Name: Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Öğrenin embriyonik sinir tüpünde hücre davranışlarını yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme yöntemiyle. Bu teknik, gelişen nöroepitelyumda uzun süreli gözlem yaparak gelişimsel nörobiyoloji araştırmalarına önemli katkılar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Bulaşık Hazırlık <ol><li> Kesit kültürü için kullanılan Yemekleri (WillCo yemekleri) (temel olarak bir coverslip ile) altı cam vardır. Bu cam taban temiz tutmak için 6 cm doku kültürü çanak lens dokusu yerleştirilir. </li><li> Deney bir gün önce, poli-L-lizin katı cam alt izin verecek şekilde, oda sıcaklığında 5dk süreyle cam dipli çanak ve inkübe 2 ml% 0.1 poli-L-lizin solüsyonu ilave edin. </li><li> Poli-L-lizin çözeltisi kaldırmak ve deiyonize su içinde üç kez durulama ve sonra bir defa% 70 etanol içinde. </li><li> Gece kurumaya bırakın. Yemekleri de yavaşça 30-45 saniye süreyle düşük güçte mikrodalga fırında ısıtılarak kurutulabilir. </li></ol> 2. Embriyo Elektroporasyon <ol><li> 37 yumurta inkübe ° C Hamburger-Hamilton (HH) evre 10 (~ 36 saat) (veya diğer istenen sahne) için. </li><li> Başlayan cam iğneler (biz bir Flaming / Kahverengi modeli P87 microcapillary çektirmesi kullanın) hazırlamak ve needl den ucu koptu öncee bir mikroskop altında ince bir pens kullanarak. Bu DNA solüsyonu enjeksiyonu engelleyecek kadar dar olmamasına rağmen iğnenin ucunu embriyo delmek için yeterli keskinlikte olmalıdır. </li><li> Embriyonun iki tarafında Pencere yumurta ve yer elektrotlar (5mm) </li><li> Nöral tüp içine - DNA (hızlı yeşil küçük bir miktar ile boyanmaktadır deiyonize suda 0.5 mg / ml ~ 0.025) enjekte edilir. </li><li> Mevcut uygulama - darbeler arasında 950 ms 12-17 V üç kez, 50ms darbe uzunluğu. </li><li> Biz tek tek hücrelerin takip edebilirsiniz böylece mozaik ifade elde etmek için DNA düşük konsantrasyonlarda ve düşük elektroporasyon gerilim kullanın. </li><li> Cellotape ile yumurta kabuğu pencere Kapak ve mühürlü olduğundan emin olun. </li><li> Embriyoların 37 3-4 saat veya gece boyunca kurtarmak için izin ° C </li></ol> 3. Kollajen ve Dilim Kültür Orta Hazırlık <ol><li> Dilimleme önce yaklaşık bir saat kollajen karışımı ve dilim kültür ortamı hazırlayın. </li><li> 300 ul tYPE 1 kollajen 100 ul% 0.1 asetik asit solüsyonu ve 100 ul 5 x L15, orta ekleyin. Her eklemeden sonra iyice vorteksleyin. Çözüm sarı açmalısınız. </li><li> Şimdi 15-20 ul% 7.5 sodyum bikarbonat ve iyice vorteks ekleyin. Çözeltisi hafif pembe olmalıdır, ve bunun için gerekli sodyum bikarbonat hacmi farklı olabilir. Buz üzerinde tutun ve her zaman taze oluşturuyor. </li><li> 10 ml neurobasal ortam, bir 1 x nihai konsantrasyona ve 10 ul gentamisin çözeltisine, B-27 takviyesi ve Glutamax eklemek. </li><li> 37 ° C inkübatör koyun orta% 5 CO 2 ile tampon. Bu CO2 ile dengelenmesi için izin vermek için kabın üst serbest bırakır. </li></ol> 4. Dilim Kültür <ol><li> Yumurtadan embriyo çıkarın ve L15 ortamda yıkayın. </li><li> Bir altta sylgard tabakası ve gerildi böylece çevreleyen ekstra embriyonik zarlar yoluyla onları iğnelemek bir doku kültür kaplarına koyun. </li><li> Bir mikrofon kullanarakroknife, ilgi bölgesinden geçen dilim embriyonu olarak düz mümkün. Spinal kord için, kalın dilimler 1-2 Somitlerin arasında olmalıdır. Bunları kaybetmemeniz için diğer embriyolar dilim ise embriyo bağlı dilimleri bırakın. </li><li> Ucu ~ 1 mm kesmek ve bir p2 veya p10 bu takarak bir 200 ul mikropipet ucu hazırlayın. Bu ucu cam alt çanak omurilik dilimleri aktarmak için kullanılacaktır. A 10 ul ucu dilim almak için yeterince geniş değil. </li><li> Coat daha önceden hazırlanmış 1 ul kollajen karışımı pipetleme kollajen ile ucunun içinde. L15 orta ile yıkayın daha sonra 1-2 dakika bekletin ve. Bu ucu içine yapışmasını doku önleyecektir. </li><li> Bir microknife kullanarak embriyodan dilim ayırın ve 200 ul ucu ile donatılmış ve 1 ul ayarlanmış bir p2 veya p10 kullanarak çanak kaldırmak. Mümkün olduğu kadar az aracı olarak almaya çalışın. </li><li> Poli-L-Lizin kaplamalı çanak üzerindeki bu vorteks kollajen karışımı ve damla 5-8 ul. </li><li> Immedialarına ince forseps bir çift ile yerine kollajen ve pozisyona embriyo dilim koydu. Dilimler yansıması ile yan coverslip ile aynı hizada olacak şekilde yerleştirilmelidir. Doku coverslip üzerindeki poli-l-lizin kaplama uymalıdır. </li><li> Eğer coverslip birkaç dilim bulana kadar tekrarlayın. Biz genellikle bir çanak üzerine 6-9 dilim yerleştirebilirsiniz. </li><li> Tüm dilimler yerinde sonra, çanak kapağı ve kollajen 20 dakika ayarlamanızı sağlar. Erken yerleştirilen kollajen bazıları şimdiden kurumaya başlamış olabilir. Bu bu kapsayan önce L15 için küçük bir miktar eklemek önlemek için. </li><li> Bir kez, dikkatle ayarlanmış en az bir saat için 37 ° C&#39;de% 5 CO 2 dengelenmiş oldu 2ml dilim kültür ortamı ekleyin. Bakım coverslip gelen kollajen çıkarmak değil alınmalıdır. </li><li> 37 ° /% 5 CO2 inkübatör Yeri ve dilimleri görüntüleme önce en az 3 saat kurtarmak için izin verir. Bir kutu zekâ hiç nem, yer çanak varsabir köşede nemli kağıt mendil ha biraz. </li></ol> 5.. Görüntüleme Embriyo Dilimleri <ol><li> Biz görüntü dilimleri bir Weatherstation kazanı ile donatılmış bir DeltaVision Çekirdek geniş alan mikroskobu kullanın. Odacık sürekli% 5 CO2 /% 95 hava azından mikroskop aşamasında sürdürmek için bir CO2 perfüzyon aparatı ile 37 ° C&#39;de muhafaza edilir. </li><li> Görüntüleme normalde 40 x / 1.30 NA immersiyon yağı lens kullanarak ve görüntüleri CCD kamera soğutmalı bir CoolSnap HQ2 ile yakalanan yapılmaktadır. </li><li> Z-bölümleri 45 mikron doku aracılığıyla her 1.5 mikron yakalanır. Pozlama süresi mümkün olduğu kadar düşük tutulmalıdır. Biz normalde her Z-bölüm için 5-50 ms için maruz. Görüntüler her 7 dakikada yakalanır ve en fazla 9 dilim fonksiyonu Ziyaret DeltaVision sistemin hassas noktası kullanarak ziyaret edilebilir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Bir omurilik progenitör hücre örneği time-lapse sırasıŞek. 2a ve tekabül eden film 1. Görüntüleme iki gün yaşlı (HH aşamada 12) embriyo bir omurilik dilim başlandı. Bu hücre GFP-αTubulin ifade eden bir yapı ile transfekte edildi. Bu erken aşamada, nöral progenitör hücrelerin ağırlıklı hücreleri iki tane daha bisiklet progenitör hücreler üretmek için bölmek sırasında progenitör-progenitör modu bölünmeler uğrarlar. Şekil. 2b ve tekabül eden film 2 hücre membran işaretleme, GFP-GPI (GPI GFP demirli) ile transfekte edilmiş bir hücre gösterir. Bu hücre bazal süreci ikiye böler ve eşit kızı hücreleri tarafından devralınan sırasında bir bölümü uğrar. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig1.jpg" /> Şekil 1.. Time-lapse görüntüleme için Dilim kültür protokolü. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig2.jpg" /> Şekil 2. Hücre bNormal omurilik gelişimi sırasında ehavior. Movie 1 (a) Seçilmiş kareleri. GFP-tubulin ifade Hücre bir kez daha (24 saat 23 dk ve 25 saat 54 dakika) bölen iki kızı üreten hücreleri, apikal yüzeye (2 saat 20 dakika) dik bir bölünme uçağı ile böler. (B) Film 2 Seçili karelerin. GFP-GPI ile transfekte Hücre bazal süreci bölünmüş (beyaz ok) ve eşit kızı hücreleri tarafından devralınan sırasında hücre bölünmesi uğrar. Movie 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">filmi görmek için buraya tıklayın</a> . Film 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">filmi görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol><li>Ulloa, F., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogens+and+the+Control+of+Cell+Proliferation+and+Patterning+in+the+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord.</a> Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).</li>
<li>Briscoe, J., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+pathways+linking+progenitor+patterning%2C+cell+fates+and+neurogenesis+in+the+ventral+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).</li>
<li>Shiau, C., Das, R., Storey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+assay+for+high+cellular+resolution+time-lapse+imaging+of+sensory+placode+formation+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An effective assay for high cellular resolution time-lapse imaging of sensory placode formation and morphogenesis.</a> BMC Neuroscience. 12, 37(2011).</li>
<li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+orientation+distinguishes+stem+cell+and+terminal+modes+of+neuron+production+in+the+early+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord.</a> Development. 134, 1943-1954 (2007).</li>
<li>Vilas-Boas, F., Fior, R., Swedlow, J. R., Storey, K. G., Henrique, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+reporter+of+notch+signalling+indicates+regulated+and+random+notch+activation+during+Vertebrate+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel reporter of notch signalling indicates regulated and random notch activation during Vertebrate neurogenesis.</a> BMC Biology. 9, 58(2011).</li>
<li>Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bios+Scientific+Publishers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Bios Scientific Publishers. , (1998).</li>
<li>Conchello, J. -A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nat. Meth. 2, 920-931 (2005).</li>
<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Fundamental+Limits+in+Confocal+Microscopy+Handbook+Of+Biological+Confocal%22">Fundamental Limits in Confocal Microscopy Handbook Of Biological Confocal</a>. Pawley, J. B. , Springer US. (2006).</li>
<li>Swedlow, J. R., Hu, K., Andrews, P. D., Roos, D. S., Murray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+tubulin+content+in+Toxoplasma+gondii%3A+A+comparison+of+laser-scanning+confocal+and+wide-field+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Measuring tubulin content in Toxoplasma gondii: A comparison of laser-scanning confocal and wide-field fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 2014-2019 (2002).</li>
<li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+performance+in+three-dimensional+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 228, 390-405 (2007).</li>
<li>Biggs, D. S. C. 3D Deconvolution Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBiggs%2C+DSC+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22">Current Protocols in Cytometry</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging%3A+Opportunities%2C+limitations%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz tavuk embriyonik kesit kültürü hücre davranışlarını izlemek için buraya yeni bir time-lapse görüntüleme testi sunuyoruz. 24-48 saat arasında zaman kareleri yakalamak daha kolay olmasına rağmen Bu testte, 70 saate kadar canlı doku için yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar. Yüksek NA petrol objektif ve zaman noktaları arasında nispeten kısa aralıklarla kullanımı de bize genellikle hızlı gelişir hücre davranışlarını izlemek için izin olarak, yüksek çözünürlükte görüntü toplama sağlar, ve kolayca konfokal kullanarak geleneksel time-lapse görüntüleme sırasında atlanabilir mikroskopi. Bu testin önemli avantajı uzun süreler boyunca görüntü hücrelere yeteneğidir. 7 mikroskobu konfokal lazer yerine geniş alan 6 kullanımı bunun için önemlidir. Konfokal mikroskop geleneksel optik kesitler alıp doğrudan odak bilgi dışarı ortadan kaldırmak için yeteneği de dahil, geniş alan mikroskopisi karşı çeşitli avantajlar sundu <sup&gt; 7, ancak bir iğne deliği kullanımını önemli bir bilgi miktarı hariç, ve daha uzun maruz kalma süresi gerektiren, dedektör 8 ışık kaybına yol açmaktadır. Geniş alan mikroskopisi, diğer taraftan tam saha aydınlatma kullanan ve amacı ile, tüm geçen ışık dedektörü gönderilir. Bir yüksek kuantum verimliliği ile birleşince birleştiğinde cihaz (CCD) kamerası çok hızlı pozlama süreleri ile konfokal mikroskopi 9, göre gürültü oranı yüksek bir sinyal ile görüntüleme sağlar soğutulur. Bizim uygulama, biz uzun süre, kayıt 3D yığınları ve sonuçta küçük yakın kırınım sınırlı yapıları çözmek için görüntü gerekir. Konfokal mikroskopi hiç dedektör ulaşmasını out-of-focus ışığı engeller ve böylece önemli ölçüde kalın, yoğun-etiketli örnekleri 7, 8 arka plan azaltmakla birlikte, sadece çok daha fazla ışık girişi ile kullanılabilir bir sinyal-gürültü oranı elde geniş alan mikroskopisi 10. Çok ışığa duyarlı sparsel içinBizim electroporated omurilik dilimleri gibi y-etiketli örnekleri, bu nedenle, geniş alan mikroskopisi konfokal mikroskopi daha iyi yapar. Dekonvolüsyonun tarafından görüntü restorasyonu ile birlikte, hangi odak bilgi dışarı çıkarır ve geliştirir kontrast, geniş alan, küçük, loş nesnelerin 11 tespiti için özellikle iyi o olduğunu. Her doku görüntüleme deney için uygun olmasa da, bu yaklaşım bizim canlı hücre görüntüleme uygulaması için çok etkili olmuştur. Floresan protein seçimi hücre yaşamını etkileyebilen önemli bir faktördür. Biz iyi sonuçları bir belirteç olarak yeşil floresan protein (GFP) 12 kullanımı yapıları elde görürüz. Şu anda etkin bir şekilde iki kanallı zaman ihmallerini GFP ile kombinasyon halinde de kullanılabilir kırmızı floresan proteinleri bir dizi değerlendirilmesi bulunmaktadır. 13 kullanılabilir Bu tür proteinleri bir dizi vardır. Birçok protein bir floresan protein füzyon olarak stabil olmasına rağmen, Bazı proteinler düşük hücre canlılığı ile sonuçlanan, füzyon ile kararsız kılınabilir. Bu gibi durumlarda, dahili bir ribozom giriş sitesi (IRES) içeren yapıları kullanımı flüoresan protein ilgili proteini ayırmak için yararlıdır. Zaman görüntüleme spinal kord dilimleri, bakım floresan ışığına maruz kalma en aza indirmek için alınması gerekir. Mikroskop mercekleri dilimleri bulun ve pozisyona geçen ışık (aydınlık) ile kullanılabilir olmalıdır. Floresan resimler her zaman az pozlama süreleri kullanarak mikroskop yazılımı kullanılarak elde edilmelidir. Bunlar, 5-50 ms aralığında tutulması ve nötr yoğunluğu filtrelerin kullanımının deneyler edilmelidir. Uzun pozlama süreleri başlangıçta daha net görüntüler üretmek olsa da, floresan ışıkta fototoksik etkilerini hücre ölümüne yol açabilir. Bu bölgede sırasında zarar görmüş olabilen doku içerir coverslip en yakın olan doku ilk 5-10 mikron görüntülenmiştir edilmemelidirdilimleme. Burada sunulan örnekler HH aşaması 10 ve daha sonra fazla görüntülü 6-7 saat electroporated embriyo olmakla birlikte, bu yöntem aşaması 18 HH embriyosu için kullanılabilmektedir. Daha sonraki aşamalarda, spinal kord doku çok daha büyük olduğu ve bu yüzden, elle dilim zordur. Bu durumlarda, düşük erime noktası agaroz içinde embriyo yerleştirilmesi ve bir vibratome ile kesit daha iyi sonuçlar verebilir. Biz gelişmekte olan omurilik görüntüleme hücreleri için bir yöntem olarak bu testte sunmak olsa da, bu yaklaşım aynı zamanda duyusal placodes 3 dahil olmak üzere görüntü diğer embriyonik dokular için modifiye edilmiştir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> WillCo Bulaşık </td><td> WillCo Wells </td><td> GWst-3522 </td><td></td></tr><tr><td> poli-L-Lizin </td><td> Sigma </td><td> P8970 </td><td> Tris% 0.1 </td></tr><tr><td> Borosilikat cam kılcal </td><td> Harvard Aletleri </td><td> GC100-10 </td><td> 1.0mm dış çaplı, 0.58mm iç çapı </td></tr><tr><td> Elektrotlar (Genetrodes, ovo içinde, L-şekilli </td><td> BTX </td><td> 10-001850-01 </td><td> 5mm altın kaplama </td></tr><tr><td> ECM 830 kare dalga üreteci </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td> ovo electroopration içinde için </td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Sigma </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> Ben sıçan kollajen yazın </td><td> Sigma </td><td> C3857 </td><td></td></tr><tr><td> L-15 orta (toz) </td><td> Sigma </td><td></td><td> 2.76 g / L damıtılmış su içinde 5x çözüm </td></tr><tr><td> Sodyum bikarbonat </td><td> Sigma </td><td> S8761 </td><td> % 7.5 çözümü </td></tr><tr><td> Neurobasal orta </td><td> Invitrogen </td><td> 12348-017 </td><td> fenol kırmızısı olmadan </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> A1286001 </td><td> 100x çözüm </td></tr><tr><td> B-27 takviyesi </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15710049 </td><td> 10 mg / ml </td></tr><tr><td> L15 orta (sıvı 1x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Altomed </td><td> A10102 </td&gt; <td> 15 derecelik eğim </td></tr><tr><td> Paslanmaz çelik başsız pimler </td><td> Watkins ve Doncaster </td><td> E6871 </td><td> A1 boyutu </td></tr><tr><td> Sylgard 184 elastomer </td><td> VWR </td><td> 634165S </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision Çekirdek mikroskop sistemi </td><td> Uygulamalı Hassas </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coolsnap HQ2 CCD kamera </td><td> Fotometri </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gelişmekte neuroepithelium hücre davranış yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Embriyonik spinal kord merkezi sinir sistemi (MSS) ve nöronal gliyal hücreleri büyük bir yüzdesi yol sinir hücrelerini progenitör bisiklet oluşur. Kadar moleküler mekanizmaları desen spinal kord hakkında bilinen ve nöronal farklılaşma 1, 2 ortaya çıkarmak olmasına rağmen, bu hücre davranış seviyesinde bu ilk etkinlik derin bir anlayış yoksundur. Onlar nörogenez geçerken, gerçek zamanlı olarak nöral progenitörlerin davranışlarını incelemek böylece önemlidir. Erken embriyonik doku geçmişte, gerçek zamanlı görüntü hücre / doku kültüründe canlılığı gibi floresan görüntüleme fototoksik etkileri ile sınırlı kalmıştır. Burada yeni bir ex-vivo kesit kültürü protokolü ve geniş alan floresan mikroskobu (Şekil 1) kullanarak, uzun süreler için görüntüleme gibi doku için yeni bir test sunuyoruz. Bu yaklaşım civciv embriyonik s uzun vadeli time-lapse izleme ulaşıryüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip Pinal kablosu progenitör hücreler. Bu testte geni faaliyeti için hücresel ve alt-hücresel davranışları, yeni bir gelişme ve çok hassas Muhabirlerin gözlem ek görüntü embriyonik dokular 3, 4, bir dizi ile değiştirilebilir (örneğin, Çentik sinyalleşme 5) Bu testte yapar sinyalizasyon nasıl anlamak için güçlü bir araç embriyonik gelişim sırasında hücre davranışı düzenler.

Gerçek zamanlı görüntüleme embriyonik doku uzun süre boyunca meydan okuyor. Burada yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip uzun süre civciv omurilik hücresel ve alt hücresel değişikliklerin izlenmesi için bir test sunuyoruz. Bu teknik, sinir sistemi ve geliştirme embriyo diğer bölgeleri için adapte edilebilir.

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

Embriyonik omurilik, merkezi sinir sisteminin nöronal ve glial hücrelerinin büyük bir kısmını oluşturan döngüye giren nöral progenitör hücrelerden meydana gelir...

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik nöral tüp içerisindeki hücre davranışlarını yüksek çözünürlükte ve uzun süreler boyunca görüntülemektir. Bu işlem, öncelikle erken evre nöral tüpün, tekil hücreleri işaretlemek amacıyla seçilen bir floresan proteinin ekspresyonunu yönlendiren bir konstrükt ile transekt edilmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, erken evre embriyodan kesitler almak ve bunları cam tabanlı kaplara monte etmektir.İnkübatörde geri kazanımın ardından, embriyo dilimleri belirli aralıklarla geniş alanlı bir mikroskopla görüntülenir. Nihayetinde bu teknik, gelişmekte olan nöroepitelyum içindeki hücre davranışlarının yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle uzun süreler boyunca incelenmesi için kullanılabilir. Bu tekniğin canlı doku görüntüleme için mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bireysel hücre davranışlarının yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle uzun süreler boyunca gözlemlenmesine olanak tanımasıdır.Bu yöntem, gelişimsel nörobiyoloji alanındaki; mitotik iğcik oryantasyonunun sülfat seçimindeki rolü veya sinyalizasyon dinamiklerinin hücre davranışını nasıl düzenleyebileceği gibi temel soruları ele almanıza olanak tanır. Plazmidlerin nöral tüpe elektroporasyonu öncesinde, bir dissection mikroskobu altında mikro kapiler çekici kullanılarak cam iğneler hazırlanır. İğnenin ucunu kırmak için ince pensler kullanın.İğnenin ucu, DNA solüsyonunun enjeksiyonunu engellemeyecek kadar dar olmayacak, ancak nöral tüpü delecek kadar keskin olmalıdır. Bu deney için kullanılan X'ler, Hamilton evresi 10'a ulaşmaları için yaklaşık 36 saat boyunca 37 °C'de inkübe edilmiştir.Bu prosedüre başlamak için, yumurtaya pencere açın ve elektrotları embriyonun her iki yanına beş milimetre ara ile yerleştirip nöral tüpe DNA enjekte edin. Görselleştirme için DNA, az miktarda fast green ile renklendirilmiştir. 12 ila 17 volt akım ve 50 milisaniyelik darbe uzunluğunu, darbeler arasında 950 milisaniye olacak şekilde üç kez uygulayın.Tekil hücrelerin takip edilebilmesi için mozaik ekspresyon sağlamak amacıyla düşük DNA konsantrasyonları ve düşük elektroporasyon voltajları kullanılır. Son olarak, yumurta kabuğundaki pencereyi şeffaf bantla kapatın ve sızdırmaz olduğundan emin olun. Embriyoların 37 °C'de üç ila dört saat veya gece boyuncale toparlanmasına izin verin.Kolajen karışımı ve dilim kültür ortamı, embriyolar dilimlenmeden yaklaşık bir saat önce hazırlanmalıdır. Kolajen karışımını hazırlamak için, 300 µL tip 1 kolajene 100 µL %0,1 asetik asit çözeltisi ekleyip iyice vorteksleyin, ardından 100 µL 5X L 15 ortamı ekleyip tekrar iyice vorteksleyin. Çözeltinin rengi sarıya dönmelidir.Ardından, 15 ila 20 µL %7,5 sodyum bikarbonat ekleyin ve iyice vorteksleyin. Çözelti hafif pembe renge dönmelidir. Buz üzerinde muhafaza edin.Bu kolajen karışımı her seferinde taze olarak hazırlanmalıdır. Dilim kültürü ortamını hazırlamak için, 10 mililitre nörobazal ortam, B 27 takviyesi, glutmax ve Gentamisin çözeltisini ekledikten sonra, ortamı %5 karbondioksit ile tamponlanmış 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Karbondioksit ile dengelenmesi için kabın kapağını en az bir saat boyunca gevşek bırakın.Bu prosedüre başlamak için, embriyoyu çıkarmak amacıyla küçük bir makas kullanın. Embriyoyu, L 15 medyum ile yıkayarak penset yardımıyla yumurtadan çıkarın. Embriyoyu, tabanında syl guard tabakası bulunan bir doku kültürü kabına yerleştirin.Embriyoyu, çevreleyen ekstra embriyonik membranlar aracılığıyla membranlar gerginleşene kadar iğneleyin. Bir mikro bıçak kullanarak embriyoyu, ilgi duyulan bölgeden mümkün olduğunca düz bir şekilde kesin. Omurilik kesitleri bir ila iki somit kalınlığında olmalıdır; yaprak kesitleri, diğer embriyolar kesilirken kaybolmamaları için embriyonun lateral dokusuna tutturulmalıdır.Omurilik kesitlerini cam tabanlı kaba aktarmak için özelleştirilmiş bir mikro pipet ucu gereklidir. Bunu hazırlamak için, bir P2 veya P10 pipete 200 mikrolitrelik bir uç takın ve ucun sonundan yaklaşık bir milimetreyi kesin. Daha önce hazırlanan kolajen karışımından bir mikrolitre hazırlayarak ucun içini kolajen ile kaplayın.Bir ila iki dakika bekletin ve ardından L 15 medyumu ile durulayın. Bu işlem, dokunun pipet ucunun içine yapışmasını önleyecektir. Şimdi, bir mikro bıçak kullanarak embriyodan bir kesit ayırın ve 200 µL uç takılmış P 2 veya P 10 ile kesiti kaptan çıkarın.Mümkün olduğunca az besiyeri almaya çalışın. Kollajen karışımını vorteksleyin ve beş ila sekiz µL miktarını, tabanı lamel olan poliol lizin kaplı cam tabanlı bir kaba damlatın; ardından embriyo kesitini hemen kollajenin içine yerleştirin ve ince uçlu bir penset yardımıyla konumlandırın. LIC'ler, görüntülecek olan tarafı lamel ile aynı hizada olacak şekilde konumlandırılmalıdır.Dokunun, lamel üzerindeki poli-L-lizin kaplamaya tutunması gerekir. Lamel üzerinde birkaç kesit elde edene kadar bu işlemi tekrarlayın. Genellikle bir kaba altı ila dokuz kesit yerleştirilir.Tüm kesitler yerleştirildiğinde, kolajenin bulunduğu en erken bölgeye iki ila üç mikrolitre L 15 besiyeri ekleyin ve kabın kapağını kapatın. Kolajenin 20 dakika boyunca donmasını bekleyin. Kolajen donduktan sonra, %5 karbondioksit ve 37 derece Celsius ortamında en az bir saat boyunca dengelenmiş iki mililitre kesit kültür besiyerini dikkatlice ekleyin.Kolajenin lamelden yerinden çıkmamasına dikkat edilmeli, lameller 37 °C ve %5 karbon dioksit içeren bir inkübatöre yerleştirilmeli ve görüntülemeden önce en az üç saat boyunca toparlanmaya bırakılmalıdır. Doku içindeki hücre davranışlarını uzun süre boyunca, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlükte görüntülemek zorludur. İyi sonuçlar elde etmek için optimal kültür koşullarının ve beyaz alan mikroskopisinin kombinasyonu gereklidir.Kesitlerin görüntülenmesi için hava istasyonu çevresel odasıyla donatılmış bir delta vision core geniş alan mikroskobu kullanılır. Oda, mikroskop tablasını %5 karbondioksit ve %95 hava seviyesinde tutan bir karbondioksit perfüzyon aparatı ile sürekli 37 °C'de tutulur. Görüntüleme normalde 40x 1.30 NA yağ daldırma lens kullanılarak gerçekleştirilir ve görüntüler core snap HQ two soğutmalı CCD kamera ile yakalanır. 45 µm'lik doku boyunca her 1,5 µm'de bir Z kesitleri alınır. Pozlama süresi mümkün olduğunca düşük tutulmalıdır; örneğin 5 ila 50 ms.Sözü edilen her bir kesit için her yedi dakikada bir görüntüler alınır. Delta görüntüleme sistemleri kullanılarak dokuz dilime kadar ziyaret gerçekleştirilebilir. Burada gösterilen hassas nokta ziyaret fonksiyonu, GFP alfa Tubulin eksprese eden bir konstrükt ile transfekte edilmiş bir spinal kord progenitör hücresinin zamanlapse dizisi örneğidir; görüntüleme, iki günlük HH evre 12 embriyodan alınan bir spinal kord kesiti üzerinde başlatılmıştır.Bu erken evrede, nöral progenitor hücreler ağırlıklı olarak progenitor progenitor modunda bölünmelere girer ve bu süreçte hücreler, iki adet daha döngüsel progenitor hücre üretmek üzere bölünür. Bu şekil, az önce gösterilen time-lapse dizisinden seçilmiş kareleri göstermektedir. İki saat 20. dakikada hücre, apikal yüzeye dik bir bölünme düzlemiyle bölünerek iki yavru hücre oluşturur.Bu iki hücre, 24 saat 23 dakika ve 25 saat 54 dakikalarda bir kez daha bölünür. Sıradaki zaman atlamalı sekans, hücre membranını işaretleyen G-F-P-G-P-I ile transfekte edilmiş bir hücreye aittir. Bu hücre, beyaz oklarla belirtilen bazal prosesin ikiye ayrıldığı ve kız hücreler tarafından eşit şekilde miras alındığı bir bölünme geçirir.Bu hızlandırılmış çekim dizisinden seçilen kareler, hücre bölünmesinin sıfır saat ve 49. dakikada gerçekleştiğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, omurilik kesitlerinin nasıl hazırlanacağı ve görüntüleneceği konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız. Unutmayın, eğer bu tekniğe yeniyseniz, işlemin başarılı olması için bir araya gelmesi gereken bir dizi teknik açıdan zorlayıcı adım bulunduğu için başlangıçta zorluk yaşayabilirsiniz.

high-resolution-live-imaging-cell-behavior-developing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Mevcut video, gelişmekte olan zebrafish önbeyin bireysel nöral progenitör hücrelerin canlı görüntüleme gerçekleştirmek için elektroporasyon ve konfokal mikroskopi kombinasyonu yararlanır bir yöntem gösteriyor.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Biz fare önbeyin nöronal göç gerçek zamanlı videoimaging için bir protokol açıklar. Viral etiketli veya aşılı nöronal öncüllerinin göç durağan ve göç fazlarının süreleri ve hız gibi hücre göçü farklı evreleri, incelemek için nispeten hızlı toplama aralığı ile geniş alan floresan görüntüleme kullanarak akut canlı dilim kaydedildi göç.

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

Bu protokol, görüntüye Caenorhabditis elegans embriyolarında bir doku içinde bölünen hücreleri açıklamaktadır. Birkaç protokoller embriyonun erken görüntü hücre bölünmesi için, bu protokol nasıl mid geç embriyonik dönemde gelişmekte olan bir doku içinde hücre bölünmesi görüntü açıklar nasıl tarif ederken.

Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyo

Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Canlı görüntüleme gerçek zamanlı olarak hücresel davranışlarını incelemek için güçlü bir araçtır. Burada, hızlandırılmış video-ayrıntılı bir inceleme, birincil sinir kök hücreleri farklı nöronlar ve glia lineage ilerleme sırasında yürürlüğe giren aşamaları sağlayan mikroskobu Primer serebral korteks hücre için bir protokol açıklayın.

Primer serebral korteks hücre bir 2D kültür sistemi kullanarak görüntüleme yaşamak

Sinirsel nüfus tarafından hızlandırılmış video mikroskobu esaslı bilgisayar yazılımı Post-processing takip izlemek için sağlam bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem canlı görüntüleme deneyler sırasında seçili bir popülasyondaki biyolojik olayları tanımlamak için güçlü bir araç temsil eder.

Tek hücreli Monitor hücre biyolojisi ve birden çok sinir nüfus Lineage ilerlemesini izleme ve ardından görüntüleme yaşamak

Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Öğrenin embriyonik sinir tüpünde hücre davranışlarını yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme yöntemiyle. Bu teknik, gelişen nöroepitelyumda uzun süreli gözlem yaparak gelişimsel nörobiyoloji araştırmalarına önemli katkılar sağlar.

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

Daha fazla video keşfet