Sineği boyanmasına ile steroidogenik organları ve İnteraktif Organlar görselleştirme için Protokoller

Bu prosedürün genel amacı, meyve sineği Drosophila melanogaster'nin larvalarında veya yetişkin dişilerinde steroidojenik organları ve bunlarla etkileşim halindeki organları görselleştirmektir. Bu yöntem, böceklerde steroid hormon biyosentezinin ve çiftleşme ile metamorfozun temelini oluşturan nöronal düzenleyici mekanizmanın anlaşılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, steroidojenik organların innervasyonunun ve etkileşimli organlarının ilgili kısımlarının bozulmadan kalmasıdır.

Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, sinek larvalarındaki steroidojenik organların oldukça küçük ve şeffaf olması nedeniyle zorluk yaşayacaklardır. Laboratuvarım ve ben, diseksiyon protokollerimizi paylaşmaktan mutluluk duyuyoruz. Öyleyse, hadi başlayalım.

Larvalar hazırlandıktan sonra, PBS ile doldurulmuş üç santimetrelik bir kap içerisinde, bir diseksiyon mikroskobu altında kurs diseksiyonuna başlayın. İlk olarak, ağız kancasını pens ile tutun. Ardından, mikro makas kullanarak gövdeyi, ön uçtan yaklaşık üçte bir uzunluktan kesin.

Ardından, anterior uzunluğu bir pensle tutun ve başın ucunu gövdenin içine doğru nazikçe itmek için ikinci bir pens kullanarak larva gövdesini sonunda ters çevirin. 10 dakika içinde bu yöntemle 20 larvalarına kadar hazırlayın ve ardından bunları fiksasyon çözeltisine aktarın. 30 dakika sonra hazırlıkları yıkayın ve immün boyamaya geçin.

Başlamak için, larvaları boğarak hareketsiz hale getirmek amacıyla yaklaşık bir saat boyunca suyun içinde bırakın. Ardından, bir larvayı sırtı yukarı bakacak şekilde silikon kaplı bir kap üzerindeki bir damla PBS'ye yerleştirin. Sırt tarafında iki adet trake tüpü bulunur.

Bir diseksiyon mikroskobu altında, ön uca bir böcek iğnesi yerleştirmek için pens kullanın. Ardından, gövdeyi arka tarafa doğru gerin ve arka uca ikinci bir iğne yerleştirin. Son olarak, mikro makas kullanarak kuyruğun yakınına küçük bir insizyon yapın.

Kesi noktasından başlayarak, kütikül altındaki dokulara zarar vermeden, dorsal orta hattı boyunca başa doğru dorsal kütikülü boylamasına dikkatlice kesin. Kesiyi yaptıktan sonra, vücut duvarlarını iki yana doğru gerin ve köşelerden böcek iğneleriyle sabitleyin. Ardından, pens yardımıyla anterior yağ cismini ve tükürük bezlerini çıkararak beyin-halka bezi kompleksini yüzeyde açığa çıkarın.

Şimdi PBS'yi aspire edin ve hazırlığı fissatif çözeltiye daldırın. 30 dakika sonra, böcek iğnelerini çıkarmak için pens kullanın ve hazırlığı %0.3 PBT ile doldurulmuş bir mikrotüpe aktarın. Ardından, immün boyama işlemine geçin.

Larvaların immün boyamasını yaptıktan sonra, örnekleri %0,3 PBT ile dolu bir kaba aktarmak için tek kullanımlık bir pipet kullanın. Bir diseksiyon mikroskobu altında, kütikülü veya ağız kancasını bir çift pensle tutun. Ardından, yemek borusunun ön ucunu ve göz disklerini keserek beyin-halka bezi göz diski kompleksini vücut kütikülünden ayırmak için, bir mililitrelik şırıngaya takılı 27 gauge bir iğneyi bıçak gibi kullanın.

Ardından, bir pens yardımıyla özofagus ve bağırsağı, beyin-halka bezi göz diski kompleksinden dikkatlice ayırın. Özofagus, ventral sinir kordonunun üzerindeki beyinden geçtiği için bağırsağı posterior tarafa doğru çekin. Son olarak, beyin-halka bezi kompleksini izole etmek için beyin diski, göz diskleri ve bacak diskleri arasındaki bağlantıları bir iğne bıçak ile dikkatlice kesin.

Diseksiyon sırasında keskin kenarlı ince pensler kullanmak oldukça önemlidir. Penslerin kenarları arasında boşluk kalmayacak şekilde birbirine tam oturması için, bir bileme taşı parçasıyla pensleri bilemenizi şiddetle öneririm. Numuneleri aktarmak için geniş ağızlı uçlu bir mikro pipet kullanın.

Numuneleri cam lamın merkezine yerleştirin. Ardından, beynin dorsal tarafında bulunan halka bezinin görüntülenebilmesi için numuneleri forseps kullanarak ventral tarafları üzerine konumlandırın. Daha sonra, lamı eğerek fazla PBT'yi mümkün olduğunca silin.

Ardından, örneklerin yakınına bir damla mount etme reaktifi damlatın ve bir lameli önce reaktifin, sonra da örneklerin üzerine yavaşça indirmek için penset kullanın. Yetişkin dişi overini diseke etmek için sinekleri karbondioksit gazı ile anesteziye alın. Daha sonra başlarını kesin ve gövdelerini PBS ile dolu üç santimetrelik bir kaba aktarın.

Ardından, bir diseksiyon mikroskobu altında, toraksın dorsal tarafını pensle kavrayın ve abdominal A-5 veya A-6 segmentini ikinci bir pensle tutun. Daha sonra, abdominal kütikülü posterior tarafa doğru soyun. Devam etmeden önce, penslerin üzerindeki yapışkan kütikülü temizleyin.

Ardından, bir oviduktu sıkıştırın ve ovaryumu izole edin. Sonra penset kullanarak ovaryum uçlarını ayıklayın ve yayın. Yayındıktan sonra, boyamaya hazırlamak için ovaryumu 30 dakika boyunca fiksatif çözeltide bekletin.

Overnin innervasyonunu koruyan bir preparat hazırlamak için, anestezi uygulanmış dişi sinekleri PBS ile doldurulmuş silikon kaplı bir kaba aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında, probosis'i tutun ve beyni açığa çıkarmak için baş kütikulasını soyun. Beyne bağlı olan trakeayı, beyin ventral sinir korda bağlı kalacak şekilde çıkarın.

Ardından, toraksı dorsal taraftan tutun ve bacaklar ile kanatları çıkarın. Sonra, her bir bacağın tabanından başlayarak toraksın ventral kütikülünü soyun. VNC açığa çıktığında, bir pens yardımıyla VNC'ye bağlı kalan dorsal kütikülü ve kasları çok dikkatli bir şekilde temizleyin.

Beyin ile VNC arasındaki bağlantılara zarar vermeyin. Ardından, pens kullanarak yumurtalıkları ve prop, bağırsak, ovidukt, uterus ve aksesuar bezini içeren etkileşimli organlarını açığa çıkarmak için abdominal kütikülü soyun. Son olarak, trake ve yağ vücudu dahil olmak üzere tüm kalıntı dokuları temizleyin.

Ardından, immünboyama işlemine hazırlamak için örnekleri 30 dakika boyunca fiksatif çözeltide bekletin. İmmünboyamadan sonra, örnekleri bir mikro pipet kullanarak %0,1 PBT içeren bir lam üzerine aktarın. Daha sonra lamı bir mikroskop altında inceleyin ve ovariole dizilerini pens yardımıyla birbirlerinden ayırın.

Bu işlem sırasında ovarioleylerin uçlarını zedelemeyin. Bu kısımlar germaria'yı içerir. Beyin ile üreme organı kompleksini hazırlarken, kalan tüm kütikülleri temizleyin ve yapıları lam üzerine yayın.

Ardından, fazla PBT'nin çoğunu silin ve ardından örneğe bir damla montaj reaktifi uygulayın. Sonra, bir pens yardımıyla lamın üzerine yavaşça bir lamel yerleştirin ve lamı dört derece celsius sıcaklıkta, karanlıkta saklayın. Daha sonra, örnekleri mikroskop altında gözlemleyin ve steroidojenik organları görüş alanına getirin.

Görüş sabitlendikten sonra, görüntüleme sistemini görüntüleme moduna geçirin. Larva evreleri boyunca protorasik bez, anti-shroud antikoru da dahil olmak üzere ekdisteroidojenik enzimlere karşı antikorlar ile işaretlendi. Protorasik bez ile beyin arasındaki nöronal bağlantıyı görselleştirmek için beyin-ring bezi kompleksi diseke edildi.

Fileto diseksiyon yöntemi, bir grup serotonerjik nöronun protorasik bezle, proventrikulusla ve farengeal kaslarla projeksiyon yaptığı stomatogastrik sinir sistemini göstermektedir. Yetişkin dişilerde, ovaryen ekdisteroit, GSC proliferasyonu gibi oogenezin birçok yönünü etkiler. GSC'ler, ovaryumdaki her bir ovariole uç kısmında yer alan germaryumda bulunur.

Germarium içerisinde GSC'ler, 1B1 ve DE-cadherin olmak üzere iki antikor kullanılarak spesifik olarak işaretlendi. Overin innervasyonunu görselleştirmek için over; beyin, VNC, bağırsak, prop, uterus ve spermateka ile birlikte diseke edildi. Nöronlar, n-Synaptobrevin GAL4 sürücüsünün kontrolündeki mCD8:GFP ile görselleştirildi.

Ek olarak, kas yapıları diconjugated phalloidin kullanılarak boyanmıştır. Steroidojenik organların diseksiyonu başlangıçta zor gelse de, organı herhangi bir hasar vermeden daha kolay izole edebilmek için dokuların kesim noktalarını öğrenmek üzere bu videoyu izleyiniz. Protokolümüzün sadece yeni başlayanlar için değil, deneyimli araştırmacılar için de bilgilendirici olmasını umuyoruz.

Bu prosedürde uzmanlaştıktan sonra, yöntemi kendi araştırmanıza uygulayabilir ve ihtiyaçlarınıza göre geliştirebilirsiniz. Bu protokolün, steroid hormon biyosentezinin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına yardımcı olacağını umuyoruz. Daha ayrıntılı, adım adım protokoller makalede mevcuttur.

Lütfen inceleyin.