Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi Drosophila Larva ve Pupa

Bu prosedürün genel amacı, drosophila'nın larvalarında ve pubilerinde proprioseptif korton organlarını görselleştirmektir. Bu, larva veya pupinin diseksiyonundan sonra yıldız larvalarında veya puby'de ilk olarak yetiştirilmesi ve üçüncü toplanması ile gerçekleştirilir. İmmün boyama için sabitlenmişlerdir.

Daha sonra, sabit larvalar veya pupi uygun antikorlarla immün boyadır. Son adım, lekeli numuneleri mikroskopi için monte etmektir. Sonuçta, kortone organlarını görselleştirmek için konfokal mikroskopi kullanılır.

Bu yöntem, oph'deki prop reseptörlerinin post simbiyonik gelişimi ve modellenmesi ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu prosedür prop reseptörü gelişimi hakkında fikir verebilse de, diğer duyu organları ve tendonlar gibi diğer organlara da uygulanabilir. İlk olarak, gerekli aletleri, çözeltileri ve bir gezinme şişesini bir araya getirin.

Yıldız larvalarında üçüncü, PBS ve FİKSAT solüsyonlarını buz üzerinde tutun. Flakon duvarından yıldız larvalarında dolaşan bir üçüncü tane seçin ve bir doku kültürü kabında puro elastomerinden yapılmış bir diseksiyon plakası üzerine 50 mikrolitrelik bir buz gibi soğuk PBS damlasına yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, larvaların sırt tarafını ağzın yakınında tutar, ince forseps ile kancalar ve beynin içinden bir böcek iğnesi sokar.

Forseps ile larvaların arka ucunu tutun. Yavaşça çekin ve larvaları yavaşça uzunlamasına gerin. Yaylı makas kullanarak iki arka küre arasına başka bir böcek pimi yapıştırın.

Gövde duvarında ön ve arka pimlere yakın kalacak şekilde ön arka eksene dik iki yatay kesi kesin. Daha sonra, larva gövdesi duvarını dorsal orta hat boyunca ön insizyondan arka kesiden kesin. İnce forseps kullanarak iç organları ve trakeayı çıkarın.

Daha sonra PBS ile bir veya iki kez nazikçe yıkayın. İki vücut duvarı kanadını forseps ile tutun. Onları gerin ve her iki taraf için iki böcek pimi kullanarak plakaya sabitleyin.

PBS'yi çıkarın ve 50 mikrolitre fiksatif solüsyon ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Sabitleyiciyi çıkardıktan ve PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, yaylı makas kullanarak böcek pimlerini dışarı çekin.

Larva başını ve kuyruğunu dikdörtgen bir fileto bırakarak kesin. Sabit dokuyu PBS ile soğutulmuş bir einor tüpüne aktarın. Yeterli sayıda larva sabitlendikten sonra, doğrudan antikor boyamaya devam edilebilir.

Hemen lekelenme istenmiyorsa, sabit larvalar her biri% 95 etanol ile beş dakikada üç kez yıkanmalı ve daha sonra eksi 20 derecede etanol içinde saklanmalıdır. Üçüncü instar larvaları yemeye başlayana kadar larva fiksasyonunda olduğu gibi şişelere katılın. Şişeleri her saat inceleyin ve yemiş olan larvaları işaretleyin.

İşaretli pubun ince forseps kullanarak 24 santigrat derecede 30 ila 40 saat veya 29 santigrat derecede 24 ila 27 saat gelişmesine izin verin. Uygun yaşta 20 ila 30 pube seçin ve bunları koyu porselen çok kuyulu bir diseksiyon kabına koyun. İlgilendiğiniz dokulara zarar vermemeye dikkat edin.

Ardından, yavruları öğrenci kutularından çıkarın. Operkülomu soyarak başlayın ve pupa serbest kalana kadar devam edin. Tüm yavruları çıkarın ve PBT ile dolu bir kuyuya koyun.

Bir mikro diseksiyon bıçağı kullanarak diseksiyon çanağının oyukları arasında düz bir yüzeye beş puy yerleştirin. Başın ucunu ve karnın arka ucunu kesin. İnce forseps kullanarak pupayı yerinde tutun ve ön açıklıktan PBT enjekte ederek pupa'nın iç organlarını yıkamak için bir mililitrelik bir şırınga kullanın.

Diseke edilmiş pupayı PBS ile dolu bir kuyuya batırarak kısa bir süre yıkayın ve buz üzerinde tutulan bir einor tüpündeki soğuk fiksatifin içine taşıyın. Puy'u gece boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün.

Sabitleyiciyi atın ve puby'yi PBT ile yıkama başına beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Yıkama puby'yi buz üzerinde tutun. Diseksiyon kabının iki kuyusunu PBT ile doldurun.

Polietilen pasti pipet kullanarak. Birkaç puby'yi kuyulardan birine aktarın. Sonra her seferinde bir pupa'yı ikinciye taşıyın. Kuyu.

Mükemmel hizalanmış uçlara sahip iki çift keskin forseps kullanarak, pupayı kuyunun dibine sabitleyin ve ardından kütikülü nazikçe yırtın. Kanat kütikülünün çıkarılması bu işlemin en zor yönüdür. Bu adımda her zaman kanatların bir kısmını kaybederiz, bu yüzden işleme nispeten fazla sayıda pupa ile başlarız.

Kütikül yırtıldıktan sonra kanattan soyun. Kanadı pupadan ayırmamaya dikkat edin. Kanat bıçağından kütikülü soyduktan sonra, kanat menteşesinin kütikülünü soymaya devam edin.

Kanat kütikülü soyulduktan sonra, bacak kütikülü de benzer şekilde soyulmaya çalışılabilir. Bu süreçte birçok bacağın kaybedilmesi muhtemeldir, ancak düşük verime rağmen, bacak kortone organlarının lekelenmesini büyük ölçüde iyileştirdiği için bu adım şiddetle tavsiye edilir. Pupayı metanol ile doldurulmuş bir einor tüpüne yerleştirin ve oda sıcaklığında tutun.

Tüm puyların kütikülünü soymaya devam edin ve toplamda en az 10 güzelce soyulmuş puy için aynı tüpe ekleyin. Her boyama için metanolü çıkarın ve her birini% 95 etanol ile üç kez beş dakika yıkayın. Sabit puy, immün boyamadan önce eksi 20 derecede% 95 etanolde uzun süre saklanabilir.

Larvaları monte etmek için, bir mikroskop lamına bir damla montaj ortamı yerleştirin ve ardından larvaları tırnak etleri aşağı ve vücut duvarı kasları yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Temiz bir kapak kızağı üzerine küçük bir damla montaj ortamı koyun ve monte edilmiş larvalara herhangi bir baskı uygulamadan hazırlığı örtmek için kullanın. Kasayı monte etmek için.

İlk olarak, biri diseksiyon ve ikincisi montaj için olmak üzere bir damla montaj ortamı ile iki mikroskop lamı hazırlayın. Slaytlardan birine birkaç pu yerleştirin ve ardından başı ve karnın arka kısmını çıkarmak için yaylı makası kullanın. Daha sonra, kanatlar ve bacaklar arasında keserek toraksın dorsal yarısını ventral yarısından ayırın.

Pupa'nın disseke edilmiş vücut kısımlarını montaj ortamının damlasına yerleştirin. İkinci slaytta, kanatların ve bacakların gerildiğinden emin olun ve dokuların üst üste binmesini mümkün olduğunca en aza indirmeye çalışın. Son olarak, bir kapak kızağı üzerine bir damla montaj ortamı yerleştirin ve aşırı basınç uygulamadan numunenin üzerine yerleştirin.

Yıldız larvalarının üçte birinde bulunan immüno-leke korton organlarının bu konfokal mikrografı, sekiz korton organından yedisinin açıkça görülebildiği, güzelce gerilmiş bir karın segmentini göstermektedir. Birlikte penasco lipid organını, tek bir yan organı ve iki ventral korton organından birini oluşturan beş yan organ belirgindir. Korton organının nöronları, bir monoklonal antikor 22 C 10 olan nöronal işaretleyici ile etiketlenir ve kırmızı ile gösterilir.

Ligament kapağı ve bağlantı hücreleri Antifa tubulin 85 E ile etiketlenmiştir ve mavi renkle gösterilmiştir. Kapak ve ligament hücreleri ayrıca bir korti tonal organ ile etiketlenir. Delilah locus için düzenleyici bir unsur barındıran belirli GFP muhabiri.

Burada, ventral radial vendeki kanat korti tonal organları, 35 saatlik bir pupanın bu konfokal mikrografında gösterilmektedir. Nöronlar, nöronal belirteç 22 C 10 ile işaretlenir ve kırmızı ve panel B'de gösterilir.Ligament ve kapak hücreleri, mavi ve panel C'de gösterilen Antifa tubulin 85 E antikorları ve ayrıca bir korti tonal organ ile birlikte etiketlenir. Spesifik GFP muhabiri transgeni yeşil renkle gösterilmiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, oph'da hem larva hem de pupadaki proprioseptif korton organlarını nasıl görselleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, tarif edilen antikorların kullanımı için optimize edildiğini hatırlamak önemlidir. Farklı antikorlar biraz farklı fiksasyon ve boyama koşulları gerektirebilir.

Bu nedenle, bu prosedürü farklı antikorlarla kullanırken, kullanılan antikorlar için en uygun koşulları bulmak gerekir.