Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik nöral tüp içindeki hücre davranışını uzun süreler boyunca yüksek çözünürlükte görüntülemektir. Bu, ilk olarak, tek hücreleri işaretlemek için tercih edilen bir floresan proteinin yapısal bir sürüş ifadesi ile erken nöral tüpün kesilmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, erken embriyodan dilimler yapmak ve bunları cam tabanlı tabaklara monte etmektir.

Bir inkübatörde iyileşmeden sonra, embriyo dilimleri düzenli aralıklarla geniş alan mikroskobunda görüntülenir. Sonuç olarak, bu teknik, gelişmekte olan nöro epitel içindeki hücre davranışını yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle uzun süreler boyunca incelemek için kullanılabilir. Bu tekniğin canlı dokuyu görüntülemek için mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bireysel hücre davranışını uzun süreler boyunca yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte gözlemlememize izin vermesidir.

Bu yöntem, sülfat seçiminde mitotik iğ oryantasyonunun rolü veya plazmitlerin nöral tüpe elektroporasyonundan önce sinyal dinamiklerinin hücre davranışını nasıl düzenleyebileceği gibi gelişimsel nörobiyoloji alanındaki temel soruları ele almanıza olanak tanır. Cam iğneler, diseksiyon mikroskobu altında mikro kılcal çektirme kullanılarak hazırlanır. İğnenin ucunu kırmak için ince forseps kullanın.

İğnenin ucu, nöral tüpü delecek kadar keskin olmalı, ancak DNA çözeltisinin enjeksiyonunu engelleyecek kadar dar olmamalıdır. Bu deney için X, Hamilton'u hamburgerlemek için yaklaşık 36 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edildi. Aşama 10.

Bu işleme başlamak için, pencere ve yumurta ve embriyonun her iki tarafına beş milimetre aralıklarla elektrotlar yerleştirin, DNA'yı nöral tüpe enjekte edin. DNA, görselleştirme için az miktarda hızlı yeşil ile renklendirilir. Darbeler arasında 12 milisaniye ile üç kez 17 ila 50 volt ve 950 milisaniye darbe uzunluğunda bir akım uygulayın.

Düşük DNA konsantrasyonları ve düşük elektroporasyon voltajları, tek tek hücrelerin takip edilebilmesi için mozaik ekspresyon elde etmek için kullanılır. Son olarak, yumurta kabuğundaki pencereyi kiler bandı ile kapatın ve sızdırmaz olduğundan emin olun. Embriyoların üç ila dört saat veya gece boyunca 37 santigrat derecede iyileşmesine izin verin.

Kollajen karışımı ve dilim kültür ortamı, embriyoların dilimlenmesinden yaklaşık bir saat önce hazırlanmalıdır. Kollajen karışımını 100 mikrolitre% 0.1 asetik asit çözeltisinde 300 mikrolitre tip bir kollajen içine hazırlamak ve iyice girdap yapmak için, 100 mikrolitre beş kez L 15, orta ekleyin ve iyice girdap yapın. Yine, çözelti sararmalıdır.

Ardından, 15 ila 20 mikrolitre% 7.5 sodyum bikarbonat ekleyin ve iyice girdaplayın. Çözelti biraz pembe olmalıdır. Buz üzerinde tutun.

Bu kolajen karışımı her seferinde taze olarak hazırlanmalıdır. Dilim kültür ortamını aşağıdaki 10 mililitre nöro bazal ortama, B 27 takviyesi glut max ve Gentamisin çözeltisine hazırlamak için, ortamı% 5 karbondioksit ile tamponlanmış 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Karbondioksit ile dengelenmesine izin vermek için kabın üst kısmını en az bir saat gevşek bırakın.

Bu işleme başlamak için, embriyoyu kesmek için bir çift küçük makas kullanın. L 15 medium'u yıkayarak cımbızla embriyoyu yumurtadan çıkarın. Embriyoyu, altta bir syl koruyucu tabakası olan bir doku kültürü kabına yerleştirin.

Embriyoyu çevredeki ekstra embriyonik zarlardan dışarı doğru sabitleyin, böylece zarlar gergin olur. Bir mikro bıçak kullanarak, embriyoyu ilgilenilen bölgeden mümkün olduğunca düz bir şekilde dilimleyin. Omurilik dilimleri, embriyonun yan dokusuna tutturulmuş bir ila iki somit kalınlığında yaprak dilimleri arasında olmalıdır, böylece diğer embriyolar dilimlenirken kaybolmazlar.

Omurilik dilimlerini cam tabanlı tabağa aktarmak için özelleştirilmiş bir mikro perpet ucu gereklidir. Bunu hazırlamak için, 200 mikrolitrelik bir ucu P iki veya P 10 permana takın ve ucun ucundan yaklaşık bir milimetre kesin. Daha önce hazırlanmış olan kolajen karışımından bir mikrolitre hazırlayarak ucun içini kolajen ile kodlayın.

Bir ila iki dakika bekletin ve ardından L 15 medium ile durulayın. Bu, dokunun ucun iç kısmına yapışmasını önleyecektir. Şimdi bir mikro bıçak kullanarak embriyodan bir dilim ayırın ve 200 mikrolitrelik uç ile donatılmış P iki veya P 10'u kullanarak dilimi tabaktan çıkarın.

Mümkün olduğunca az ortam kaplamaya çalışın. Kollajen karışımını girdaplayın ve beş ila sekiz mikrolitresini, taban olarak bir kapak kaymalı poliol lizin kaplı bir cam alt tabağa bırakın, embriyo dilimini hemen kollajenin içine koyun ve bir çift ince forseps ile konumlandırın. LIC'ler, görüntülenecek taraf kapak fişi ile aynı hizada olacak şekilde konumlandırılmalıdır.

Doku, kapak kızağı üzerindeki poliol lizin kaplamaya yapışmalıdır. Kapak fişinde birkaç dilim elde edene kadar bunu tekrarlayın. Genellikle bir tabağa altı ila dokuz dilim yerleştirilir.

Tüm dilimler yerine oturduğunda, iki ila üç mikrolitre L 15, orta ila en erken yer kolajeni ekleyin ve tabağı kapatın. Kollajenin 20 dakika sertleşmesine izin verin. Kollajen sertleştikten sonra, en az bir saat boyunca% 5 karbondioksit ve 37 santigrat derece ile dengelenmiş iki mililitre dilim kültür ortamını dikkatlice ekleyin.

Kolajenin örtü kaymasından çıkmamasına özen gösterilmeli, 37 derece santigrat derece %5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirilmeli ve görüntülemeden önce en az üç saat dilimlerin toparlanmasına izin verilmelidir. Doku içindeki hücre davranışını uzun süreler boyunca yüksek zamansal ve mekansal çözünürlükte görüntülemek zordur. İyi sonuçlar elde etmek için optimal kültür koşullarının ve beyaz alan mikroskobunun kullanımının bir kombinasyonu gereklidir.

Dilimleri görüntülemek için bir meteoroloji istasyonu çevre odası ile donatılmış bir delta vision çekirdek geniş alan mikroskobu kullanılır. Mikroskop aşamasını %5 karbondioksit ve %95'te tutmak için bir karbondioksit perfüzyon aparatı ile hazne sürekli olarak 37 santigrat derecede tutulur, Hava görüntüleme normalde 40 kez 1.30 NA yağa daldırma lensi kullanılarak gerçekleştirilir ve görüntüler, CCD kamera adı verilen iki çekirdek çıtçıtlı HQ ile yakalanır, Z Bölümleri, her 1.5 mikronda bir 45 mikron doku maruziyeti ile yakalanır. Zaman mümkün olduğunca düşük tutulmalıdır, örneğin beş ila 50 milisaniye.

Söz konusu her bölüm için görüntüler her yedi dakikada bir yakalanır. Delta görüntü sistemleri kullanılarak dokuz dilime kadar ziyaret edilebilir. Burada gösterilen kesin nokta ziyaret fonksiyonu, iki günlük bir HH evre 12 embriyosundan alınan bir omurilik dilimi üzerinde GFP alfa Tubulin görüntülemesine başlanan bir yapı ile transfekte edilmiş bir omurilik progenitör hücresinin örnek bir hızlandırılmış dizisidir.

Bu erken aşamada, nöral progenitör hücreler, ağırlıklı olarak progenitör progenitör mod bölünmelerine uğrar ve bu sırada hücreler, iki başka döngüsel progenitör hücre oluşturmak üzere bölünür. Bu şekil, az önce gösterilen hızlandırılmış diziden seçilen kareleri gösterir. İki saat 20 dakikada hücre, apikal yüzeye dik olan bir bölünme düzlemi ile bölünür ve iki yavru hücre oluşturur.

Bu iki hücre 24 saat 23 dakika ve 25 saat 54 dakikada bir kez daha bölünür. Bu sonraki hızlandırılmış dizi, hücre zarını işaretleyen G-F-P-G-P-I ile transfekte edilmiş bir hücreye aittir. Bu hücre, bazal sürecin beyaz oklarla gösterilen ikiye bölündüğü ve yavru hücreler tarafından eşit olarak miras alındığı bir bölünmeye uğrar.

Bu hızlandırılmış diziden seçilen kareler, hücre bölünmesinin sıfır saat 49 dakikada gerçekleştiğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, omurilik dilimlerinin nasıl hazırlanacağı ve görüntüleneceği konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız. Unutmayın, bu teknikte yeniyseniz, bunun işe yaraması için hepsinin bir araya gelmesi gereken bir dizi teknik olarak zorlu adım olduğu için başlangıçta mücadele edebilirsiniz.