Sineği boyanmasına ile steroidogenik organları ve İnteraktif Organlar görselleştirme için Protokoller Drosophila melanogaster
April 14th, 2017
Biz diseksiyon, tespit ve steroid hormon biyosentezi ve düzenleyici mekanizma çalışmaya Drosophila larvaları ve yetişkin kadınlarda Sterpidojenik organların immün için bir protokol açıklar. steroidojenik organlara ek olarak, böyle germ çizgili kök hücreleri gibi steroidojenik organların innervasyon olarak steroidojenik hedef hücreleri görselleştirmek.
Bu prosedürün genel amacı, meyve sineği Drosophila melanogaster'in larvalarında veya yetişkin dişilerinde steroidojenik organları ve etkileşimli organlarını görselleştirmektir. Bu yöntem, böcek steroid hormon biyosentezini ve çiftleşme ve metamorfozun altında yatan nöronal düzenleyici mekanizmayı anlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, steroidojenik organların innervasyonunun ve etkileşimli organlarının göreceli kısmının bozulmadan kalmasıdır.
Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, sinek larvalarındaki steroidojenik organlar oldukça küçük ve şeffaf olduğu için mücadele edecektir. Laboratuvarım ve ben diseksiyon protokollerimizi paylaşmaktan memnuniyet duyuyoruz. Öyleyse başlayalım.
Larvaları hazırladıktan sonra, diseksiyon mikroskobu altında PBS ile doldurulmuş üç santimetrelik bir tabakta kurs diseksiyonuna başlayın. İlk olarak, ağız kancasını forseps ile kavrayın. Daha sonra, mikro makas kullanarak, vücudu ön uçtan uzunluğun yaklaşık üçte biri oranında kesin.
Daha sonra, ön uzunluğu bir çift forseps ile tutun ve larva gövdesini ters çevirmek için başın ucunu vücuda hafifçe itmek için ikinci bir çift kullanın. Bu şekilde 10 dakika içinde 20'ye kadar larva hazırlayın ve ardından bunları fiksatif çözeltiye aktarın. 30 dakika sonra, preparatları yıkayın ve immün boyama işlemine devam edin.
Başlamak için, larvaları boğmak ve böylece larvaları hareketsiz hale getirmek için yaklaşık bir saat suya batırın. Ardından, silikon kaplı bir tabağa bir damla PBS'ye bir larva sırt tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Sırt tarafında iki trakeal tüp bulunur.
Diseksiyon mikroskobu altında, ön uca bir böcek pimi yerleştirmek için forseps kullanın. Ardından, gövdeyi arka tarafa doğru gerin ve arka uca ikinci bir pim yerleştirin. Ardından, mikro makas kullanarak kuyruğun yakınında küçük bir kesi yapın.
Kesiden, kütikülün altındaki dokulardan hiçbirine zarar vermeden, dorsal kütikülü dorsal orta hat boyunca uzunlamasına başın doğru dikkatlice kesin. Kesi yaptıktan sonra, vücut duvarlarını birbirinden ayırın ve köşelerde böcek iğneleri ile sabitleyin. Daha sonra, forseps kullanarak, ön yağ gövdesini ve tükürük bezlerini çıkarın, böylece yüzeydeki beyin halkası bezi kompleksini açığa çıkarın.
Şimdi, PBS'yi aspire edin ve hazırlığı fiksatif çözeltiye daldırın. 30 dakika sonra, böcek pimlerini çıkarmak için forseps kullanın ve preparatı% 0.3 PBT ile doldurulmuş bir mikrotüpe aktarın. Ardından, immün boyama ile devam edin.
Larvaları immün boyadıktan sonra, numuneleri %0.3 PBT ile doldurulmuş bir tabağa aktarmak için tek kullanımlık bir pipet kullanın. Diseksiyon mikroskobu altında, kütikülü veya ağız kancasını bir çift forseps ile kavrayın. Ardından, yemek borusunun ve göz disklerinin ön ucunu keserek beyin halkası bezi göz diski kompleksini vücut kütikülünden çıkarmak için bıçak gibi bir mililitrelik şırıngaya bağlı 27 gauge bir iğne kullanın.
Daha sonra, forseps kullanarak, yemek borusunu ve bağırsağı beyin halkası bezi göz diski kompleksinden dikkatlice ayırın. Yemek borusu beyinden ventral sinir kordonunun üzerinden geçtiği için bağırsağı arka tarafa doğru çekin. Son olarak, beyin halkası bezi kompleksini izole etmek için beyin diski, göz diskleri ve bacak diskleri arasındaki bağlantıları bir iğne bıçağıyla dikkatlice kesin.
Diseksiyon sırasında keskin kenarlı ince forseps kullanmak oldukça önemlidir. Kenarlarını boşluk bırakmadan bir araya getirmek için forsepsleri bir parça taşlama taşı ile keskinleştirmenizi şiddetle tavsiye ederim. Numuneleri aktarmak için geniş delikli uçlu bir mikro pipet kullanın.
Numuneleri cam sürgünün ortasına yerleştirin. Daha sonra, numuneleri ventral taraflarına yerleştirmek için forseps kullanın, böylece beynin dorsal tarafında bulunan halka bezi görüntülenebilir. Ardından, slaytı eğin ve fazla PBT'yi mümkün olduğunca silin.
Ardından, numunelerin yanına bir damla montaj reaktifi koyun ve reaktifin üzerine ve ardından numunelerin üzerine bir kapak kızağını yavaşça indirmek için forseps kullanın. Yetişkin dişi yumurtalığı incelemek için, sinekleri karbondioksit gazı ile uyuşturun. Daha sonra kafalarını kesin ve vücutlarını PBS ile doldurulmuş üç santimetrelik bir tabağa aktarın.
Daha sonra, diseksiyon mikroskobu altında, toraksın dorsal tarafını forseps ile kavrayın ve ikinci bir forseps çifti ile abdominal segment A-5 veya A-6'yı tutun. Ardından, karın kütikülünü arka tarafa doğru soyun. Devam etmeden önce, forsepslerdeki yapışkan kütikülü temizleyin.
Sonra, bir yumurtalık kıçını sıkıştırın ve yumurtalığı izole edin. Sonra forseps kullanarak yumurtalık uçlarını tarayın ve yayın. Yayıldıktan sonra, lekelenmeye hazırlamak için yumurtalığı 30 dakika boyunca fiksatif solüsyona batırın.
Yumurtalığın innervasyonunu koruyan bir hazırlık yapmak için, anestezi uygulanmış dişi sinekleri PBS ile doldurulmuş silikon kaplı bir tabağa aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında, hortumu tutun ve beyni ortaya çıkarmak için kafa kütikülünü soyun. Beyinden bağlı trakeayı çıkarın ve beyni ventral sinir kordonuna bağlı bırakın.
Ardından, göğüs kafesi sırt tarafından tutun ve bacakları ve kanatları çıkarın. Daha sonra, her bacağın tabanından başlayarak toraksın ventral kütikülünü soyun. VNC açığa çıktığında, forseps kullanarak VNC'ye bağlı kalan dorsal kütikülü ve kasları çok dikkatli bir şekilde çıkarın.
Beyin ve VNC arasındaki bağlantılara zarar vermeyin. Daha sonra, forseps kullanarak, yumurtalıkları ve pervane, bağırsak, yumurtalık, rahim ve aksesuar bezi içeren etkileşimli organlarını ortaya çıkarmak için karın kütikülünü soyun. Son olarak, trakea ve yağ gövdesi de dahil olmak üzere kalan dokuları çıkarın.
Daha sonra, numuneleri immün boyamaya hazırlamak için 30 dakika boyunca fiksatif solüsyona batırın. İmmün boyamadan sonra, numuneleri bir mikro pipet kullanarak% 0.1 PBT ile bir cam slayta aktarın. Daha sonra, slaydı bir mikroskopla görüntüleyin ve forseps kullanarak yumurtalıkların iplerini birbirinden ayırın.
Bu işlem sırasında yumurtalıkların uçlarına zarar vermeyin. Germaria içerirler. Beyni üreme organı kompleksine hazırlarken, kalan kütikülleri çıkarın ve yapıları slaytın üzerine yayın.
Ardından, fazla PBT'nin çoğunu silin ve ardından numuneye bir damla montaj reaktifi uygulayın. Ardından, forseps kullanarak sürgünün üzerine yavaşça bir örtü kayma yerleştirin ve sürgüyü karanlıkta dört santigrat derecede saklayın. Daha sonra numuneleri mikroskop altında gözlemleyin ve steroidojenik organları görüş alanına getirin.
Görüntü sabitlendikten sonra, görüntüleme sistemini görüntü alma moduna geçirin. Larva aşamaları sırasında, protorasik bez, anti-örtü antikoru da dahil olmak üzere ekdisteroidojenik enzimlere karşı antikorlarla işaretlendi. Protorasik bez ve beyin arasındaki nöronal bağlantıyı görselleştirmek için beyin-halka bezi kompleksi diseke edildi.
Filet diseksiyon yöntemi, bir grup serotonerjik nöronun protorasik beze, proventriküle ve faringeal kaslara projeksiyon yaptığı stomatogastrik sinir sistemini gösterir. Yetişkin kadınlarda, yumurtalık ekdisteroidi, GSC proliferasyonu gibi ovogenezin birçok yönünü etkiler. GSC'ler, yumurtalıktaki her yumurtalığın ucundaki germanyumda bulunur.
Germaryum içinde, GSC'ler iki antikor, 1B1 ve DE-cadherin kullanılarak özel olarak etiketlendi. Yumurtalığın innervasyonunu görselleştirmek için yumurtalık, beyin, VNC, bağırsak, prop, uterus ve spermateca ile birlikte diseke edildi. Nöronlar, n-Synaptobrevin GAL4 sürücüsünün kontrolü altında mCD8:GFP ile görüntülendi.
Ek olarak, kas yapısı dikonjuge phalloidin kullanılarak boyandı. Steroidojenik organların diseksiyonu ilk başta zor hissedebilse de, organı yaralanmadan daha kolay izole etmek için dokuların kesme noktasını öğrenmek için bu filmi kullanın. Protokolümüzün sadece yeni başlayanlar için değil, aynı zamanda deneyimli araştırmacılar için de bilgilendirici olmasını umuyoruz.
Ustalaştıktan sonra, bu prosedürü araştırmanıza uygulayabilir ve ihtiyaçlarınıza uyacak şekilde fırçalayabilirsiniz. Bu protokolün steroid hormon biyosentezinin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına yardımcı olacağını umuyoruz. Daha ayrıntılı adım adım protokoller el yazmasında mevcuttur.
Lütfen kontrol edin.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, Drosophila larvaları ve yetişkin dişilerde steroidojenik organların incelenmesi, sabitlenmesi ve immünoboyama protokolü sunmaktadır. Yöntem, steroid hormon biyosentezini ve düzenleyici mekanizmalarını, bu organların ve hedef hücrelerinin innervasyonunu da içerecek şekilde görselleştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Endokrinoloji
Arka Plan
- Drosophila melanogaster, steroid hormon biyosentezi çalışmaları için model organizma olarak kullanılmaktadır.
- Nöronal düzenleyici mekanizmaların anlaşılması, çiftleşme ve metamorfoz hakkında bilgiler için kritik öneme sahiptir.
- Teknik, steroidojenik organların innervasyonunu korur.
- Küçük ve şeffaf organların incelenmesi, yeni başlayanlar için zor olabilir.
Çalışmanın Amacı
- Drosophila'da steroidojenik organları ve bunların etkileşimlerini görselleştirmek.
- Steroid hormon biyosentezi mekanizmalarını açıklamak.
- Üreme ve gelişimsel süreçlerin nörnal kontrolünü araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Drosophila larvalarının ve yetişkin dişilerin incelenmesi.
- Steroidojenik organların sabitlenmesi.
- Yapıları görselleştirmek için immünoboyama teknikleri.
- Innervasyon desenleri ve hedef hücre etkileşimlerinin analizi.
Ana Sonuçlar
- Larv ve yetişkinlerde steroidojenik organların başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- Steroidojenik organların innervasyonunun bütünlüğünün gösterilmesi.
- Steroidojenik organlar ve germ hücre kök hücreleri arasındaki etkileşimlere dair içgörüler.
- Gelecek çalışmalar için güvenilir bir protokolün oluşturulması.
Sonuçlar
- Protokol, steroid hormon biyosentezini incelemek için değerli bir araç sunmaktadır.
- Düzenleyici mekanizmaların anlaşılması, böcek gelişimi hakkında bilgiyi artırabilir.
- Bu yöntem, nörobiyoloji ve endokrinoloji alanındaki çeşitli araştırma uygulamaları için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables visualization of steroidogenic organs and their neuronal interactions in Drosophila, providing a genetically tractable model for studying hormone biosynthesis regulation. The method supports mechanistic de-risking in early discovery by preserving innervation patterns and tissue architecture, which is critical for understanding endocrine signaling pathways relevant to metabolic and reproductive targets. It offers a scalable approach for target validation in invertebrate models, facilitating hypothesis testing before mammalian translation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of steroid hormone biosynthesis pathways through direct visualization of ecdysteroidogenic organs and their enzymatic markers.
- Scientific Value: Supports functional target validation by mapping neuronal innervation of steroidogenic tissues, clarifying regulatory mechanisms.
- Operational Value: Provides a reproducible dissection and immunostaining workflow for consistent sample preparation across experiments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative imaging readouts of organ structure and innervation, enabling phenotypic screening of genetic or pharmacological perturbations.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and staining protocols, improving assay reproducibility and cross-lab comparability.
- Scientific Value: Facilitates co-visualization of germline stem cells and steroidogenic organs, supporting biomarker-aligned assay development for reproductive signaling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Establishes a disease-relevant system for studying steroid hormone regulation, with direct links to germline stem cell proliferation and developmental timing.
- Operational Value: Enables longitudinal analysis of organ interactions, supporting predictive modeling of endocrine disruption effects.
- Strategic Value: Supports mechanistic de-risking by linking neuronal activity to hormonal output, reducing uncertainty in target pathway validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting progression from target hypothesis testing to mechanistic validation in neuroendocrine systems before lead identification stages.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of steroidogenic regulation by visualizing enzyme expression and neuronal connections in intact tissue preparations.
- Screening: Delivers quantitative, imaging-based outputs for assessing compound or genetic effects on organ morphology and innervation patterns.
- Analytics: Provides spatial and fluorescence readouts that allow comparative analysis across conditions, supporting data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects steroidogenic organ function to germline stem cell activity, offering a translational biomarker pathway for reproductive development studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for neuroendocrine phenotyping, adaptable across multiple targets and genetic backgrounds in Drosophila.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in steroid hormone regulatory networks.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability of organ visualization workflows, enabling high-throughput sample processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing direct evidence of target engagement and pathway modulation in a physiological context.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by validating target relevance through conserved endocrine mechanisms observable in a genetic model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection and fluorescence microscopy for accurate tissue handling and imaging.
- Dependent on immunostaining reagents and transgenic lines for specific labeling of enzymatic and neuronal markers.
- Necessitates standardized fixation and permeabilization protocols to maintain antigenicity and tissue integrity across samples.
- Involves adaptation challenges when applying the protocol to different developmental stages or tissue types due to size and fragility variations.
- Limited by the need for specialized equipment such as fine forceps, micro scissors, and silicone-coated dishes to prevent tissue damage during dissection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Dissecting the Larval Ring Gland-brain Complex
1:53
Filleting Larvae to Maintain Relative Tissue Positions
3:35
Fine Dissection of the Brain-ring Gland Complex and Mounting
5:34
Dissection of Adult Ovary
6:36
Dissection of Adult Reproductive Organs Along with Other Interactive Tissues
8:15
Mounting of Adult Structures and Imaging
9:33
Results: Preparation images
11:13
Conclusion
