her boyama için toplanmalıdır. </li><li> Metanol kaldırmak ve% 95 etanol ile üç kez, 5 dakika, her biri yıkanır. Sabit pupa -20 ° C&#39;de% 95 Etanol içinde uzun süre için muhafaza edilebilir </li></ol> 3. Larva ve Pupa ve İmmünoboyama <ol><li> Oda sıcaklığında PBT üç kere, 30 dakika, her biri ile sabit bir doku yıkanır. Larva dönen bir plaka üzerinde hafif sarsıntı ile yıkanabilir. Pupa sallayarak olmadan yıkanır. </li><li> Engelleme tampon ile (PBT değiştirin PBT +% 5 normal keçi serum) ve 4 ON inkübe ° C </li><li> Engelleme tamponu çıkarın ve 4 ° C&#39;de ON birincil antikorlar (tampon engelleme ile sulandırılmış) ile inkübe </li><li> 3.1 adımda açıklandığı gibi PBT ile dört kez yıkayın. </li><li> 4 ° C&#39;de ON sekonder antikor ile PBT ve inkübe (tampon engelleme ile sulandırılmış) çıkarın </li><li> PBT ile iki kez yıkayın ve bir kez PBS ile 3.1 adım olarak tanımlanmıştır. </li><li> Montaj orta (Dako Floresan Montaj Orta (Dako Cytomation, Glostrup, Danimarka) ve 4 ° C&#39;de inkübe ON PBS değiştirin. </li></ol> 4. Larva montajı <ol><li> Larva kendi manikür aşağı bakacak ve vücut duvarı kasları yukarı bakacak şekilde monte medya damlasının bir mikroskop lamı üzerine monte edilir. Temiz bir kapak kayma montaj orta küçük bir damla koyun ve hazırlık kapsayacak şekilde kullanabilirsiniz. Monte larvaları üzerinde herhangi bir baskı uygulamayın. </li></ol> 5.. Pupa montajı <ol><li> İki mikroskop slaytlar hazırlayınmontaj orta, diseksiyon için bir ve montaj için ikinci bir damla. </li><li> Slaytların birinde birkaç pupa koyun. </li><li> Kullanımı bahar makas baş ve karın arka kısmını kaldırın. </li><li> Kanatları ve bacakları arasındaki kesim tarafından ventral yarısından itibaren toraks dorsal yarısını ayırın. </li><li> Montaj çözümü bir damla ikinci mikroskop lamı üzerine pupa ve disseke vücut parçaları yerleştirin. Kanatlarını ve bacaklarını uzatmış olduğundan emin olun ve dokuların bindirilirken mümkün olduğunca en aza indirmeye çalışın. </li><li> Bir kapak kayma monte orta bir damla koyun ve örnek üzerine yerleştirin. Monte örnek üzerinde baskı uygulamayın. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Üçüncü dönem larva immüno-lekeli ChOs bir örnek, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Bu örnekte sekiz ChOs yedi açıkça görülebilir olduğu bir güzel bir şekilde gerilmiş karın segmenti gösterir. Nöronlar laboratuvarı vardırMAb22C10 (Iowa Üniversitesi&#39;nde Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası elde 1:20,) ile eLED;. kap, ligaman, kap-eki ve bağ eki hücreleri, anti-αTub85E (1:10, Klein ve ark, etiketli 2010). Floresan boyama için İkincil antikor Cy3 veya Cy5-konjuge anti-mouse/rabbit (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories) idi. Örnekleri konfokal mikroskopi (EKK 510, Zeiss) kullanılarak görüntülendi. Bir 35 saat eski pupa ventral radyal ven azından kanat ChOs bir küme Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig1.jpg" /> Şekil 1. Tek bir Ch organı oluşturan altı hücre tipleri (A) şematik gösterimi:. Cap eki (CA), kap (C), scolopale (S), nöron (N), bağ (L) ve ligaman eki (LA ). Beş ChOs kümelenmiş edildiği LCh5 organ, yanal enine kas grubu (LT boyunca gerilir1-4). Lateral longitudinal kas (LL1), ventral boyuna kasların (VL1-4) ve lateral oblik kas (LO1) de gösterilmiştir. Tendon hücreleri kahverengi küreler (Klein, et al., 2010 alınmıştır) olarak gösterilmiştir. (B) Üçüncü dönem larva biri karın segment 10X büyütme ile izlenebilir. Her karın segmentte Mevcut sekiz ChOs yedi belirgindir: birlikte pentascolopidial organ (LCh5), tek bir yanal organ (LCh1) ve iki ventral ChOs (VChB) haline getirilmesini, beş yanal organ. ChOs ve nöronlar (N) nöronal marker MAb 22C10 (kırmızı) ile etiketlenir. Ligaman (L), kap (C) ve eki hücreleri (LA, CA) etiketli anti-αTub-85E (mavi). Kap ve ligament hücreleri ayrıca dei lokus (Nachman ve ark., Yayınlanmamış veri) bir düzenleyici eleman barındıran bir ChO özgü GFP muhabiri ile etiketlenir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig2.jpg" /> Şekil 2. </sTrong&gt; ventral radyal ven, kanat chordotonal organların 40X büyütme ile görüntülenebilir. Nöronlar (N) nöronal marker 22C10 (Kırmızı, B) ile işaretlenmiştir. Bağ (L) ve kap (C) hücreleri, anti-αTub85E antikorlar (Mavisi, C) ve bir CHO-belirli bir GFP raportör transgen (Nachman ve ark., Yayınlanmamış veriler) ile birlikte etiketlenir.

<ol><li>Brewster, R., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+specification+of+type+II+sensory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and specification of type II sensory neurons in Drosophila.</a> Development. 121, 2923-2936 (1995).</li>
<li>Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+analysis+of+larval+locomotion+in+Drosophila+chordotonal+organ+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16053-16053 (2003).</li>
<li>Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeling+the+vibes%3A+chordotonal+mechanisms+in+insect+hearing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Feeling the vibes: chordotonal mechanisms in insect hearing.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 9, 389-393 (1999).</li>
<li>Eberl, D. F., Boekhoff-Falk, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Johnston%27s+organ+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of Johnston's organ in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 679-687 (2007).</li>
<li>Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+similar+transduction+mechanisms+for+touch+and+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila.</a> J. Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).</li>
<li>Egoz-Matia, N., Nachman, A., Halachmi, N., Toder, M., Klein, Y., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+cell+adhesion+in+the+Drosophila+wing+is+mediated+by+Delilah%2C+a+potent+activator+of+%CE%B2PS+integrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of cell adhesion in the Drosophila wing is mediated by Delilah, a potent activator of βPS integrin expression.</a> Dev Biol. 351, 99-109 (2011).</li>
<li>Field, L. H., Matheson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordotonal+organs+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chordotonal organs of insects.</a> Advances in Insect Physiology. 27, 1-228 (1998).</li>
<li>Gong, Z., Son, W., Chung, Y. D., Kim, J., Shin, D. W., McClung, C. A., Lee, Y., Lee, H. W., Chang, D. J., Kaang, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+interdependent+TRPV+channel+subunits%2C+inactive+and+Nanchung%2C+mediate+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two interdependent TRPV channel subunits, inactive and Nanchung, mediate hearing in Drosophila.</a> J. Neurosci. 24, 9059-9066 (2004).</li>
<li>Inbal, A., Volk, T., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+ectodermal+attachment+cells+via+an+EGFR-dependent+mechanism+during+the+organogenesis+of+Drosophila+proprioceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recruitment of ectodermal attachment cells via an EGFR-dependent mechanism during the organogenesis of Drosophila proprioceptors.</a> Dev. Cell. 7, 241-250 (2004).</li>
<li>Jarman, A. P., Grau, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((atonal+is+a+proneural+gene+that+directs+chordotonal+organ+formation+in+the+Drosophila+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">atonal is a proneural gene that directs chordotonal organ formation in the Drosophila peripheral nervous system.</a> Cell. 73, 1307-1321 (1993).</li>
<li>Jarman, A. P., Sun, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+proneural+gene%2C+atonal%2C+in+formation+of+Drosophila+chordotonal+organs+and+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Role of the proneural gene, atonal, in formation of Drosophila chordotonal organs and photoreceptors.</a> Development. 121, 2019-2030 (1995).</li>
<li>Kim, J., Chung, Y. D., Park, D. Y., Choi, S., Shin, D. W., Soh, H., Lee, H. W., Son, W., Yim, J., Park, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TRPV+family+ion+channel+required+for+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A TRPV family ion channel required for hearing in Drosophila.</a> Nature. 424, 81-84 (2003).</li>
<li>Klein, Y., Halachmi, N., Egoz-Matia, N., Toder, M., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprioceptive+and+contractile+systems+in+Drosophila+are+both+patterned+by+the+EGR+family+transcription+factor+Stripe%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The proprioceptive and contractile systems in Drosophila are both patterned by the EGR family transcription factor Stripe.</a> Dev. Biol. 337, 458-470 (2010).</li>
<li>Matthews, K. A., Miller, D. F., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+implications+of+the+unusual+spatial+distribution+of+a+minor+alpha-tubulin+isotype+in+Drosophila%3A+a+common+thread+among+chordotonal+ligaments%2C+developing+muscle%2C+and+testis+cyst+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional implications of the unusual spatial distribution of a minor alpha-tubulin isotype in Drosophila: a common thread among chordotonal ligaments, developing muscle, and testis cyst cells.</a> Dev. Biol. 137, 171-183 (1990).</li>
<li>Okabe, M., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+induction+of+chordotonal+organ+precursors+in+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two-step induction of chordotonal organ precursors in Drosophila embryogenesis.</a> Development. 124, 1045-1053 (1997).</li>
<li>Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Technau, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spalt+modifies+EGFR-mediated+induction+of+chordotonal+precursors+in+the+embryonic+PNS+of+Drosophila+promoting+the+development+of+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spalt modifies EGFR-mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila promoting the development of oenocytes.</a> Development. 128, 711-722 (2001).</li>
<li>Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+molecular+design+of+the+Drosophila+antenna+as+a+flagellar+auditory+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ.</a> Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).</li>
<li>zur Lage, P., Jarman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+EGFR+and+notch+signalling+in+the+reiterative+recruitment+of+Drosophila+adult+chordotonal+sense+organ+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors.</a> Development. 126, 3149-3159 (1999).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu video açıklanan protokol larva ve pupa aşamalarında proprioseptif ChOs görselleştirmek için bir yol sağlar. Proprioseptif ChOs yapısı ve gelişimi hakkında şimdiye kadar yapılan çalışmalar özellikle embriyonik aşamalarında ve larva hayali diskler sınırlı olmuştur. Böylece, larva ve ergin hem ChOs gelişimi daha sonraki aşamalarında, birçok açıdan, büyük ölçüde bilinmemektedir. Drosophila ortak genetik araçları ile birlikte açıklanan protokol, yeni genlerin ve ChOs geliştirme sonraki aşamalarında rol oynayan yolları belirlemek ve incelemek için kullanılabilir. Bu protokol Cho görüntülenmesi için optimize edilmiştir, ancak bu tür pupal kanat 6 gibi diğer dokulara, bir boyanması için adapte edilebilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / aracı Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Dumont # 5 (veya # 55) forseps, biologie ucu </td><td> FST </td><td> 11252-20 ya 11252-10 (Veya benzeri forseps) </td><td></td></tr><tr><td> Austerlitz paslanmaz çelik böcek pimleri, minutiens 0.1mm </td><td> Roboz Cerrahi Alet Co </td><td> RS-6083-10 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 silikon elastomer kiti </td><td> DOW Corning Corporation </td><td> 240.4019862 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas mikro makas (düz, 7.5 cm, bıçak 3mm) </td><td> Mdeizintechnik GmbH AS </td><td> 11-590-00 </td><td> Aynı özellikleriyle Vannas Bahar Makas Roboz Cerrahi Instrument Co satın alınabilir </td></tr><tr><td> Orbital çalkalayıcı - Rotamax-120 </td><td&gt; Heidolph </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Dako Florasan Orta Montaj </td><td> Dako Cytomation, Glostrup, Danimarka </td><td> DK-5302392 </td><td></td></tr><tr><td> X10 PBS formülasyonu </td><td colspan="2"> 2 gr / aydınlatılmış KCl, 2 gr / aydınlatılmış KH 2 PO 4, 80 gr / aydınlatılmış NaCl, 21.7 gr / Na 2 HPO4.7H 2 O yaktı </td><td> PBS kalitesi Bu protokolün başarı için önemlidir </td></tr><tr><td> PBT </td><td colspan="2"> X1 PBS +% 0.1 Tween 20 </td><td></td></tr></tbody></table>

içinde proprioseptörlere görselleştirmesi<em&gt; drosophila</em&gt; larva ve pupa

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Propriyoseptör bünyesinde doğan uyaranlara yanıt vererek vücut parçalarının hareket, ya da pozisyon, hissedebilme yeteneğidir. Fruitflies ve diğer böcekler ise propriosepsiyon chordotonal organlar (ChOs) 2 olarak adlandırılan özel bir duyu organları tarafından sağlanır. Drosophila birçok diğer organları gibi, ChOs sineğin ömrü boyunca iki kez geliştirmek. İlk olarak, larva ChOs embriyogenez sırasında gelişebilir. Sonra yetişkin ChOs larva hayali disklerde geliştirmek ve Başkalaşım sırasında ayırt devam başlar. Embriyogenez sırasında larva ChOs gelişimi yoğun 10,11,13,15,16 çalışılmıştır. Her bir CHO, merkez Bir nöron ve bir scolopale hücre oluşan bir duyu birimidir. Duyumsal ünitesi 1,9,14 özel epidermal ek hücreler yoluyla kütikül eklemek aksesuar hücrelerinin iki tür arasında gerilir. Bir sinek larva hamle, e göreceli ötelemepidermal eki hücreleri duyusal ünitesi ve dendrit 8,12 dış segmentinde belirli geçici reseptör potansiyeli vanilloid (TRPV) kanallarının açılması sonucu uzanan yol açar. Elicited sinyal daha sonra, merkezi sinir sisteminde, merkezi lokomotor şekli oluşturucu devresine aktarılır. Çoklu ChOs yetişkin sinek 7&#39;de tarif edilmiştir. Bunlar erişkin sinek uzantıları (bacak, kanat ve halters) ve eklemlere yakın ve toraks ve batın bulunmaktadır. Buna ek olarak, ChOs birkaç yüz topluca mekanik enerji 3,5,17,4 bu iletiminde de akustik yetişkin anteni Johnston organ oluştururlar. Embriyonik aşamalarında ChOs gelişimi hakkında geniş bilgi aksine, çok az larva dönemlerinde bu organların morfolojisi hakkında bilinmektedir. Ayrıca, femur ChOs hariç 18 ve Johnston organ olan, bizim knowlederişkin sinek ChOs gelişimi ve yapısı hakkında ge çok bölük pörçük olduğunu. Burada Üçüncü dönem larva ve pupa da ChOs boyama ve görselleştirme için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, iyi karakterize morfoloji ve uçucu çeşitli ChOs gelişimini anlamak için genetik araçları ile birlikte de uygulanabilir.

Larva ve pupa da chordotonal organları immunostain ve görselleştirmek için bir yöntem<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Tarif edilmektedir.

Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva ve Pupa

Propriyosepsiyon, vücut içinde ortaya çıkan uyarılara tepki vererek vücut bölümlerinin hareketini veya konumunu algılama yeteneğidir. Meyve sineklerinde ve diğer...

Bu prosedürün genel amacı, drosophila larvaları ve pupalarında propriyoseptif kortone organlarını görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle üçüncü instar larvaların yetiştirilmesi ve toplanması veya larvaların ya da pupaların diseksiyonu sonrası pupaların toplanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, immün boyama için fikse edilirler.Ardından, fikse edilmiş larvalar veya pupalar uygun antikorlar ile immün boyamaya tabi tutulur. Son adım, boyanan örneklerin mikroskopi için lam üzerine yerleştirilmesidir. Nihayetinde, cortone organlarını görüntülemek için konfokal mikroskopi kullanılır.Bu yöntem, oph'taki prop reseptörlerinin simbiyoz sonrası gelişimi ve örüntülenmesi hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedür prop reseptör gelişimine dair içgörüler sağlayabilse de, diğer duyu organı türleri ve tendonlar gibi diğer organlara da uygulanabilir. İlk olarak, gerekli araç gereçleri, çözeltileri ve bir adet wandering flakonunu hazırlayın.Üçüncü evre yıldız larvalarında, PBS ve FİKSATİF çözeltilerini buz üzerinde tutun. Vial duvarından dolaşan bir üçüncü evre yıldız larvası seçin ve bunu, bir doku kültürü kabı içindeki puro elastomerinden yapılmış bir diseksiyon plakası üzerinde 50 µL buz soğukluğundaki PBS damlasına yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, larvayı ağız kancalarının yakınından ince penslerle sırtı yukarı bakacak şekilde tutun ve beyninden bir böcek iğnesi geçirin.Larvaların posterior ucunu pensle tutun. Nazikçe çekerek larvaları boylamasına hafifçe gerin. Yaylı makas kullanarak iki posterior küre arasına başka bir böcek iğnesi yerleştirin.Vücut duvarına, ön ve arka iğnelere yakın olacak şekilde, ön-arka aksa dik iki yatay insizyon yapın. Ardından, larval vücut duvarını ön insizyondan arka insizyona kadar dorsal orta hat boyunca kesin. İç organları ve trakeyi ince pensler kullanarak çıkarın.Ardından PBS ile bir veya iki kez nazikçe yıkayın. İki gövde duvarı flebini pensle tutun. Bunları dışarı doğru gerin ve her bir taraf için iki adet böcek iğnesi kullanarak plakaya sabitleyin.PBS'yi uzaklaştırın ve 50 µL fiksasyon çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Fiksatif çözeltiyi uzaklaştırıp PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, böcek iğnelerini yaylı makas kullanarak çıkarın.Dikdörtgen bir fileto bırakacak şekilde larval baş ve kuyruk kısımlarını kesin. Fikse edilmiş dokuyu, PBS içeren soğutulmuş bir einor tüpüne aktarın. Yeterli sayıda larva fikse edildiğinde, doğrudan antikor boyamasına geçilebilir.Hemen boyama yapılmak istenmiyorsa, fikse edilmiş larvalar %95 ethanol ile beşer dakikalık aralıklarla üç kez yıkanmalı ve ardından eksi 20 derecede ethanol içinde saklanmalıdır. Üçüncü instar larvalar yemeye başlayana kadar viallere larva fiksasyonunda olduğu gibi dikkat edilmelidir. Vialler her saat başı kontrol edilmeli ve yemeye başlamış larvalar işaretlenmelidir.İşaretli pupaları ince bir pens kullanarak 24 °C'de 30 ila 40 saat veya 29 °C'de 24 ila 27 saat boyunca gelişmeye bırakın. Uygun yaştaki 20 ila 30 pupayı seçin ve karanlık, porselen, çok kuyuklu bir diseksiyon kabına yerleştirin. İlgilenilen dokulara zarar vermemeye dikkat edin.Ardından, pupaları pupa kılıflarından çıkarın. Operculumu soyarak başlayın ve pupa serbest kalana kadar devam edin. Tüm pupaları çıkarıp PBT ile doldurulmuş bir kuyuya yerleştirin.Bir mikro diseksiyon bıçağı kullanarak beş pupayı, diseksiyon kabının kuyucukları arasındaki düz bir yüzeye yerleştirin. Başın uç kısmını ve abdomenin posterior ucunu kesin. Pupayı ince pensle sabit tutun ve anterior açıklıktan PBT enjekte ederek pupanın iç organlarını yıkamak için bir mililitrelik şırınga kullanın.Disekte edilen pupayı, PBS ile dolu bir kuyucuğa daldırarak kısaca yıkayın ve buz üzerinde tutulan bir einor tüpündeki soğuk fiksatifin içine aktarın. Pupayı dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün.Fiksatiften kurtulun ve puby'yi her yıkama için beş dakika olmak üzere üç kez PBT ile yıkayın. Yıkanan puby'yi buz üzerinde tutun. Diseksiyon kabının iki kuyucuğunu PBT ile doldurun.Polietilen pastil pipet kullanarak, birkaç pupayı kuyucuklardan birine aktarın. Ardından pupaları teker teker ikinci kuyucuğa taşıyın.Uçları tam olarak hizalanmış iki çift keskin pens kullanarak pupayı kuyucuğun tabanına sabitleyin ve ardından kutikülü nazikçe yırtın. Kanat kutikülünün çıkarılması, bu prosedürün en zor kısmıdır. Bu adım sırasında her zaman bazı kanatlar kaybedilir; bu nedenle prosedüre nispeten yüksek sayıda pupa ile başlarız.Kütikül yırtıldıktan sonra, onu kanattan soyun. Kanadın pupadan ayrılmamasına dikkat edin. Kanat yüzeyindeki kütikülü soyduktan sonra, kanat menteşesindeki kütikülü soymaya devam edin.Kanat kütikülü soyulduktan sonra, bacak kütikülünü de benzer bir yöntemle soymayı deneyebilirsiniz. Bu işlem sırasında birçok bacak muhtemelen kaybolacaktır ancak düşük verime rağmen, bacak cortone organlarının boyanmasını önemli ölçüde iyileştirdiği için bu adım şiddetle tavsiye edilir. Pupayı metanolle doldurulmuş bir eppendorf tüpüne yerleştirin ve oda sıcaklığında muhafaza edin.Tüm pupaların kütiküllerini soymaya devam edin ve toplamda en az 10 adet düzgünce soyulmuş pupa elde edene kadar aynı tüpe ekleyin. Her boyama işlemi için metanolü uzaklaştırın ve %95 etanol ile beşer dakikalık üç yıkama yapın. Fixe edilmiş pupalar, immün boyama öncesinde -20 °C'de %95 etanol içinde uzun süreler boyunca saklanabilir.Larvaları monte etmek için, bir mikroskop lamı üzerine bir damla montaj medyumu damlatın ve ardından larvaları kütikülleri aşağıya, vücut duvarı kasları yukarıya bakacak şekilde yerleştirin. Temiz bir kapatma camı üzerine küçük bir damla montaj medyumu koyun ve monte edilen larvalara herhangi bir basınç uygulamadan preparatı örtmek için kullanın. Puby'yi monte etmek için.İlk olarak, biri diseksiyon ve ikincisi montaj için kullanılmak üzere, üzerine bir damla montaj medyumu damlatılmış iki mikroskop lamı hazırlayın. Lamlardan birinin üzerine birkaç pupa yerleştirin ve ardından yaylı makas kullanarak başı ve abdomenin posterior kısmını çıkarın. Ardından, kanatlar ve bacaklar arasından keserek toraksin dorsal yarısını ventral yarısından ayırın.Pupanın diseke edilmiş vücut parçalarını bir damla montaj ortamına yerleştirin. İkinci lamda, kanatların ve bacakların açıldığından emin olun ve dokuların üst üste gelmesini mümkün olduğunca en aza indirmeye çalışın. Son olarak, bir lamel üzerine bir damla montaj ortamı damlatın ve aşırı basınç uygulamadan lameli örneğin üzerine yerleştirin.Üçüncü evre yıldız larvalarındaki korton organlarının immün boyamasını gösteren bu konfokal mikrograf, sekiz korton organından yedisinin açıkça görüldüğü, güzelce gerilmiş bir abdominal segmenti göstermektedir. Birlikte penasko lipid organını oluşturan beş lateral organ, tek bir lateral organ ve iki ventral korton organından biri belirgindir. Korton organının nöronları, nöronal marker olan monoklonal antikor 22 C 10 ile işaretlenmiş olup kırmızı renkte gösterilmiştir.Ligaman başlığı ve bağlantı hücreleri Antifa tubulin 85 E ile işaretlenmiştir ve mavi renkte gösterilmiştir. Başlık ve ligaman hücreleri ek olarak bir korti tonal organ ile işaretlenmiştir. Delilah lokusu için düzenleyici bir element içeren spesifik GFP raporlayıcı.Burada, 35 saatlik bir pupanın bu konfokal mikrografında, ventral radyal ven üzerindeki kanat corti tonal organları gösterilmektedir. Nöronlar, nöronal belirteç 22 C 10 ile işaretlenmiş olup kırmızı renkte ve panel B'de gösterilmiştir. Ligaman ve kap hücreleri, mavi renkte ve panel C'de gösterilen Antifa tubulin 85 E antikorları ile bir corti tonal organla birlikte ortak olarak işaretlenmiştir. Spesifik GFP raporcu transgeni yeşil renkte gösterilmiştir.Bu videoyu izledikten sonra, oph'daki hem larva hem de pupa aşamalarında propriyoseptif kortone organlarının nasıl görselleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, işlemin açıklanan antikorların kullanımı için optimize edildiğini hatırlamak önemlidir. Farklı antikorlar, hafifçe farklı fiksasyon ve boyama koşulları gerektirebilir.Bu nedenle, bu prosedür farklı antikorlarla kullanıldığında, kullanılan antikorlar için optimal koşullar belirlenmelidir.

visualization-of-proprioceptors-in-drosophila-larvae-and-pupae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Drosophila melanogaster larvaları larva segmental sinirler içinde aksonal taşıma mekanizmalarının araştırılması için ideal bir model sistem sağlar. Bu yordamı kullanarak, 3. instar larvaları çeşitli mutasyonları taşıyan vahşi tip larva mukayese edilebilir.

3 Larvaların segmental sinirler Görselleştirme Rd Instar Drosophila Larvaların Hazırlıkları

Biz sahnelenen hazırlamak için prosedürü...

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

Bu protokol, bozulmamış anesthetization ve görüntüleme için güvenilir bir yöntem...

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Bu video, canlı hücre görüntüleme asimetrik sağlam duyu organı progenitör hücreleri ve epidermal hücrelerin bölünmesi için bir metodu...

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Kaynak: Jeong, S. Drosophila'da embriyonik motor nöronların aksonal projeksiyon modelinin görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm.  (2017)Bu video, Drosophila embriyolarında aksonal projeksiyonların görselleştirilmesini göstermektedir. Motor nöronların immünoetiketlenmesi, nöronal yapıları ortaya çıkarmak için hassas diseksiyon ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu toplu olarak ayrıntılı nöronal mimariyi ortaya çıkararak aksonal projeksiyon paternlerini vurgular.

Drosophila'da Embriyonik Motor Nöronların Aksonal Projeksiyon Modellerinin Görselleştirilmesi

Bu protokol, canlı Drosophila pupa göz nöroepitelini görüntülemek için etkili bir yöntem sunar. Bu yöntem, doku hareketini ve düzensiz topolojiyi telafi eder, birden fazla GFP etiketli bağlantı proteininin kullanılması yoluyla hücre sınırlarının görselleştirilmesini geliştirir ve kolayca monte edilebilen bir görüntüleme teçhizatı kullanır.

Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz

Biz diseksiyon, tespit ve steroid hormon biyosentezi ve düzenleyici mekanizma çalışmaya Drosophila larvaları ve yetişkin kadınlarda Sterpidojenik organların immün için bir protokol açıklar. steroidojenik organlara ek olarak, böyle germ çizgili kök hücreleri gibi steroidojenik organların innervasyon olarak steroidojenik hedef hücreleri görselleştirmek.

Sineği boyanmasına ile steroidogenik organları ve İnteraktif Organlar görselleştirme için Protokoller<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya yöntemini ayrıntılarıyla anlatıyor . FasII antikoru ile lekelenmiş sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve sinirsel gelişim sırasında hedef tanıma için gerekli genlerin karakterize edilmesi için güçlü bir araç sağlar.

Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi<em&gt; Drosophila</em

Burada, canlı genel ve kas-tendon morfogenez gelişim süreçlerinin özellikle yaşam görüntüleme gerçekleştirmek için kullanımı kolay ve çok yönlü bir yöntem mevcut Drosophila pupa.

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Burada Drosophila Yetişkin bacaklar fiksasyon, montaj, görüntüleme ve sonrası görüntüleme adımları floresan bir protein ile aksonal hedefleme görselleştirmek için bir protokol açıklayın.

Drosophila bacak Motor Nöron aksonlar yetişkin kütikül aracılığıyla görselleştirmek

Burada, pupa evresinde Drosophila bacağının uzun süreli canlı görüntülenmesi için pupariumun tamamen çıkarılmasını içeren bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol diğer dokulara da uygulanabilir.

Puparium çıkarıldıktan sonra Drosophila pupa bacak gelişiminin uzun süreli canlı görüntülenmesi

Öğrenin Drosophila larva ve pupa dönemlerinde proprioseptif kordotonal organları immün boyama ve konfokal mikroskopi ile görselleştirme yöntemini. Bu teknik duyu organı gelişimi araştırmaları için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi

Daha fazla video keşfet